서 론
Papovaviridae과의 인유두종 바이러스(human papilloma virus, 62
62
제한효소질량다형성 분석을 통한 인유두종바이러스 유전자형 검사법과 염기서열분석법 및 Hybrid Capture법과의 비교
Human Papilloma Virus Genotyping Assay using Restriction Fragment Mass Polymorphism Analysis, and Its Comparison with Sequencing and Hybrid Capture Assays
Eun Hee Lee, M.D.
1, Hyun Jae Chung, M.S.
2, Heung Bum Oh, M.D.
3, Hyun Sook Chi, M.D.
3, Mi Sun Jee
1, Sun Nie Park, Ph.D.
4, Sun Pyo Hong, Ph.D.
2, Wangdon Yoo, Ph.D.
2, and Soo-Ok Kim, Ph.D.
2Green Cross Reference Laboratory1, Yongin; GeneMatrix Inc., Yongin2; Department of Laboratory Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center3, Seoul; Korea Food and Drug Administration, National Institute of Toxicology Research4, Seoul, Korea
이은희1∙정현재2∙오흥범3∙지현숙3∙지미선1∙박순희4∙홍선표2∙유왕돈2∙김수옥2
녹십자의료재단1, (주)진매트릭스2, 울산대학교 의과대학 서울아산병원 진단검사의학교실3, 식품의약품안전청 국립독성연구원4
62 62
접 수: 2006년 9월 15일 접수번호:KJLM1988 수정본접수: 2006년 11월 16일
게재승인일: 2006년 11월 17일 교 신저 자: 김 수 옥
우 449-913 경기도 용인시 기흥구 보정동 314 (주)진매트릭스 중앙연구소
전화: 031-260-9090, Fax: 031-260-9087 E-mail : [email protected]
*본 연구과제는 대한민국 과학기술부(MOST)와 한국과학재단(KOSEF)의 특정연구개발사업 프로그램(M10640010000-06N4001-00210)에 의해 지원되 었습니다.
Background :Infection with human papilloma virus (HPV) is the main cause of cervical cancer, and HPV genotyping is of increasing importance for determining clinical course and management of the disease based on the HPV genotypes. Here, we established a novel matrix-assisted laser desorp- tion/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) assay, termed restriction fragment mass polymorphism (RFMP) that is suitable for genotyping multiple HPV in an accurate and high- throughput manner. We evaluated the performance of the RFMP assay in HPV genotyping by com- paring the results with those of direct or clonal sequencing and hybrid capture (HC) assays.
Methods :The study population consisted of 50 patients with histologically confirmed cervical lesions and a positive test for HPV DNA. HPV genotyping was performed with RFMP, sequencing, and HC assays. The assigned genotypes and risk groups were compared among the methods.
Results :Concordance rates in the genotype level between RFMP vs sequencing, sequencing vs HC, and HC vs RFMP were 98% (49/50), 88% (44/50), and 88% (44/50), respectivley. Especial- ly, RFMP and sequencing were 100% concordant when assigned high-risk group was considered identical in 1 case of mixed genotypes identified only in RFMP. The observed discrepancy between HC and the other two methods is due to the assignment of six cases of low, intermediate, or unas- signed risk genotypes as high-risk group in HC method.
Conclusions :RFMP, sequencing, and HC assays were highly concordant with each other in HPV genotyping. Compared to sequencing assay, RFMP assay is found to be advantageous in detecting mixed genotype infections. The accuracy and amenability to high-throughput analysis should make the RFMP assay suitable for reliable screening of HPV genotypes in clinical laboratories. (Korean J Lab Med 2007;27:62-8)
Key Words : Human papilloma virus (HPV) genotyping, Restriction fragment mass poly- morphism (RFMP), Sequencing
HPV)는 핵 내에서 증식하며, 유전자부체(episomal)로 세포질 내 에서 주로 발견된다[1]. HPV 지놈은 약 8 kb의 2가닥 사슬 원형 DNA로써, open reading frame (ORF)는 자신의 DNA 복제와 세포의 형질 전환에 작용하는 E1, E2, E4, E5, E6, E7 유전자와 그리고 오직 분화하는 상피세포에서만 발현하여 캡시드(capsid) 단백질을 만드는 L1, L2 유전자로 구성되어 있다[2]. HPV 유 전자형의 분류는 DNA 염기서열의 유사성에 따르고 있으며, E6, E7, L1 ORFs의 서열이 기존서열과 비교시 10% 이상 차이를 보 이면 새로운 유전자형(genotype)으로 정의되며, 90-98% 유사성 을 보일 경우 아형(subtype), 98% 이상 유사시 변이체(variant) 로 정의된다[3, 4].
