Comparative Analysis of Skeletal Muscle Snap Freezing Method For Examination of Cellular Morphology in Differentiation

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근육 및 신경원성 병변 감별 진단시 세포관찰을 위한 골격근 급속 동결법의 비교평가

서울아산병원 병리팀ㆍ건국대학교 생명과학과¹

한장현ㆍ정학인ㆍ조명환¹

Comparative Analysis of Skeletal Muscle Snap Freezing Method For Examination of Cellular Morphology in Differentiation

of Myogenic or Neurogenic Disease

Han, Jang-Hyun., Chung, Hak-In., Cho, Myung Hwan

¹

Department of Pathology ASNA Medical Center Department of Biological Science Konkuk University

¹

Muscle biopsy is a critical step in caring patients having variable myopathies. The differential diagnosis of neurogenic or myogenic origin is very important. Variable artifacts such as ice crystals can interfere with the exact diagnosis. To acquire an optimal section, we compared several frozen and sectioning methods. To avoid direct contact, a piece of cork covered with water or an embedded medium is used as a moving plate for muscle biopsy specimens. During the indirect method, the cork should be dropped into the gel or between liquid and solid state of isopentane cooled by liquid nitrogen using a forceps. The sample must be kept in a -70℃ ultra low freezer untill sectioning. Prior to sectioning, leave the sample in cryostat for 20 minutes minimally in order to recover the optimal temperature. Sectioning must be done in a cryostat cooled at -20℃

with a new disposal knife at 7 to 10 μm for prevention of cracking. At this time, sectioning without OCT compound embedding can avoid the ice crystal artifact. Methanol prefix should be done 3 to 5 seconds after sectioning. The muscle biopsy sample must be handled with minimal trauma and precautions in order to acquire optimal sections for direct diagnosis

Key Words: Ice crystals, Cork, Isopentane cooled by liquid nitrogen, Prefix

임상병리검사과학회지 : 35권 제2호, 196-199, 2003

1) I. 서 론

근병변 질환의 효소 조직화학적 검사를 통한 진단목적 은 근병변의 원인에 대한 정확한 분석과 진단을 통해서

교신저자 : 한장현, (우)138-736 서울시 송파구 풍납동 388-1 서울아산병원 병리팀

Tel : 02-3010-4527

E-mail : [email protected]

질환에 적합한 치료 방법을 결정하여 치료의 효과를 극 대화하려는 것이다(Bancroft 등, 1987). 진단의 정확성을 위해서는 세포의 형태가 중요한 부분을 차지하고 있다.

만약 세포의 형태에 악영향을 끼치는 물리적 화학적인

요인들을 제거하고 손상이 없는 깨끗한 세포의 형태를

얻기 위해서는 먼저 선행되어야 할 것이 바로 급속동결

이다(Curless 등, 1975). 골격근의 효소조직화학적 염색을

위해서는 동결절편이 필수적이며 동결이 불완전하면 근

197 섬유 내에 생기는 얼음 결정체에 의한 근 섬유의 손상이 심하여 확실한 진단을 얻을 수 없다(Heene, 1984). 그 이 유는 골격근 내에 있는 수분들이 동결이 천천히 되면 서 로 강력한 수소 결합에 의한 강한 인력이 작용하여 서로 강력하게 끌어당겨 큰 수분 덩어리가 만들어지고 그 위 치에서 천천히 얼어버리기 때문이다. 그러므로 큰 얼음 결정체에 의한 손상을 형성하게 된다. 그래서 얼음 결정 체에 의한 조직손상을 줄이기 위하여 급속 동결이 이루 어져야 한다(Engel 등, 1963). 근육조직은 생검 후 30분 이내에 동결이 되어야 하고 이 목적을 위한 급속 동결로 직접 질소용액에 침적시키는 방법(direct by liquid nitrogen -170℃)과 아이소펜탠을 급속 동결시켜 아이소 펜탠에 침적시키는 방법(isopentane cooled by liquid nitrogen -150℃)등이 널리 이용되고 있다(Heene 등, 1984). 하지만, 질소용액에 직접 동결하는 방법은 지금까 지 알려지기로 가장 낮은 온도로 급속 동결 할 수 있는 장점이 있지만 급속한 온도차이에 의해 탄소 막이 형성 되고 그래서 세포 내부로 동결되는 것이 방해받게 되어 천천히 동결된다. 세포 내의 수분들이 서로 뭉치게 되고 결국에는 큰 얼음 결정체를 형성하여 조직을 손상시킨다 (Engel 등, 1963). 액화 질소에 의해 동결된 아이소팬탠 급속 동결법에 의한 방법은 이산화탄소 막 같은 물리적 요인이 제거되기 때문에 가장 추천받고 있는 급속 동결 법이다. 그 원리는 앞에서 언급되었듯이 세포 내의 수분 들이 그 자리에서 얼려질 수 있도록 동결제가 신속하게 침투되어야 한다. 그리고 완벽한 급속 동결을 위해서는 동결이외에도 검체의 전처리 단계 예를 들어 외과에서 골격근 검체가 채취 되고서부터 급속 동결하기까지의 시 간과 급속동결 기술 즉, 아이소팬탠에 의한 간접적인 동 결법에서 아이소팬탠의 양, 시간, 처리단계 그리고 박절 단계에서의 화학적 물리적인 수많은 요인들에 인해서 완 벽한 급속 동결에 큰 영향을 줄 수 있다(Anthony 등, 1994).

