대한화상학회지 제 10 권 제 1 호 22 Journal of Korean Burn Society
Vol. 10, No. 1, 22-25, 2007
책임저자：김동철, 성남시 분당구 야탑동 351
463-712, 포천포중문의대 분당차병원 성형외과, 화상연구소
Tel: 031-780-5280, Fax: 031-780-5285 E-mail: [email protected] 이수만, 성남시 분당구 야탑동 222
463-836, 포천중문의대 분당캠퍼스 차중앙 연구소 Tel: 031-725-8372, Fax: 031-725-8398
E-mail: [email protected]
본 논문은 2005년 포천중문의대 대학 특성화사업 지원에 의해 연 구되었음.
지방조직 유래한 줄기세포에서 신경세포의 유도 분화
김동철ㆍ윤여진1ㆍ박수정1ㆍ정현석ㆍ박성욱ㆍ송재용ㆍ이수만1
포천중문의과대학교 분당차병원 성형외과학교실, 화상연구소, 1포천중문의과대학교 분당캠퍼스 차중앙연구소
Neural Cell Differentiation from Adipose Tissue Derived Stem Cells
Dong-Chul Kim, M.D. Ph.D., Yeo-jin Yoon, B.S.1, Soo-jeong Park, M.S.1, Hyun-Seok Jung, M.D., Sung-Wook Park, M.D., Jea-Yong Song, M.D. and Su-man Lee, Ph.D.1
Department of Plastic Surgery, Burn Research Institute, CHA General Hospital, College of Medicine, Pochon CHA University, 1Functional Genomics Lab, CHA Research Institute, Bundang Campus, College of Medicine, Pochon CHA University, Seongnam, Korea
Backgrounds: The adipose tissue compartment included several cell populations, like mesenchymal stem cells (MSCs). Recently, several publications have reported human adipose tissue derived stem cells (hADSCs) have a stem- ness to differentiate into adipogenic, osteogenic, chondro- genic, and myogenic cells in vitro in lineage-specific culture media. Also, hADSCs have the advantage of easily har- vested large numbers of cells from adipose tissue.
Methods: hADSCs were isolated density gradient centrifu- gation. To induce the neuronal differentiation, hADSCs were maintained in neurogenic condition (DMEM/5 mM β-mercap- toethanol). hADSCs were confirmed by reverse-transcription PCR for confirms of neural cells.
Results: hADSCs were easily isolated from human adipose tissue and expanded as a population of hADSCs like mesen- chymal stem cell though subculture for more than 8 pas- sages. hADSCs can differentiate into neural cell in vitro line- age-specific culture media. hADSC expressed neuron- spe- cific enolase (NSE).
Conclusions: Human adipose tissue derived stem cells is dif- ferentiated into neural cell in neurogenic condition (DMEM/5 mM β-mercaptoethanol). hADSCs like mesenchymal stem
cells isolated from adipose tissue, it might have a meso- dermal stem cell. Therefore adipose tissue derived stem cells will vital source for future cell-based such as tissue engineer- ing and regeneration as well as treatment of a variety of neu- rologic diseases. (Journal of Korean Burn Society 2007;
10:22-25)
Key Words: Adipose tissue, Human adipose tissue derived stem cells (hADSCs), Neural cell differentiation, Neuron-specif- ic enolase (NSE)
서 론
최근 줄기세포를 이용하여 손상된 조직이나 장기에 줄기 세포를 이식함으로써 더 이상 기능을 할 수 없는 조직이나 장기를 재생시키고자 하는 연구가 이루어지고 있다. 이에 따라 조직공학과 재생의학이 각광받고 있으며, 의학의 모 든 분야에서 줄기세포 연구에 관심을 기울이고 있다. 배아 줄기세포는 전능(totipotent)한 특성을 가지며 different germ layer로 분화 할 수 있어 조직 장기 재건에 많은 치료효과를 기대할 수 있다.1) 그러나 윤리적인 관점으로 인해 배아줄기 세포연구에는 많은 제약이 따르게 마련이며, 이에 여러 연 구가들이 성체줄기세포 가능성을 연구하여 조직 및 장기 의 remodeling을 추구하고 있다. 과거에는 한 조직에 있는 성체줄기세포는 오직 그 조직의 세포로만 분화한다고 알려 져 있었으나. 최근에는 골아세포,4,11) 근육세포,12,13) 지방세
