225 책임저자：김영민, 305-811, 대전시 유성구 전민동 461-6
한남대학교 생명나노과학대학 생명과학과 Tel: 042-629-8753, Fax: 042-629-8751 E-mail: [email protected]
접수일：2009년 8월 31일, 게재승인일：2009년 9월 11일
Correspondence to：Young-Min Kim
Department of Biological Sciences, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University, 461-6, Jeonmin-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-811, Korea
Tel: ＋82-42-629-8753, Fax: ＋82-42-629-8751 E-mail: [email protected]
HT-29 대장암세포에서 Curcumin과 H2O2의 병행처리에 의한 AMP-Activated Protein Kinase
활성과 Apoptosis 유도에 관한 연구
한남대학교 생명나노과학대학 1생명과학과, 2국립암센터 기초 과학 발염연구원 지원 센터,
한남대학교 생명나노과학대학 3식품영양학과
김윤이1ㆍ황수경2ㆍ박송이1ㆍ이윤경3ㆍ박옥진3ㆍ김영민1
Curcumin and H
2O
2Induce Apoptosis by Activating AMP-Activated Protein Kinase in HT-29 Colon Cancer Cells
Yun-I Kim1, Su-Kyoung Hwang2, Song Yi Park1, Yun-Kyoung Lee3, Ock Jin Park3 and Young-Min Kim1
1Department of Biological Sciences, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University,
2Basic Science/carcinogenesis Branch National Cancer Center, 3Department of Food and Nutrition, Hannam University, Daejeon 305-811, Korea
Curcumin, curcuma longa, has been known to exert anti-oxidant effects or anti-inflammatory effects as phytochemical. Also it induces apoptosis in the colon cancer cells and inhibits an angiogenesis of tumor.
AMP-activated protein kinase (AMPK) is activated by ATP depletion status such as heat shock, exercise, hypoxia, reactive oxygen species (ROS). Recent studies indicate that AMPK activation strongly suppresses cell proliferation and induces apoptosis in cancer cells. Hence, AMPK plays a critical role as a key signal in prevention of cancer and obesity. In this study, curcumin generated ROS in HT-29 colon cancer cell lines and this ROS seemed to be closely related to an increase in AMPK activation. ROS generated by phytochemical is one of the responsible elements for the activation of AMPK. We hypothesized that combined treatment of H2O2 and curcumin more stronglyactivated AMPK and this effect was abolished by AMPK inhibitor Compound C in HT-29 cells. Our results suggest that combined treatment of H2O2
and curcumin is an effective way in controlling cancer proliferation and apoptosis. Also, the synergistic effect of H2O2 and curcumin were shown to potent a chemotherapy in colon cancer cells. (Cancer Prev Res 14, 225-232, 2009)
Key Words: Curcumin, ROS, AMPK, H2O2, Apoptosis
서 론
대장암은 전세계적으로 알려진 암 중에서 4번째로 발 병률이 높은 악성 종양 중의 하나이다.1) 그 원인은 식생
활이 서구화됨에 따라 육류 위주의 식습관에 의한 것으 로 우리나라에서도 모든 연령층에서 발생빈도가 매년 높아지고 있는 형편이다.2)
AMP-activated protein kinase (AMPK)는 촉매 되는 α subunit와 조절 되는 β, γ subunit으로 구성되는 이형삼
