방광암에서 Magnolia officinalis 추출물의 항암효과
Anticancer Effect of Magnolia officinalis' Extract on N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosamine Induced Bladder Cancer in Mice
Seung-Chan Lee, Pildu Jung, Yong-June Kim, Seok Joong Yun, Sang-Cheol Lee, Wun-Jae Kim
From the Department of Urology, Chungbuk National University College of Medicine, Cheongju, Korea
Purpose: Magnolia officinalis has been used in traditional Chinese medicine to treat a variety of diseases. The main constituents of Magnolia officinalis are honokiol and magnolol, which have a variety of pharmacological effects, such as antitumor, antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory etc. This study examined the anticancer effect of a Magnolia officinalis' extract on urinary bladder cancer in vivo.
Materials and Methods: Male mice C3H/He were used as the experimental animals. The mice were divided into ten groups. Normal drinking water was provided to group 1 (5 mice) for 20 weeks and 0.05% N-butyl- N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN) was added to in the drinking water of group 2 (5 mice). 0.1, 0.3, 1.0 and 3.0% Magnolia officinalis' extract was added to groups 3, 4, 5 and 6, respectively (5 mice each), and 0.1, 0.3, 1.0 and 3.0% Magnolia officinalis' extract plus 0.05% BBN was added to groups 7, 8, 9 and 10, respectively (10 mice each) for the same period.
All surviving mice were sacrificed at week 20 to investigate the occurrence of bladder cancer, stage and grade.
Results: Bladder cancer was not observed in groups 1, 3, 4, 5 and 6 mice.
The rates of bladder cancer occurrence were 57.1, 66.7, 44.4 and 20.0%
in groups 7, 8, 9 and 10, respectively. The incidence decreased with increasing concentration of Magnolia officinalis (p=0.005). However, the stage and grade were not associated with the concentration of Magnolia officinalis (each p＞0.05).
Conclusions: This study showed that Magnolia officinalis has some protective effect against bladder cancer. In the future, Magnolia officinalis may be expected to play an important role as a chemo-preventive and therapeutic agent or as a complementary agent in bladder cancer. (Korean J Urol 2008;49:682-687)
Key Words: Magnolia officinalis, Bladder cancer, N-butyl-N-(4-hydroxy- butyl) nitrosamine
대한비뇨기과학회지 제 49 권 제 8 호 2008
충북대학교 의과대학 비뇨기과학교실
이승찬ㆍ정필두ㆍ김용준 윤석중ㆍ이상철ㆍ김원재
접수일자：2008년 4월 7일 채택일자：2008년 6월 26일
교신저자: 김원재
충북대학교 의과대학 비뇨기과학교실
충북 청주시 흥덕구 개신동 산 62번지
360-763
TEL: 043-269-6371 FAX: 043-269-6129 Email: wjkim@
chungbuk.ac.kr 본 연구는 보건복지부 보건의료기술진흥사 업 (A040032)의 지원과 산업자원부 지역 산업기술개발사업 ( 중점기술개발사업 10017542)의 지원에 의하여 이루어진 것 임.
서 론
현재 암환자들의 대체보완요법에 대한 관심은 계속 높아 지고 있으며 이러한 대체요법에 대한 관심의 증가는 기존 항암치료에 대한 환자들의 우려와 거부감 때문일 것이다.
따라서 과학적으로 치료효과가 입증되고, 복용이 간편하며 부작용이 적은 대체보완요법이 있다면 암환자 치료에 이상 적일 것이다.
Magnolia officinalis는 당후박나무로 불리며 목련과에 속 하는 식물이다. Magnolia officinalis는 다양한 약리학적 활성 을 가지고 있어 전통 중국한의학에서 널리 사용되어왔다.1-5
Fig. 1. Experimental protocol for the effect of Magnolia officinalis. BBN:
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosa- mine.