HPV 유전자형은 환자/대조군 비교 역학 연구에 근거하여 발 암 고위험군(high risk group)과 저위험군(low risk group)으로 크게 대별되며, 고위험군에 속하는 아형으로는 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82이 있고, 발암발생과 관련 이 적은 저위험군은 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 등 으로 보고된 바 있다[5]. 이 중에서도 악성종양 발생의 고위험군 으로 구분되어 있는 HPV 16과 HPV 18은 90% 이상의 자궁경 부암조직에서 발견되고 있다[6, 7]. 현재까지 약 100여 종의 HPV 아형이 알려져 있으며, 이 중 약 40여 종의 아형이 자궁경부암과 관련된다고 알려져 있다[8, 9]. HPV의 분자 진단 방법으로는 line probe assay[10, 11], hybrid capture (HC) assay[12-14], type-specific probe를 이용한 Southern blot, dot blot, filter
in situ
hybridization, genotype-specific PCR, general-primer PCR, DNA chip[15-17]과 restriction fragment length polymorphism (RFLP)[18], 염기서열분석법(sequencing)[19, 20] 등이 알려 져 있다.Restriction fragment mass polymorphism (RFMP)법은 Type IIS 제한효소 절단과 MALDI-TOF MS를 이용하여 유전자형 결 정 부위의 서열을 파악하는 원천 기술로서 정확도가 우수하고, 정 량적인 분석이 가능하며, 많은 양의 검체를 자동으로 분석할 수 있어 유전체 분석과 임상 분자 진단 분야에서의 유용성이 여러 연 구에서 소개되고 있다[21-26]. 이에 본 연구에서는 RFMP 방법을 이용한 HPV 유전자형 진단법을 기존의 HC법 및 염기서열분석 법과 비교 분석 함으로써 정확도와 임상적 유의성을 평가하고자 하였다.
재료 및 방법
1.연구 대상
울산대학교 의과대학 아산병원에서 2003년 2월부터 9월까지 시 행한 HPV PCR 검사에서 양성 판정을 받은 50명의 여성을 대상 으로 하였으며, 이 중 45명은 세포학과 Digene사(Digene Co., Gai- thersburg, MD, USA) HC II 검사 결과에서 각각 경도 이상의
자궁경부상피내 이형성증(cervical intraepithelial neoplasia, CIN) 소견과 고위험군 양성 소견을 보였으며, 나머지 5명은 미확정 비 정형 편평세포(atypical squamous cells of undetermined signif- icance, ASCUS)의 상피세포 이상 소견을 보였다.
2.
연구 방법
1) HPV
염기서열 분석PGMY09/11 primer 세트와[27] BioDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, CA, USA)을 이 용하여 염기 서열 분석을 시행하였다. Clustal X와 Genedoc 프로 그램을 이용하여 Los Alamos National Laboratories HPV Da- tabase (http://hpv-web.lanl.gov)에서 얻은 HPV reference sequence와 비교 분석하였다[28-30].
2) HC II
HC II (Digene Co.)는 저위험군 5종(6, 11, 42, 43, 44)과 고 위험군 13종(16, 18, 31, 33,35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)의 인유두종 바이러스 검사가 가능한데 본 연구에서는 고위험군에 대 한 probe를 사용하였다. 검사방법은 변성(denaturation) 시약과 검체를 혼합한 다음 65℃ 항온조에 45분간 방치하였다. 13가지 고위험군 인유두종 바이러스에 type-specific RNA probe와 검체 를 혼합한 후 65℃에서 60분간 방치하였다. RNA-DNA hybrid 가 포함된 용액을 microplate 표면에 부착시킨 후 알카라인 인산 효소(alkaline phosphatase)와 교잡체 특이 항체(hybrid specific antibody)를 넣고 화학발광물질을 넣고 15분간 배양한 다음 DML 2000 Luminometer (Digene Co.)를 이용하여 측정하였다. 대조 검체에 대한 relative light unit (RLU)값이 1.0 이상인 경우를 양성으로 하였다.
3) RFMP
법을 이용한HPV
유전자형 분석HPV DNA는 QIAamp� DNA Blood Kit (QIAGEN Inc., Chatworth, CA, USA)를 이용하여 제조사의 방법대로 분리하였 다. Kwok과 Higuchi[31]의 가이드라인을 준수하여 위양성을 방 지하였다. 1차 중합효소연쇄반응은 PGMY09/11 시스템을 이용 하여 증폭하였으며[27], 그 후 2차 중합효소연쇄반응은 Platinum�
Taq
DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 0.4 units, 양방향 primer 각각 0.4 M, 0.2 mM dNTP, 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.4)이었다. 2차 PCR 반응에 사용 된 PCR primer는 순방향 HPV-RFMP-F,5′-GCMCAGGGHC- AYAAGGATGAATGG-3′(nucleotide number 6,584-6,603), 역방향 HPV-RFMP-R, 5′-GTACTDCKDGTRGTATCHACM- ACGGATGTAACAAA-3′(nucleotide number 6,657-6,626)이 며, 제한 효소 절단과 질량 분석 조건은 Chung 등의 방법을 준용 하였다[32].결 과
1. RFMP HPV genotyping
결과 및 유전자형 빈도
경도 이상의 자궁경부상피내 이형성증 소견과 HC법에서 고위 험군 양성을 보인 45명의 검체를 RFMP법으로 분석한 결과, 전 체의 87%에 해당하는 39명에서 고위험군의 HPV 유전자형이 발 견되었는데, 3명에서 중등도위험군, 2명에서 저위험군, 1명에서 미 결정위험군에 해당하는 유전자형이 확인되었고, 미확정 비정형 편 평세포 소견을 보인 5명은 환자는 4명이 저위험군, 1명이 미결정 위험군의 유전자형으로 판정되었다(Table 1). 전체 환자의 14%
(7/50)에서 2개의 유전자형이 혼재하는 것으로 나타났는데, 7개 모두 검체에서 고위험군의 유전자형이 나타났고, 18, 52, 31, 35 형이 2번 이상 발견되었다. 단일 유전자형과 혼합 유전자형을 모 두 고려하여 가장 빈발하는 유전자형은 31형으로서 전체의 20%
(10/50)에서 발견되었고, 16형(16%), 58형(12%), 52형(12%),
18형(12%) 순으로 집계되었는데, 이들 상위 5개 유전자형이 전 체 환자의 68% (33/50)에 해당하였다(Table 1).