II. 재료 및 방법

1. 실험재료

6～8주의 Rat(수컷10마리)의 왼쪽, 오른쪽 대퇴근육에 서 절제생검법으로 골격근을 절취하였다.

2. 실험방법

골격근의 효소조직학적 검사를 위해서는 동결절편이 필수적이므로 -20℃를 유지하는 일회용 칼과 포셉으로 동결절편을 시행하였다. 절편의 두께는 8 μm를 유지하였 으며 골격근이 다른 물리적인 요인의 영향을 피하기 위 해 콜크 위에 면봉으로 OCT compound를 얇게 바른 후 골격근을 부착시켰다.

3. 급속 동결법

1) 액화 질소 직접 급속동결법 (Liquid nitrogen direct)

2) 액화 질소에 의해 동결된 아이소팬탠 급속동결법 (isopentane cooled by liquid nitrogen)

아이소팬탠이 동결되어 가는 중간단계인 겔 상태에서 의 동결 방법과 아이소팬탠이 완전히 동결된 후 해동될 때(고체와 액체가 반반인 상태 혹은 고체가 액체보다 많 은 상태) 아이소팬탠의 상태에 따라 겔 상태일 때 20건, 고체가 액체보다 많을 때 20건 그리고 고체와 액체가 반 반일 때 20건을 실시하였다.

3) 골격근의 크기

두께 0.5 × 1.0 cm, 길이 1.0 × 1.2 cm 크기로 일정하게 횡절단면을 절개하였다.

4) 콜크 사용

포매제를(OCT compound) 사용한 경우와 포매제를 사 용하지 않고 박절한 조직의 상태를 비교 평가하였다.

5) 박절

일회용 칼이 여러 조직과의 마찰열로 인한 온도의 상 승으로 인한 얼음 결정체의 형성여부를 확인하였다.

6) 골격근 슬라이드의 고정

얼음 결정체 없는 깨끗한 절편을 얻기 위한 고정전 시 간의 의미를 알아보았다.

3. 실험평가

본 실험의 방법으로 얻은 슬라이드를 평가하기 위해

헤마톡실린-에오진, modified gomori trichrome, periodic

198 acid shiff NADH-tetrazolium reductase, pH 9.4 아데노신 - 삼인산효소(Adenosin triphosphatase ATP ase)으로 실험 결과를 나타냈다.

III. 결 과

1. 급속 동결법

1) 액화 질소에 의한 직접 급속동결법

첫 번째로 액화질소에 침적하는 시간을 5초, 10초 그리 고 30초로 나누어 박절한 세포 전부에서 심한 얼음 결정 체로 인해 심한 손상으로 액화질소에 직접 침적하는 방 법은 다른 요인들을 달리해도 심각한 얼음 결정체에 의 해 세포가 심한 손상을 입어 골격근 진단에 부적합 결과 를 얻을 수 있었다.

2) 액화 질소에 의해 동결된 아이소팬탠 급속동결법 첫 번째로 아이소팬탠의 온도차이에 의해 형성되는 상 태에 따라 고체상태에서 액체상태로 가기 전의 중간상태 의 겔에서 골격근을 10초 동안 침적하였고 총 20건 중 얼 음 결정체를 형성한 건수는 2건이었다. 두 번째로 아이소 팬탠의 상태가 고체가 약간 많을 때(완전히 동결 된 후 해동단계에서) 20건을 실시하였다. 결과는 총 18건에서 골격근 중앙 및 주변부에서 얼음 결정체가 형성되었으며, 진단을 내리기에는 부적합한 결과가 나타났다(침적하면 서 낙하하는 골격근이 액체인 아이소팬탠에 정확히 떨어 진 것이 아니라 고체인 아이소팬탠 부위에 먼저 떨어지 며 Ice crystal이 형성, 불완전 침적). 세 번째로 아이소팬 탠이 고체와 액체 중간인 상태(액체가 약간 많을 때)의 총 20건 중 1건이 골격근 한쪽 주변 부에서 미약한 얼음 결정체가 형성(골격근 침적 시 고체 부위에 먼저 닿았기 때문)되었고 나머지 19건에서는 완벽한 골격근 세포 형 태를 얻을 수 있었다.