Magnolia officinalis의 주성분은 honokiol과 magnolol로 다양 한 약리학적 작용을 나타내는데 항암, 항산화, 항균, 항알레 르기, 항진균, 항염증, 항혈전 작용 등이 있는 것으로 알려 져 있다.1-5 Magnolia officinalis는 caspase family, Bax, bcl-2 등의 조절을 통해 세포고사 (apoptosis)를 유발하고 vascular endothelial growth factor (VEGF)와 matrix metalloproteinases (MMPs) 등을 억제하여 항암효과를 나타내는 것으로 보고 되었다.1-9 그러나 Magnolia officinalis의 항암작용에 대한 연 구는 대장암, 간암, 다발성 골수종, 폐암 등에서 이루어져왔 지만,5-9 아직 방광암에서의 연구는 이루어지지 않았다.
Druckrey 등10이 N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN)을 쥐에게 경구투여하여 방광암을 유발시킨 이래 이 를 이용한 실험적 방광암 연구가 많이 이루어져왔다. 본 연 구는 BBN으로 유발된 쥐의 방광암을 이용하여 Magnolia officianlis 추출물이 방광암에 대한 항암효과가 있는지를 조 사하였다.
대상 및 방법 1. 실험동물
본 실험에는 생후 6주된 수컷 쥐 C3H/He를 사용하였으며 실험시작 시 체중이 22-24g의 쥐만을 선별하여 실험을 시작하 였다. 사육상자는 Millennium-SPF Rack System Cage (W279x D220xH155mm)를 사용하였으며 한 cage 당 5마리씩 수용하 였다. 시험기간 중 사육상자는 시험번호 및 동물번호를 기 입한 라벨지를 붙여 식별하였다. 사료는 방사선 (25KGy, Harlan) 멸균된 실험동물용 고형사료 (폴라스인터내셔날,
서울, 한국)를 사용하였으며 자유섭취 시켰다. 음용수는 정 수기로 정수한 물을 사용하였으며 자유롭게 섭취하도록 하 였다. 환경적응을 위해 실험 1주일 전부터 동일한 조건하에 서 미리 사육시켜 실험은 7주령에 시작되었다.
2. 발암제
발암제인 BBN은 Tokyo Kaei Kogyo (Tokyo, Japan)사 제 품을 사용하였다. BBN은 햇빛에 장기간 노출 시 폭발의 위 험성이 있으므로 냉장 및 차광보관을 하였다. 일정량의 BBN을 TWEEN 20으로 용해시킨 후 음용수와 혼합하여 0.05% BBN으로 조제하여 자유로이 먹게 하였다. 발암제 투 여기간 중에는 별도의 수분은 공급하지 않았다.
3. Magnolia officinalis (M. officinalis) 추출물
Magnolia officinalis (100g)를 공기 중에서 건조시키고 가 루로 분쇄한 뒤 증류수 (500ml)에 녹이고 100oC에서 30분간 가열 후 실온에서 방치하였다. 실온까지 식힌 액상추출물 을 회전식 건조기로 농축 후 동결건조하여 이를 음용수에 용해시켰다.
4. 사육환경
본 실험은 온도 23±3oC, 상대습도 50±10%, 조명시간 12 시간 (오전 8시-저녁 8시), 환기 속도 0.2-0.3m/sec, 그리고 조 도 150-300Lux로 설정된 동물실험실에서 사육하였다. 실험 자는 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다. 시험기간 중 동물실의 온도, 습도, 조도는 Millennium-SPF Rack System (바이오제노믹스, 서울, 한국)
Table 1. The stage and grade of the bladder cancers in each group treated with 0.05% BBN and Magnolia officinalis
No. BBN BBN＋
0.1% Mag
BBN＋
0.3% Mag
BBN＋
1.0% Mag
BBN＋
3.0% Mag 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
T1 G2 T2 G2 T3 G3 T3 G3 T3 G3
No tumor No tumor No tumor T1 G2 T1 G3 T3 G3 T3 G2
No tumor No tumor T1 G2 T3 G2 T3 G2 T3 G2
No tumor No tumor No tumor No tumor No tumor T1 G2 T1 G3 T2 G2 T3 G3
No tumor No tumor No tumor No tumor No tumor No tumor No tumor No tumor T1 G3 T3 G3 BBN: N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine, Mag: Magnolia
Fig. 2. Gross findings of the urinary bladder in the mice. (A) The inflated bladder by formalin in mice treated with normal drinking water or Magnolia officinalis. (B) The inflated bladder by formalin in mice treated with BBN and Magnolia officinalis. BBN: N-butyl- 조절 장치 및 조도 조절장치에 의해 조절되었으며 실험에
영향을 미칠 것으로 생각되는 환경조건의 변동은 없었다.