량 복합체로,3) 영양분 결핍, 운동, ischemia, heat shock, oxidative stress, hypoxia, Reactive oxygen species (ROS)와 같 은 세포 내 ATP의 결핍에 의해서 활성화되는 에너지 센 서로써 중요한 역할을 수행 한다.4,5) 또한 세포 내 에너지 결핍반응으로 AMPK의 Thr-172을 인산화시키는 tumor suppressor LKB1에 의해 활성화된다.6) AMPK 활성은 p53 과 p21같은 단백질을 조절하여 세포주기 진행을 정지하 고 apoptosis를 유도하며,7) cyclooxygenase-2 (COX-2), Akt, mTOR과 같은 암세포의 성장과 증식에 관련된 분자를 억제한다.4) 따라서 암과 비만의 예방에 있어서 AMPK 조 절에 대한 역할이 더욱 중요해지고 있다.8)
정상세포와 비교하여 암세포는 물질대사에 변화가 일 어나는데, 이는 물질대사 조절기능의 장애로 인해 세포 증식이 조절되지 않아 산화적 스트레스가 증가하고, 그 로 인해 과다한 ROS (reactive oxygen species)가 발생하는 것으로 보고되고 있다.9) ROS는 자유기 분자를 포함하는 산소로, 정상 호기성 대사작용의 생리적 부산물로 알려 져 있다.10) 호기성 생물은 ROS를 발생하며 다양한 signaling-transduction pathway와 생체 내 반응에 있어서 필 수적으로, superoxide (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), hy- droxyl radicals (HO0), peroxynitrite를 포함한다. 발생된 ROS 는 AMPK를 유도하는데 있어서, upstream으로 작용하여 AMPK의 활성을 조절한다.11,12) 또한 암세포에서 ROS가 과다하게 발생하면 세포주기를 정지시키고 apoptosis를 일으키는 것으로 알려져 있다.6) 이와 같은 ROS발생을 유 도하는 물질로 curcumin이 보고 되고 있는데,13) 이는 phytochemical의 일종으로 암 예방에도 효과가 있다.14) Curcumin은 심황(curcuma longa)에 함유된 노란 색소의 성분으로 항산화, 항염증 효과가 있어,15) 당뇨병뿐만 아 니라 비만, 암과 같은 질병에서 세포 내 신호를 조절하여 예방 효과에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.8) 그 예로 in vitro에서 대장암 세포주에서 p53을 활성화시키고 G2/M단계에서 세포주기 정지를 유도하여 apoptosis를 유 도하는 것으로 알려져 있다.16)
Phytochemical은 식물에서 추출된 화합물로 과일이나 야채에 포함되어 있으며,17) 세포 증식과 생존을 억제하 는데 있어서 세포 내 신호 경로를 조절하여18) 대장암 세 포에서 apoptosis를 유도하고 종양의 신생 혈관을 억제하 는 특성을 가지고 있다.17) Phytochemical의 일종인 curcu- min에 의해서 생성된 ROS의 발생은 AMPK를 활성화 시 키는 반응 요소로, 세포 증식을 억제하고 apoptosis를 유 도한다.18)
지금까지 phytochemical에 관한 연구는 많이 진행되어 왔으나, phytochemical을 단독 처리하였을 때보다 여러 물
질을 같이 처리하였을 때의 시너지 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 HT-29 세 포에서 ROS의 일종인 H2O2을 고농도 curcumin과 각각 그 리고 병행 처리하였을 때 암세포의 증식을 억제하는 시 너지 효과를 나타내는지 그리고 apoptosis를 유도하는 데 있어서 AMPK가 어떠한 역할을 하는지에 대해 알아보고 자 하였다.
재료 및 방법 1. 실험재료
본 실험에 사용된 curcumin은 Sigma (Sigma Aldrich, St.
Louis, MO)에서 구입하여 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹 인 뒤 50 mM stock으로 만들어 −20oC에 보관하여 사용 하였다. H2O2는 Sigma에서 구입하여 사용하기 전에 증류 수에 녹여서 500 mM stock으로 만들어 사용하였다.
Hoechst 33342, 3-(4,5-dime thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte- trazolium bromide (MTT), N-acetylcysteine (NAC)는 Sigma에 서 구입하였고, AMPK 저해제인 Compound C는 CAL- BIOCHEM (San Diego, CA)에서 구입하여 사용하였다.
2. HT-29 세포주의 배양
American Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, MD)로부터 HT-29 세포주를 구입하였으며, 배양배지는 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco BRL, NY, USA), 1% streptomycin 및 penicillin (Biofluids, Rockville, MD, USA)을 RPMI 1640에 혼합하여, 37oC, 5% CO2 조건에서 confluence 70∼80% 정도로 배양되었을 때 실험에 사용하 였다.