2. 콜크와 포매제의 사용

콜크를 사용하지 않고 포매제로 골격근 부착시킨 후 박절한 조직에서는 모두 주변부를 둘러싸며 얼음 결정체 가 광범위하게 형성되었으나 콜크를 사용하고 포매제 없 이 박절 작업을 수행한 골격근에서는 얼음 결정체 없는 깨끗한 골격근 슬라이드를 얻을 수 있었다.

3. 박 절

1) 일회용 칼

골격근 박절 목적을 위해서는 새로운 일회용 칼을 사 용하여야 절편이 갈라지거나 부스러지는 현상을 방지 할 수 있었다.

2) 골격근 슬라이드의 알코올 고정

조직절편을 박절한 후 슬라이드에 절편을 올리고 100% 메탄올로 고정(세포골격 붕괴방지)하는 시간을 바 로 즉시와 2초, 3초, 5초, 6초를 각각 5건씩 실시하였다.

3-5초 후에 고정한 슬라이드는 세포골격이 잘 유지되었 으며 골격근 세 내에서도 얼음 결정체 없는 깨끗한 세포 형태를 얻을 수 있었다, 반면에 6초 이후 고정 슬라이드 에서는 세포골격 및 경계가 완전 손상되었다.

Fig. 1. The rate of ice crystal formation after different

conditions of preservation. The bottle containing the muscle tissue was preserved in a refrigerator at -70℃ (10 specimens) and in a cryo state (10 specimens) after freezing by the indirect method. There was no difference in the rate of ice crystal formation between the two groups.

IV. 고 찰

정확한 진단을 위해서 생체 그대로에 가까운 골격근

세포 형태를 얻기 위한 급속 동결(muscle snap freezing)

은 진단에 있어서 가장 중요한 요인이 아닐 수 없다. 임

상에서 직접 골격근 급속 동결을 시행하면서 국내 국외

소개된 논문 저널 등을 적용하는데 상당한 시행착오와

어려움이 있었다. 실험 결과로 그 동안의 문제점 등을 점

검하고 보완하였으며 국내 환경에서 간과해서는 안될 요

인들을 추가하였고 골격근 급속 동결법의 이론적 배경과

임상에서의 적용방법을 규명하였기에 골격근 급속 동결

199 법을 시행하고 있는 국내 병원과 또한, 새롭게 시도하려 는 병원의 기술요원에게 도움이 되기를 기대한다.

V. 결 론

인체 근병변의 원인이 신경원성인지 근원성인지를 확 인하기 위해 실시하는 근 조직검사에서의 골격근 급속 동결 방법에서 고려되어야 할 점은 다음과 같다.

1. 골격근의 직접 접촉에 의한 물리적인 영향을 피하기 위해 콜크를 액화질소에 의해 동결된 아이소팬탠 급속 동결법을 사용하여 콜크 위에 면봉을 이용 포매제를 약 간 바른 후 아이소팬텐의 상태가 겔 또는 액체와 고체가 중간 상태일 때(-150℃) 집게로 콜크를 집어 정확히 아이 소팬텐에 침적시켜야 한다.

2. 급속동결된 골격근을 -70℃ 냉장고에 보관하여야 하 며 극도의 낮은 온도에서 적정 온도를 회복할 수 있는 시 간을 최소 30분-1시간 이상을 주어야 한다(조직절편의 부 스러지는 현상 방지). 그리고 -20℃를 유지하고 있는 동 결 절편기에서 박절 작업을 수행하여야 한다.

3. 박절 작업을 수행할 때에는 절편에 금이 가고 부스 러지는 현상을 방지하기 위해 새로운 일회용 칼을 사용 해야만 하며 박절의 두께는 7-10 ㎛ 범위 내에서 포매제 의 사용 없이 동결된 골격근을 박절해야만 온도상승에 의한 얼음 결정체를 방지할 수 있다.

4. 깨끗한 골격근의 세포 형태를 확보하기 위한 알코올 의 고정 과정에서 즉시 고정을 하게 되면 온도 상승에 인 한 얼음 결정체가 생성되므로 3-5초 범위 안에 고정을 한 다면 생체 가까운 세포골격과 얼음 결정체가 없는 깨끗 한 형태의 골격근 슬라이드를 얻을 수 있다.

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