5. 실험
실험동물은 총 70마리로, 10군으로 분류하였다. 제1군 (5 마리)은 실험기간 20주 동안 식수로 일반 음용수만을 공급 하였고 제2군 (5마리)은 20주 동안 0.05% BBN을 음용수로 공급하였다. 제3-6군 (각 5마리)은 20주 동안 0.1%, 0.3%, 1% 및 3%의 Magnolia officinalis를 음용수로 공급하였다. 제 7-10군 (각 10마리)은 동결건조된 Magnolia officinalis를 0.05%
BBN에 용해시켜 Magnolia officinalis가 0.1, 0.3, 1.0 및 3.0%
의 농도가 되도록 만든 음용수를 먹게 하였다 (Fig. 1). 모든 음용수통은 호일로 감아 빛을 차단하였으며 2일마다 새로 조제한 음용수로 바꿔주었다. 실험기간동안 음식 및 수분 섭취량을 기록하였으며 1주마다 체중을 측정하였다.
6. 조직처리
실험기간 20주 후 ether를 이용하여 모든 실험동물을 전 신 마취한 후 정중부 절개를 실시하였다. 전 군에서 방광을 제외한 다른 장기에 이상 소견은 관찰되지 않았다. 방광 경 부에 26G Gelco needle을 삽입한 후 10% 포르말린 용액을 0.2ml 주입하여 방광을 팽만 시킨 후 방광 경부를 3-0 silk로 묶은 후 방광을 결찰하였다.
포르말린에 고정된 방광 조직을 파라핀 블록으로 만든 후 deparaffinization 및 탈수 과정을 거친 후 통상적인 H&E 염색을 시행하였다. 방광암의 발생 유무, 병기 및 분화도는 병리학자와 함께 3인이 동시에 관찰하였다.
7. 통계처리
각 군 간의 방광암 발생률 및 병기, 분화도는 선형대 선형 결합법을 사용하여 비교하였다. 통계프로그램은 SPSS 12.0 프로그램을 이용하였고, p값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
동일한 사육조건으로 사육하였으며 실험기간 동안 각 군 별로 0.05% BBN과 0.1% Magnolia officinalis를 같이 투여한 군 3마리, 0.05% BBN과 0.3% Magnolia officinalis를 같이 투 여한 군 4마리, 0.05% BBN과 1.0% Magnolia officinalis를 같 이 투여한 군 1마리가 사망하였다.
각 군에서의 방광암의 발생 유무, 병기 및 분화도는 Table 1에
Fig. 3. Microscopic findings of BBN induced bladder cancer in the mice. Group 1 (saline) urinary bladder has a normal appearance. Group 2 (BBN) bladder cancer shows a massive infiltrative growth pattern out of the bladder wall. Group 7, 8, 9 and 10 show that the BBN induced bladder cancer decreased with increasing concentration of Magnolia officinalis. BBN: N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine.
도식화하였으며 육안적 소견과 조직학적 소견은 각각 Fig.
2와 3에 정리하였다. 0.05% BBN을 투여한 군에서는 모든 실험동물에서 방광암이 관찰되었으며 한 마리만이 표재성 이었고 나머지 네 마리는 침윤성방광암이었다. 정상 대조 군 및 농도에 따른 Magnolia officinalis만 투여한 군에서는 방광암이 발생하지 않았으며 병리 소견 상 차이가 없었다.