3. MTT assay에 의한 세포생존율 측정
HT-29 세포를 배양시킨 12-well culture plate의 각 well 에 MTT 용액(5 mg/ml)을 30μl씩 첨가하여 1시간 반응시 킨 후, phosphate buffered saline (PBS)로 세척하였다. DMSO 150μl를 12-well culture plate에 첨가하여 세포를 떨어뜨 린 다음, 각 plate에서 100μl씩을 취해 ELISA- reader용 96-well plate에 분주하고 microplate reader (BIO- RAD Laboratories, Inc. USA)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 따르는 평균값과 표준오차는 Microsoft Exel program을 이용하여 분석하였다.
Fig. 1. The synergistic effects of H2O2 and curcumin in HT-29 colon cancer cells. Cells were treated with H2O2 500μM and curcumin 100μM or co-treatment of H2O2 500μM and curcumin 100μM for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay.
4. Hoechst 33342 염색을 이용한 chromatin stai- ning
12-well culture plate에 microscope cover glass (Marlenfeld GmbH & co. Germany)를 well당 하나씩 넣은 다음, Micro- scope Cover glass위에 HT-29 세포를 배양하여, H2O2와 curcumin을 단독 처리와 병행처리 후, 24시간 동안 배양 하였다. 배양이 끝난 후 plate에 직접 Hoechst 33342 염색 시약(32μg/μl)을 10μM로 처리하여 30분간 반응시키고, 3.5% formaldehyde가 포함된 PBS 500μl를 각 well에 첨가 하여 15분간 배양시켰다. 그 다음 PBS로 2번 세척하여, 50% glycerol을 1∼2방울 slide glass 위에 떨어뜨리고 핀셋 을 사용하여 culture cover glass 위에 배양된 세포가 바닥 을 향하도록 한 다음, 형광현미경(Olympus Optical, Tokyo, Japan)으로 관찰하면서, HT-29 세포에서 apoptotic cells을 확인하고, 디지털 카메라(Olympus SP-6600, Japan)로 사진 촬영하였다.
5. Western blotting에 의한 단백질 발현의 분석
HT-29 세포를 6-well culture plate에서 배양하여 H2O2
500μM, curcumin 100μM을 각각 처리하거나 병행 처리 하여 24시간 동안 배양하였다. 단백질을 추출하기 위하 여 RIPA lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP 40, 0.5% sodium deoxycholate, 1 mM pheny- lmethysulfonyl]을 각 well에 150μl씩 첨가하여 반응시킨 후, 14,000 rpm, 4oC에서 20분 동안 원심분리 하였다.
ELISA-reader 595 nm에서 흡광도를 측정하여 각 표본의 단백질 농도를 결정하였다. 5× Laemmi sample buffer (loading dye; 250 mM Tris-cl (pH 6.8), 40% glycerol, 4% β- mercaptoethanol, 0.08% bromorphenol blue, 8% SDS)와 HT-29 세포에서 추출한 단백질을 혼합하여 표본을 제작 하였다. Phospho-Acetyl-CoA carboxylase (Ser79) (p-ACC), AMPK, β-actin의 1차 항체를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하여 각각 희석한 후, 반 응시켰다. 2차 항체(Cell Signaling Technology)를 희석하여 1시간 반응시킨 다음, Blue X-ray film에 나타나는 밴드로 단백질의 활성을 관찰하였다.
6. ROS 측정
12-well culture plate의 각 well에 cover glass를 넣고, 24시 간 정도 배양한 후, curcumin 100μM, H2O2 500μM과 curcumin 100μM을 병행처리 하였다. 또한 NAC 5 mM을 RPMI 1640 media에 희석하여 1시간 전 처리한 후 H2O2
500μM과 curcumin 100μM을 병행 처리하였다. ROS의
생성 확인을 위해 각 well에 2’, 7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 10μM씩 처리하여 30분 동안 배 양한 후, cover glass 위에서 배양된 세포가 떨어지지 않도 록 조심스럽게 세척한 후, 형광현미경을 통하여 관찰하 였다.