포,2,11) 연골세포4,11) 등으로 분화될 수 있다는 연구결과가 보
고되고 있다.2-6) 그러나 아직까지도 배아줄기세포처럼 모든 조직의 세포로 분화 할 수 있는 전능한 특성을 가지는 것은 불가능하다고 보고 있다. 성체줄기세포를 치료에 이용할 경우, 환자 자신의 세포를 이용하여 치료하기 때문에 면역 거부반응이 적으며, 배아줄기세포에 비해 윤리적인 문제가 적다는 장점이 있지만, 소량으로 존재하기 때문에 분리하 기가 쉽지 않는 단점을 가지고 있다. Mizuno 등이 보고한 바에 의하면 지방조직에서 유래한 줄기세포(ADSCs)를 이 용하여 연골세포, 골모세포, 근육세포, 신경세포 등으로 분 화되어진다.7-9) 현재 이러한 분화시키는 기술이 국내외의
김동철 등：지방조직 유래한 줄기세포에서 신경세포의 유도 분화 23
Table 2. Polymerase Chain Reaction (PCR) Primers Used for Gene Expression Analysis Forward primer
Gene Size Cytogenetic band
Reverse primer
GAPDH 5'-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3' 230 bp 12p13
5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTG-3'
NSE 5'-CATGAGAATTGAGGAAGAGC-3' 148 bp 12p13
5'-TATCACAGATCAGGACAGCA -3' Table 1. Neurogenic Differentiation Induced by Media Supplementation
Medium Media Serum Supplementation
Control DMEM 10%FBS None
Pre-induction DMEM 20%FBS 1 mM β-mercaptoethanol
Neurogenic (NM) DMEM None 5 mM β-mercaptoethanol
기관에서 연구되고 있으며, 이를 이용한 재생의학의 임상 의 초기 단계에 있는 것으로 알려져 있다. 지방조직에서 유 래한 줄기세포의 가장 큰 잇점은 쉽게 얻을 수 있는 점과 환자의 고통이 따르지 않는다는 것이다. 이에 본 연구에서 는 비교적 쉽게 얻을 수 있는 지방조직을 이용하여 지방조 직에서 유래한 지방줄기세포를 연구하고, 그 결과를 관련 문헌 고찰과 함께 보고하고자 한다.
대상 및 방법
1. 재료
본 연구에 사용된 실험 재료는 동의서를 얻은 4명의 지방 조직으로부터 천자하였다. 배지로는 Dulbecco's modified Eagle media (DMEM), Feta bovine serum (FBS), Anti- biotic-Antimycotic, β-mercaptoethanol을 사용하였다.
2. 방법
1) 사람 지방조직에서 유래한 줄기세포의 분리 지방조직을 무균의 조작으로 밀도구 배원심분리(density gradient centrifugation) 방법으로 지방조직에서 유래한 줄 기세포를 분리하였다. 간단히 설명하면 채취한 지방조직을 가위로 잘게 자르고 PBS로 국부마취제와 적혈구 등을 제거 하기 위해 washing한 후 제거한다. Extracellular matrix는 37oC에서 30 min 동안 0.075% collagenase 처리하여 cel- lular fraction을 풀어준 다음, 0.075% collagenase를 중화하 기 위해서 동일한 양의 10% FBS가 포함된 DMEM배지에 넣는다. 1,200×g에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 걷어낸 후, 다시 한 번 반복한다. 수획된 pellet을 10% FBS와 1%AA가 포함된 DMEM에 넣은 후 37oC/5% CO2에서 배
양했다. Overnight 후에 residual nonadhesent red blood cells를 제거하기 위해서 PBS를 넣어 washing한다. 5×106 plate에 배지와 함께 넣은 후 37oC/5% CO2에서 배양했으 며, 4∼5일에 한 번씩 새로운 배지를 갈아주고 12∼14일에 계대 배양하였다.
2) 분화 조건
지방조직에서 유래한 줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위해서 3th passage까지 배양한 후 0.5 mm EDTA/ 0.05%
trypsin (Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 소화시키고 1,200 rpm으로 5분간 원심분리 하여 신경유도배양액(Pre-in- duction media: DMEM/20%FBS, 1 mM β-mercapto ethanol) 배지에서 하루 동안 배양하였다. 그 후 신경유도배 양액(neurogenic media: DMEM/none serum, 5 mM β- mercaptoethanol) 배지에서 배양하여 신경세포 분화를 관 찰하였다(Table 1).
3) 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)
신경유도배양액배지에서 배양한 세포로부터 manu- facture (Aiagen, Valencia, CA)에 따라QIAGEN RNA- Minikits를 사용하여 전체 RNA을 추출하였다. 추출한 RNA을 가지고 cDNA합성을 위해 reverse-transcriptase (Maxime RT PreMix Kit, iNtRON Biotechnology, Korea) 사용하였다. 간단히 설명하면, Maxime RT PreMix (Oligo dT Primer) tube에 추출한 전체RNA을 0.1∼1μg 농도와 전체 볼륨이 20μl이 될 때까지 Distilled Water을 넣는다.