0.1% Magnolia officinalis와 BBN을 동시에 투여한 제7군에 서는 생존한 7마리 중 4마리에서 방광암이 발생하였고 두 마리만이 침윤성방광암이었다. 0.3% Magnolia officinalis와 BBN을 동시에 투여한 제8군에서는 생존한 6마리 중 4마리 에서 방광암이 발생하였고 3마리가 침윤성이었다. 1.0%
Magnolia officinalis와 BBN을 투여한 제9군에서는 생존한 9 마리 중 4마리에서 종양이 발생하였고 2마리만이 침윤성이 었다. 가장 높은 농도의 3% Magnolia officinalis와 BBN을 투 여한 제10군에서는 10마리 모두 생존하였으며 2마리만이 종양이 발생하였고 한 마리는 표재성, 한 마리는 침윤성방 광암이었다. Magnolia officinalis의 농도가 증가함에 따라 방 광암의 발생 빈도 (p=0.005)뿐 아니라 크기도 줄어드는 등 방광암 발생을 억제하는 효과를 보였다. 그러나 병기와 분 화도는 Magnolia officinalis 용량 증가와 무관하였다 (각각 p＞0.05).
고 찰
암환자에 있어서 식이, 생약, 약초, 침술 등의 대체보완요
법은 과거뿐 아니라 현재에도 큰 관심의 대상이다. 이는 항 암치료의 부작용에 대한 암환자들의 우려와 거부감의 결과 라 생각하며 대체보완요법에 대한 환자들의 막연한 믿음과 절박한 심정이 부합한 결과라 생각한다. 표재성 및 진행성 방광암 환자의 치료에 있어 침습적 방법을 피하고 약제 자 체의 부작용이나 합병증이 없는 치료법이 있다면 가장 이 상적이고 합리적인 방법일 것이다. Kim 등11의 보고에 따르 면 비뇨기종양 환자들의 대체보완요법의 이용률은 39.2%
로 외국과 비슷한 수준이며 높은 인터넷 보급으로 보아 향 후 더 증가될 것으로 보고 있다. 이 조사에 따르면 암환자들 이 가장 선호하는 대체보완요법은 식이요법으로 음식이 암 환자들의 질환관리에 가장 큰 영향을 주는 것으로 보고하 였다. 그 외 약초나 생약, 뜸, 부황, 침 등이 조사되었다. 이 렇게 암환자들은 대체보완요법에 큰 관심과 기대를 걸고 있는 것에 반해, 많은 의사들은 종양과 관련된 대체보완요 법에 관한 정보가 부족하고 과학적으로 증명되지 않았다고 생각하기 때문에 대체보완요법에 대한 태도가 명확하지 않 다. 하지만 대체보완요법이 종양에 대한 효과가 과학적으 로 입증된다면 환자와 의사를 모두 만족시키는 치료로 그 정당성을 확보하게 될 것이다.
Magnolia officinalis는 전통 중국의학에서 널리 사용되는 약제로서 목련과에 속하는 식물이다. 최근 Magnolia offici- nalis는 세포고사와 혈관신생의 억제 그리고 matrix metallo- proteinase 억제를 통해 암의 성장 및 전이를 억제하는 것으 로 밝혀지고 있다.1-9 이는 또한 인체에 미치는 약물부작용
도 거의 없는 것으로 알려져12 매우 안전하게 환자들에게 투여가 가능하다.