결 과
1. HT-29 대장암세포에서 H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의한 세포증식억제 시너지 효과
H2O2와 curcumin 병행처리 시 HT-29 세포의 증식에 영 향을 미치는지 알아보기 위하여, MTT 분석을 실시하였 다. Fig. 1에서 나타난 바와 같이, H2O2 500μM, curcumin 50μM의 농도로 각각 처리했을 때 각각 15%, 30%의 암 세포 생존율이 나타낸 반면에 H2O2와 curcumin을 병행 처리했을 때는 40%의 암세포 생존율이 나타난 것을 관 찰할 수 있었다. 이와 같이 H2O2와 curcumin을 단독 처리 하였을 때보다 병행처리에 의해서 암세포의 증식 억제 에 효과가 있음을 관찰할 수 있었다. H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의한 암세포의 증식 억제 효과가 apoptosis의 유도로 일어난 것인지를 관찰하기 위하여 Hoechst 33342 를 이용한 chromatin staining을 통하여 확인하였다. Fig. 2 를 보면 아무것도 처리하지 않았을 때보다 H2O2와 curcumin를 각각 처리하였을 때 apoptotic body가 발생 되 었다. 또한 단독처리보다는 병행처리에 의한 apoptotic body가 더 많이 발생한 것을 관찰하였다. H2O2와 curcu- min의 병행처리에 의한 apoptosis를 유도하는지 확인하기
Fig. 2. Apoptotic effect of H2O2 and curcumin combination. Apoptotic bodies were measured by Hochest 33342 staining. Cells were pretreated with Compound C 10μM for 30 min and co-treated with H2O2 500μM and curcumin 100μM for 24 hr. The arrows indicate cleaved nuclei in the HT-29 cells.
Fig. 3. The effect of H2O2 and curcumin on AMPK activate in HT-29 colon cancer cells. Cells were treated with H2O2 500μM and curcumin 100μM and then incubated for 6 hrs. Protein levels of phosphorylated ACC (p-ACC) and AMPK (p-AMPK)
were determined by Western blotting. Fig. 4. Cell viability was influenced by co-treated with H2O2 and curcumin in HT-29 colon cancer cells. Cell were pretreated with Compound C 10μM (and 20μM at Western blot) for 30 min and co-treated with H2O2 500μM and curcumin 100μM for 24 hr.
위해, AMPK inhibitor인 Compound C와 비교실험을 하였 다. HT-29세포에 Compound C를 30분 전 처리 한 후 H2O2
와 curcumin를 Compound C에 각각 그리고 병행처리 해준 결과, H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의해 증가한 apop- totic body가 Compound C를 병행 처리하였더니 감소한 것 을 확인하였다. 이를 통해 HT-29 세포에서 H2O2와 curcu- min이 apoptosis를 유도하는데 영향을 미치며 단독처리보 다는 병행 처리했을 때 apoptotic body가 더 증가하는 것 을 관찰할 수 있었다. H2O2와 curcumin의 병행처리로 apoptosis를 유도하는 데 핵심 신호인 AMPK의 활성 조절 을 알아보기 위하여 Western blotting 실험을 실시하였다.
Fig. 3에서 나타난 바와 같이 아무것도 처리하지 않았을 때보다 H2O2와 curcumin을 단독으로 처리하였을 때 p- AMPK와 p-ACC가 증가하는 것을 관찰하였다. H2O2와 curcumin을 병행처리가 단독 처리하였을 때보다 AMPK 의 활성이 더 증가하였으며, p-ACC 또한 의존적으로 증 가하는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 H2O2와 curcumin을 병행처리 했을 때 AMPK의 활성이 증가하여 apoptosis를 유도함으로써 암세포의 증식을 억제하는 시 너지 효과가 있음을 확인하였다.