혼합된 산물을 가지고 cDNA합성을 위해 PCR 기기를 사용 하여 45oC에서 1시간, RT inactivation step을 위해 95℃에 서 5분간 실행하였다.
4) Polymerase chain reaction (PCR)
역전사로 합성한 cDNA 50 ng, 10×PCR 완충액 2.5μl,
24 대한화상학회지 Vol. 10, No. 1, 2007
Fig. 1. Morphology of human adipose tissue stem cell (hATSC) were grown under control conditions in DMEM/10% FBS as a fibroblast and spindle-shaped cells (inverted microscope, ×200).
Fig. 2. Differentiation of hATSC derived from human adipose tissue. Cells were assumed neur- onal morphological traits. Mor- phology of hATSC grown under pre-induction condition (DMEM/
20%FBS/1 mM β-mercaptoetha- nol) (A) and Neurogenic condi- tion (DMEM/5 mM β-mercapto- ethanol) (B).
Fig. 3. RT-PCR analysis of human adipose tissue derived stem cells using NSE primers. GAPDH was used as a control. U:
uninduced, I: induced.
sense 시발체 (10 pmol) 1μl, antisense 시발체 (10 pmol) 1μl, dNTP (2.5 mM) 2μl, 1U Taq polymerase (i-TaqTM DNA polymerase; INTRON, Korea)을 포함하여 25μl의 혼합물을 만들어 PCR을 시행하였다. House keeping 유전자 인 GAPDH는 mRNA의 적합성 여부를 판단하기 위하여 측 정하였다. 각각의 시발체는 Table 2과 같다. 각각의 유전자 의 증폭은 95oC에서 30초, 53oC 30초, 72oC에서 30초의 조 건으로 40회 시행하였다. 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel 에 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 관찰하였다.
결 과
1. 사람 지방으로부터 유래한 줄기세포(human adi- pose tissue derived stem cells, ADSCs)의 분리 지방 공여자는 모두 4명으로 남자 1명, 여자 3명이었으며, 각각 얻은 지방의 양은 10 g, 0.28 g, 1.06 g, 0.65 g이었다.
지방의 양이 작은 경우의 세포는 세포의 양이 너무 적아 잘 자라지 않았으며(범위: 1∼3.2×104), 지방 10 g 경우에 분 리되는 세포 수는 1.2×105이었다. 이를 배양접시에 접종하
여 2주일 배양 후 접시에 부착하여 자라는 세포를 ADSCs 라고 간주 하였을 때 8th passage 결과 지방 10 g당 분리되 는 ADSCs는 평균 105 (범위: 1.02∼1.67×105, 대략 70%
confluence)이었다. 그리고, ADSCs는 fibroblast같은 mor- phology을 나타내었다(Fig. 1).
2. 신경세포로의 분화
3th passage까지 배양한 fibroblast 같은 세포를 가지고 신경유도배양액에서 이틀 동안 배지에서 배양한 결과 섬유 의 끝은 가지가 나누어지고 주머니 모양으로 부풀어 있었 다(Fig. 2).
3. RT-PCR
신경유도배양액에서 유도된 세포와 유도하지 않은 세포 들을 모아 RT-PCR의해 mRNA 발현을 확인한 결과 Fig. 3 에서처럼 유도한 세포에서만 neuron-specific enolase (NSE) 발현을 확인하였다. 이 유전자는 mature neuron과 neur- onal origin 세포에서 발현 되며, 그 결과 우리가 지방조직 에서 얻은 세포들이 줄기세포라고 추정할 수 있었다.
고 찰
손상된 조직이나 장기에 줄기세포를 이식함으로써 더 이상 기능을 할 수 없는 조직이나 장기를 재생시키고자 의학의
김동철 등：지방조직 유래한 줄기세포에서 신경세포의 유도 분화 25
모든 분야에서 줄기세포 연구가 활발히 진행되고 있으며, 골수 뿐만 아니라 제대혈, 지방조직에서 중간엽 줄기세포 를 분리하여 조직공학과 재생의학에 사용하려는 시도가 있다.
하지만 아직까지 줄기세포에 대한 기초 및 임상연구는 미흡한 점이 많고 치료에 이용하기까지는 불확실한 것이 많다.