종양은 종양세포의 과도증식과 세포고사의 장애상태라 고 표현할 수 있다. 세포고사의 조절은 세포고사 유도인자 와 억제인자의 균형을 통해 이루어진다. Bax는 세포고사 유 도인자로, bcl-2는 세포고사 억제인자로 알려져 있으며 caspase family가 세포고사 과정에 중심적 역할을 하는 것으 로 알려져 있다. Battle 등8은 B세포 만성임파성백혈병 세포 주 (B-cell chronic lymphocytic leukemia cells; B-CLL)에서 Magnolia officinalis의 주성분인 honokiol이 Bax의 상향조절 을 유발하여 B-CLL 세포의 고사를 유발한다고 하였다. 또 Wang 등6은 PKO (human colorectal cell line)에서 honokiol이 p53 비의존성 경로를 통해 caspase를 활성화하여 세포고사 를 유도한다고 보고하였다. Bai 등9은 인간 혈관내피세포를 이용한 연구에서 honokiol이 VEGF의 인산화 과정을 억제하 여 혈관신생을 억제하며 in vitro 실험에서 혈관신생억제와 종양성장억제 효과를 확인하였다. Nuclear factor-kappa B (NF-κB)는 종양의 성장, 혈관신생, 전이를 촉진하는 것으 로 알려져 있는데 Tse 등4은 honokiol이 IκB (inhibitor sub- unit of NF-κB)의 kinase인 IKK (IκB kinase)를 불활성화시 켜 NF-κB를 억제한다고 하였으며 이를 honokiol의 항암작 용의 하나로 제시하였다. Nagase 등13은 honokiol과 magnolol 이 human fibrosarcoma HT-1080에서 종양의 진행과 전이에 관련된 matrix metalloproteinase-9를 억제하는 효과가 있다고 하였다.
그동안 Magnolia officinalis의 항암효과에 대한 연구는 백 혈병, 다발성 골수종, 폐암, 직장암, 간암 등에서 연구되어 왔지만 방광암에서의 효과는 아직 연구가 이루어지지 않았 다. BBN은 설치류와 개에서 요로상피에만 특이하게 발암 제로 작용하며 타 장기에는 종양을 유발하지 않는 것으로 알려져 있다.14 백서에서는 방광에서 뿐 아니라 신우와 요관 에서도 요로상피암이 발생하는데 조직학적으로 인체에서 관찰되는 것과 비슷한 종양이 발생한다.15 백서에서 발생하 는 종양은 분화도가 비교적 좋으며 다발성 표재성방광암이 대부분인 반면 생쥐 (mice)에서 발생하는 종양은 분화도가 나쁜 비유두상의 침윤성종양이 주로 발생한다.16 이러한 BBN 유도 방광암 모델을 근거로 Magnolia officinalis의 항 암효과를 연구하였다.
먼저 Magnolia officinalis의 방광암발생억제효과를 살펴 보면, 0.05% BBN만을 투여한 제2군에서는 5마리 모두에서 이행세포암이 발생하였으나 0.05% BBN과 Magnolia offici- nalis를 투여한 제7-10군에서는 Magnolia officinalis의 투여 용량이 증가할수록 방광암이 발생하지 않는 개체수가 늘어
10마리 중 8마리에서 이행세포암이 발생하지 않아 가장 뛰 어난 억제효과를 나타냈다.
방광암 발생 억제효과와는 달리 Magnolia officinalis는 병 기 및 분화도를 낮추는 효과를 보이지는 않았다. 그러나 이 는 방광암에 대한 억제효과가 뛰어나 상대적으로 방광암이 발생한 개체수가 적어 유의한 차이를 보이지 않은 것이라 생각하며 더 많은 수의 실험동물을 사용한다면 이에 대한 억제효과도 확인할 수 있을 것으로 생각한다.
본 연구는 Magnolia officinalis가 쥐의 방광암에서도 항암 효과가 있음을 확인하였다. 향후 인체 방광암에 대한 연구 를 통해 임상적 사용의 정당성을 확보하여야 할 것이며 만 약 인체 방광암에서도 항암효과가 입증된다면 방광암 치료 에 있어 기존의 항암치료를 대체 또는 병용하여 부작용은 감소시키고 효과는 극대화시키는 치료법으로 자리 잡을 수 있을 것이다.
결 론
본 연구에서 Magnolia officinalis의 방광암 성장억제효과 를 관찰하였을 뿐 아니라 방광암 발생도 억제하는 효과가 있는 것으로 생각한다. 향후 방광암 치료 및 예방에 있어 Magnolia officinalis 단독, 또는 보완요법으로서의 역할을 기 대해 본다.