2. H2O2와 Curcumin 병행처리가 AMPK활성에 미치 는 영향 확인
앞에서 H2O2와 curcumin의 병행처리에 의한 AMPK의 활성이 apoptosis를 유도시켜 암세포의 생존율을 감소시 키는 것을 확인하였다. 그에 따라 H2O2와 curcumin의 병 행 처리가 AMPK의 활성에 직접적으로 영향을 미치는지 확인하였다. 우선 HT-29 세포에 AMPK의 억제제로 사용 하는 Compound C를 30분 전 처리한 후, H2O2와 curcumin 을 Compound C에 각각 그리고 병행 처리를 하였다. Fig.
4에서 보는 바와 같이, H2O2와 curcumin의 병행처리에 의 해 암세포의 생존율이 감소되었지만, H2O2와 curcumin에 Compound C 10μM를 병행 처리한 결과 암세포의 생존율 이 증가하는 것으로 확인하였다. 또한 Fig. 5에서 보여 지는 것과 같이, Western blotting을 통하여 H2O2와 curcu- min의 병행처리에 의해 활성화된 AMPK가 Compound C (10μM과 20μM) 처리에 의해 p-AMPK가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 H2O2와 curcumin의 병행처리
Fig. 5. AMPK activation is critical for co-treated with H2O2 and curcumin in HT-29 colon cancer cells. Cell were pretreated with Compound C 10μM (and 20μM at Western blot) for 30 min and co-treated with H2O2 500μM and curcumin 100μM for 24 hr. Protein levels of phosphorylated ACC (p-ACC) and AMPK (p-AMPK) were determined by Western blot.
Fig. 6. ROS generation by co-treatment with H2O2 and curcumin. Cell were pre-treated with NAC 5 mM for 1 hr and treated curcumin 100μM , H2O2 500μM and curcumin 100μM combination for 24 hr. After additional 30 min incubator in DCFH-DA 10μM and measured by fluorescence.
로 AMPK를 활성화시키며 암세포의 증식 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
3. H2O2와 Curcumin의 병행처리에 의한 ROS 생성
H2O2와 curcumin의 각각 처리하였을 때 AMPK가 활성 화 되어 apoptosis를 유도하고 세포 증식을 억제하지만, H2O2와 curcumin을 병행 처리하였을 때 그 효과가 더 크 다는 것을 알 수 있었다. H2O2와 curcumin을 병행 처리하 였을 때 AMPK를 활성화 시키기 위해 upstream 신호로 작용하는 ROS 발생에 어떤 영향을 미치는지 관찰하기 위해, HT-29세포 내의 활성산소와 반응하여 형광물질을 만들어내는 DCFH-DA를 이용하여 H2O2 생성을 확인하 였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이, HT-29세포에 curcumin 단독 처리에 의해 ROS가 생성되며, curcumin에 H2O2 500 μM를 고농도로 병행처리 하였더니 ROS가 더 많이 생성 되는 것을 확인할 수 있었다. H2O2와 curcumin의 병행처 리가 ROS 생성에 직접적으로 영향을 미치는 지 확인하 기 위하여, ROS scavenger인 NAC을 5 mM, 1시간 전 처리
한 후 H2O2와 curcumin을 병행 처리한 결과 ROS가 눈에 띄게 감소한 것을 확인하였다. 이는 H2O2와 curcumin의 병행 처리가 과도한 ROS를 발생시키는데 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 ROS가 AMPK 활성에 upstream으로 작용하는지 알아보고자 Western blotting 실 험으로 확인하였다. Fig. 7에서 보는 바와 같이, H2O2와 curcumin의 병행처리에 의해 p-AMPK가 증가하였으며, p-ACC 또한 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
그러나 활성이 증가한 AMPK와 ACC에 NAC을 첨가하였 더니 발현이 감소한 결과를 보였다. 이로써 H2O2와 curcumin의 병행처리에 의해 과다하게 ROS가 발생하게 되며, AMPK의 활성에 직접적으로 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
고 찰
본 연구를 통하여 대장암세포에서 curcumin과 고농도 의 H2O2를 병행처리 하였을 때 암세포 내의 AMPK의 활 성을 조절하여 apoptosis를 유도하는지 알아보고 curcumin 과 H2O2의 병행 처리에 의한 시너지 효과를 관찰하였다.