지방조직에서 유래한 줄기세포(ADSCs)는 연골세포, 골 모세포, 근육세포, 신경세포 등으로의 분화능을 가지는 것 으로 보고되었으며,7-9) 지방조직에서 분리한 줄기세포와 골 수에서 유래한 줄기세포는 세포막단백질의 발현양상이 유 사한 특성을 가진 것으로 보고되었다.10)
본 연구에서는 인체에서 비교적 쉽게 많은 양을 얻을 수 있는 지방조직을 이용하여 중간엽 줄기세포를 분리하였으 며, 분리한 세포가 줄기세포인지 확인하기 위해서 marker NSE로 발현 여부를 확인하였다. 기존에 있는 보고된 실험 방법보다 간단하여 시간을 줄일 수 있는 장점이 있었다. 그 러나 지방세포에서 지방줄기세포의 수가 적게 분리되는 단 점이 있지만, 지방세포는 비교적 많은 양을 쉽게 얻을 수 있기 때문에 그리 크게 문제가 되지 않는다고 생각한다. 즉 인체지방조직은 조직획득 용이성과, 다량획득가능성, 골수에 서 분리하는 것에 비해 고통이 따르지 않는다는 점으로 조직 공학의 재생수단으로 빈번하게 이용될 수 있을 거라 생각된다.
현재 보고된 바에 따르면 지방에서 줄기세포를 얻는 것 뿐만 아니라 간 줄기세포, 장 줄기세포, 췌장 줄기세포가 존 재 한다는 논문들이 보고되고 있으며, 장 줄기세포는 손상 조직을 재생하는 능력이 있음을 확인 된 바 있다.11,12) 동물 실험에서는 골수에서 유래한 줄기세포를 뇌허혈동물에 이 식하여 확인한 결과 뇌기능의 회복이 촉진되고,13) 세포를 혈관에 주입하였을 때도 동일한 효과가 나타남이 보고되었 으며,14) 지방조직에서 분리한 줄기세포를 방광재생을 위해 이식한 결과 효과가 있다고 보고되었다.15) 이에 따라 지방 에서 분리한 줄기세포도 골수에서 유래한 줄기세포와 유사 한 능력을 가진다고 보이며, 이에 대해서 향후 in vivo 및 in vitro 연구가 필요하다고 생각한다. 본 연구에서는 충분 한 지방줄기세포를 확보하는 방법론은 아니나, 우리가 분 리한 세포가 지방줄기세포라고 추정되며, 이에 따라 비교 적 쉽게 대량으로 얻을 수 있는 지방으로부터 줄기세포를 분리 및 분화시켜 퇴행성 질환이나 장기부전, 조직 손상, 화 상치료 및 재건 등에 대한 임상적 치료를 위해서는 동물 실험 및 임상실험 등, 향후 추가 연구가 지속적으로 이루어 져야 할 것이다.
결 론
사람 지방조직에서 분리한 hADSCs을 배양하여 신경유
도배양액에서 신경세포로 분화하였다. 이는 지방조직에 줄 기세포가 존재함을 시사하며, 세포치료에서 원천으로 사용 될 수 있음을 말해준다. 앞으로 지방줄기세포 유래한 신경 세포를 사용한 세포치료를 임상에 적용하기 위해서는 세포 의 성장과 분화 유도, 이식 후 재생능력 등에 대한 심층적 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
REFERENCES
1) Grompe M. Adult versus embryonic stem cells: it's still a tie.
Mol Ther 6: 303-305, 2002
2) Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9: 641-650, 1991
3) Wakitani S, Saito T, and Caplan AI. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve 18: 1417-1426, 1995
4) Yoo JU, Barthel TS, Nishimura K, et al. The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells. J Bone Joint Surg Am 80: 1745-1757, 1998 5) Beresford JN, Bennett JH, Devlin C, Leboy PS, Owen ME.
Evidence for an inverse relationship between the diffe- rentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures. J Cell Sci 102 (Pt 2): 341-351, 1992 6) Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147, 1999
7) Mizuno H, and Hyakusoku H. Mesengenic potential and future clinical perspective of human processed lipoaspirate cells. J Nippon Med Sch 70: 300-306, 2003
8) Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 13: 4279- 4295, 2002
9) Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.
Tissue Eng 7: 211-228, 2001
10) Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble JM. Surface protein characterization of human adi- pose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol 189: 54-63, 2001 11) Bach SP, Renehan AG, Potten CS. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis 21: 469-476, 2000 12) Bonner-Weir S, Sharma A. Pancreatic stem cells. J Pathol 197:
519-526, 2002
13) Chen J, Li Y, Chopp M. Intracerebral transplantation of bone marrow with BDNF after MCAo in rat. Neuropharmacology 39: 711-716, 2000
14) Chen J, Li Y, Wang L, et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke 32: 1005-1011, 2001
15) Jack GS, Almeida FG, Zhang R, Alfonso ZC, Zuk PA, Rodriguez LV. Processed lipoaspirate cells for tissue engi- neering of the lower urinary tract: implications for the treat- ment of stress urinary incontinence and bladder recon- struction. J Urol 174: 2041-2045, 2005