REFERENCES
1. Liou KT, Shen YC, Chen CF, Taso CM, Tasi SK. The anti- inflammatory effect of honokiol on neutrophils: mechanisms in the inhibition of reactive oxygen species production. Eur J Pharmacol 2003;475:19-27
2. Teng CM, Chen CC, Ko FN, Lee LG, Huang TF, Chen YP, et al. Two antiplatelet agents from Magnolia officinalis.
Thromb Res 1988;50:757-65
3. Lo YC, Teng CM, Chen CF, Chen CC, Hong CY. Magnolol and honokiol isolated from Magnolia officinalis protect rat heart mitochondria against lipid peroxidation. Biochem Pharmacol 1994;47:549-53
4. Tse AK, Wan CK, Shen XL, Yang M, Fong WF. Honokiol inhibits TNF-alpha-stimulated NF-kappaB activation and NF- kappaB-regulated gene expression through suppression of IKK activation. Biochem Pharmacol 2005;70:1443-57
5. Fong WF, Tse AK, Poon KH, Wang C. Magnolol and honokiol enhance HL-60 lhuman leukemia cell differentiation induced by 1,25-dihydroxyviamin D3 and retinoic acid. Int J Biochem Cell Biol 2005;37:427-41
6. Wang T, Chen F, Chen Z, Wu YF, Xu XL, Zheng S, et al.
in human colorectal cell line RKO. World J Gastroenterol 2004;10:2205-8
7. Park EJ, Zhao YZ, Kim YH, Lee BH, Sohn DH. Honokiol induces apoptosis via cytochrome c release and caspase acti- vation in activated rat hepatic stellate cell in vitro. Planta Med 2005;71:82-4
8. Battle TE, Arbiser J, Frank DA. The natural product honokiol induces caspase-dependent apoptosis in B-cell chronic lympho- cytic leukemia (B-CLL) cells. Blood 2005;106:690-7 9. Bai X, Cerimele F, Ushio-Fukai M, Waqas M, Campbell PM,
Govindarajan B, et al. Honokiol, a small molecular weight natural product, inhibits angiogenesis in vitro and tumor growth in vivo. J Biol Chem 2003;278:35501-7
10. Druckrey H, Preussman R, Ivanokovic S, Schmidt CH, Mennel HD, Stahl KW. Selective induction of bladder cancer in rats by dibutyl-and-N-butyl-N-butanol(4)-nitrosamine. Z Krebsforsch 1964;66:280-90
11. Kim CS, Park S, Lee SB, Lee JM, Chung H, Chung MK, et al. The use of complementary and alternative medicine in patients with a urological malignancy. Korean J Urol 2006;47:
620-4
12. Kalman DS, Feldman S, Feldman R, Schwartz HI, Krieger DR, Garrison R. Effect of a proprietary Magnolia and Phellodendron extract on stress levels in healthy women: a pilot, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Nutr J 2008;7:11
13. Nagase H, Ikeda K, Sakai Y. Inhibitory effect of magnolol and honokiol from Magnolia obovata on human fibrosarcoma HT-1080. Invasiveness in vitro. Planta Med 2001;67:705-8 14. Kim YK. Bladder cancer: basic research direction. 1st ed.
Seoul: Korea Medical Publishing Co; 1991;208-46
15. Ito N, Makiura S, Yokota Y, Kamamoto Y, Hiasa Y. Effect of unilateral ureter ligation on development of tumors in the urinary system of rats treated with N-butyl-N-(4-hydroxy butyl) nitrosamine. Gann 1971;62:359-65
16. Becci P, Thompson HJ, Strum JM, Brown CC, Sporn MB, Moon RC. N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine-induced urinary bladder cancer in C57 BL/6 X DBA/2 F1 mice as a useful model for study of chemoprevention of cancer with retinoids. Cancer Res 1981;41:927-32