이를 위하여 먼저 H2O2와 curcumin을 각각 그리고 병행 처리하여 암세포 증식 및 생존율의 MTT assay 실험 결과, H2O2와 curcumin을 처리하였을 때 암세포의 생존율이 감 소하였다. 또한 단독 처리 하였을 때보다 병행 처리하였 을 때 암세포의 생존율 감소가 더 큰 것으로 나타났다.
이렇게 H2O2와 curcumin의 병행 처리로 인한 암세포의 생존율 감소에 있어서 apoptosis와 연관이 있는지 확인하 기 위해서 Hoechst 33342 염색을 이용한 apoptosis 발생 여 부를 관찰하였다. 그 결과 H2O2와 curcumin을 처리하지 않았을 때보다 처리하였을 때 apoptosis가 생성되었으며, 각각 처리한 것보다 병행 처리하였을 때 더 많이 발생된
Fig. 7. Also under Fig. 6 condition, Cell were pre-treated with NAC 5 mM for 1 hr and treated curcumin 100μM, H2O2 500μ M and curcumin 100μM combination for 6 hr. The phosphorylated ACC (p-ACC), AMPK (p-AMPK) were exami- ned by Western blot.
것을 관찰할 수 있었다. 따라서 HT-29세포의 증식억제 는 apoptosis에 의해서 유도된 것으로 보인다.
H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의해서 apoptosis가 유 도될 수 있다는 또 다른 실험은 Fig. 6에서 밝힌 것처럼 ROS의 활성 측정실험을 통하여 이루어졌다. Fig. 6에서 나타난 것처럼, ROS활성은 DCFH-DA를 이용한 H2O2의 생성을 관찰함으로써 알 수 있는데, 그림에서 보듯이 아 무것도 처리하지 않았을 때보다 curcumin만 처리하였을 때 ROS가 생성되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 Curcu- min을 단독 처리한 것보다 H2O2와 병행 처리하였을 때 ROS의 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Curcumin 은 ROS를 발생 시키는데 mitochondrial apoptotic pathway 를 이용하여 apoptosis를 유도한다.19,20) 이는 암세포에서 ROS가 과다하게 발생하면 세포주기를 정지하고 apop- tosis를 일으키는 것으로 보고되어지고 있다.6) 종양세포 에서 ROS 일종인 H2O2의 높은 수준은 정상세포보다 H2O2의 영향을 받기 쉬우며, AMPK활성과 수반되어 apoptosis를 유도한다.21,22)
H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의해 나타나는 세포증 식억제 효과가 apoptosis를 유도함에 있어서 핵심 신호로 작용하는 AMPK와 어떠한 연관성이 있는지 밝히기 위해 서 Western blotting 실험을 실시하였다. HT-29 세포에 H2O2와 curcumin을 처리하였을 때 AMPK의 활성이 나타 났으며 병행 처리하였을 때 그 활성이 더 증가하였으며, ACC도 마찬가지로 의존적으로 활성이 증가함을 관찰하 였다. 이와 같이 H2O2와 curcumin의 병행처리가 AMPK를 활성화 시키는데 있어서 직접적으로 영향을 미치는 지 알아보기 위해 AMPK를 억제시키는 Compound C를 H2O2
와 curcumin에 각각 그리고 같이 병행 처리함으로써 비 교 실험을 실시하였다. H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의해 활성화된 AMPK가 Compound C를 처리하였을 때
AMPK의 활성이 감소한 것을 확인하였다. 이는 H2O2와 curcumin의 병행처리가 AMPK가 활성화 되는 데 있어서 직접적으로 영향을 미치는 것으로 확인하였다. 이 실험 결과를 바탕으로 H2O2와 curcumin의 병행 처리가 암세포 증식 억제에 효과가 있으며 apoptosis를 일으키는 데 있어 서 핵심 신호인 AMPK를 활성화 한다는 것을 확인 하였 다. 또한 과도한 H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의한 AMPK 활성이 증가하여 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도함으로써 시너지 효과가 있음을 확인하 였다.
이와 같이 curcumin이 apoptosis를 유도하기 위해 ROS 의 발생을 유도한다고 밝혀왔다. 이를 바탕으로 H2O2와 curcumin의 병행 처리에 의해 ROS를 과다하게 발생시켰 을 때 p-AMPK의 upstream signal로 작용하는지 관찰하기 위해 ROS scavenger인 NAC을 처리하여 Western blotting 실험을 실시하였다. 그 결과 H2O2와 curcumin의 병행 처 리에 의해 생성된 ROS가 NAC을 처리하였더니, 활성화 된 AMPK와 ACC가 감소한 것을 확인하였다. 이는 H2O2
와 curcumin의 병행 처리가 과다하게 ROS를 발생시켜 AMPK의 upstream 신호로 작용함으로써 AMPK를 활성화 시키고 apoptosis를 유도하여 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 HT-29 세포에서 과다하 게 발생된 ROS는 AMPK를 활성화 시키고 apoptosis를 유 도할 뿐만 아니라,23) 세포 내 단백질 합성을 억제하는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 여겨진다.21)
본 연구를 통하여 식물에서 유래된 phytochemical의 일 종으로 curcumin은 항산화제와 항염증 특성을 보유하여 chemopreventive 활성을 나타낸다고 알려지면서,14,24) HT- 29 세포에서 발암을 억제하는 것으로 보인다.25) 이는 curcumin이 세포증식, 전이, 혈관신생과 같은 유전적 발 생을 억제하는 복합신호경로로서,9) 암세포에서 DNA합 성을 억제하고, G1단계의 세포주기를 정지시켜 apoptosis 를 유도한다.11) 이미 in vivo, in vitro에서 curcumin은 다양 한 혈관 신생 과정을 억제함으로써,10) 대장암 예방에 대 한 가능성이 높아지고 있다.25) 본 연구에서는 curcumin에 H2O2를 병행 처리함으로써 과다한 ROS를 발생시켜 AMPK 활성화로 세포주기 진행을 정지시키고, DNA 회 복과, apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다.3) 또한 대장 암세포에서 curcumin과 H2O2의 병행 처리에 의한 시너지 효과를 확인함으로써 고형암 예방을 위한 연구에 크게 기여할 것이라고 예상된다.
결 론
Phytochemical의 일종인 curcumin은 항산화, 항염증 효 과가 있어 대장암세포에서 종양의 신생 혈관을 억제하 고 apoptosis를 유도한다. 암세포에서 여러 신호경로를 통 하여 세포주기 진행을 정지시키며 apoptosis를 유도하는 데 있어서 핵심신호인 AMPK가 작용한다. 이런 특성으 로 AMPK는 암이나 비만, 당뇨와 같은 질병 예방을 위해 그 역할이 더욱 중요해 지고 있다. 대장암세포에서 curcumin에 의해 ROS가 발생되는데, 이는 암세포의 증식 을 억제하고 apoptosis를 유도하는 것으로 보인다. H2O2
와 curcumin의 병행 처리로 ROS를 과다하게 발생시킴으 로써 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도하는 시 너지 효과를 확인하고자 하였다. HT-29 대장암 세포주 에 H2O2와 curcumin을 병행 처리하면 ROS가 과다하게 생 성되며, 이는 AMPK의 upstream으로 작용하여 AMPK를 활성화시킨다. 활성화된 AMPK는 암세포의 증식을 현저 하게 억제하는 효과를 보이며, apoptosis를 유도함을 확인 할 수 있었다. 따라서 HT-29세포에서 curcumin과 H2O2의 병행 처리에 apoptosis가 유도됨으로써 세포 증식을 억제 하는 시너지 효과가 나타남을 알 수 있었다. 이로써 H2O2와 curcumin의 복합처리는 암 예방 효과에 새로운 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있다.
감사의 글
본 연구는 지식경제부와 한국산업기술재단의 전략기 술양성사업으로 수행된 연구결과임.
참 고 문 헌
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