2.
검사법에 따른
HPV유전자형과 일치율
RFMP HPV genotyping법으로 분석한 50명의 검체에 대해 직접염기서열분석법을 수행하였고, mixed genotypes으로 사료되 어 염기서열분석법의 chromatogram에서 직접 유전자형을 판독 하기 어려운 검체의 PCR 산물에 대해서는 각각 10개의 클론을 만든 후, 염기서열분석을 수행하여 유전자형을 판독하였다. 45예 의 분석 검체에 대해 RFMP와 염기서열분석법은 1예(환자 2)를 제외하고 모두 동일하여 98% (49/50)의 일치율을 보였다. 환자 2의 경우 RFMP에서는 고위험군인 18형과 중등도위험군인 66형 의 혼합 유전자형으로, 염기서열분석법에서는 고위험군 18형의 단독 유전자형으로 판독하였는데, 위험군 보유 수준에서 두 방법 을 비교할 경우 100%의 일치율을 보였다. 염기서열분석법과 HC 법을 비교할 경우 전체 50개 중 6개의 시료에서 불일치를 보였는 데, HC법에서는 고위험군으로 판독하였으나, 염기서열분석법에 서는 저위험군인 81형(환자 20, 21), 중등도위험군인 66형(환자 13, 37), 53형(환자 23), 미결정위험군인 62형(환자 8)으로 분석 되어 88% (44/50)의 일치율을 보였다. RFMP와 HC법을 비교 할 경우 전체 45개 중 6개의 시료에서 불일치를 보였는데, 이 경 우도 염기서열분석법, HC법의 비교 결과와 동일하게 HC법에서 고위험군으로 나온 예를 중등도위험군 이하로 판독한 경우여서 일치율이 88% (44/50)이었다. 전반적으로 RFMP와 염기서열분 석법의 일치율은 매우 높았으며, Fig. 1의 예(환자 20, 8)에서 HC 법은 일부 저위험군이나 미결정위험군을 고위험군으로 판독하는 경향을 보였다. 전체적으로 50명의 검체에서 RFMP, 염기서열분 석법, HC법이 모두 일치하는 경우는 43예로 86%의 일치율을 나 타냈다.
*In case of a mixed genotype infection, the PCR products were cloned for sequence analysis of each clone (at least 10 clones per sample).
Abbreviations: RFMP, restriction fragment mass polymorphism; SBT, sequencing-based test; HC, hybrid capture high risk cocktail test; H, high; L, low; I, intermediate; U, unassigned risk groups.
No. of patients
(N=50) RFMP SBT* HC Result
8 31 31 Positive Concordant
7 16 16 Positive Concordant
6 58 58 Positive Concordant
4 52 52 Positive Concordant
3 18 18 Positive Concordant
2 33 33 Positive Concordant
2 (Patient 20, 21) 81 81 Positive Discordant 2 (Patient 13, 37) 66 (I) 66 (I) Positive Discordant
1 35 35 Positive Concordant
1 51 51 Positive Concordant
1 (Patient 23) 53 (I) 53 (I) Positive Discordant
1 (Patient 8) 62 62 Positive Discordant
2 16 (H), 52 (H) 16 (H), 52 (H) Positive Concordant 1 31 (H), 52 (H) 31 (H), 52 (H) Positive Concordant 1 35 (H), 69 (H) 35 (H), 69 (H) Positive Concordant 1 18 (H), 35 (H) 18 (H), 35 (H) Positive Concordant 1 18 (H), 31 (H) 18 (H), 31 (H) Positive Concordant 1 (Patient 2) 18 (H), 66 (I) 18 Positive Discordant
1 6 (L) 6 (L) Negative Concordant
1 11 11 Negative Concordant
1 40 40 Negative Concordant
1 72 72 Negative Concordant
1 MM8 (U) MM8 (U) Negative Concordant
Concordance (%) 86 (43/50)
RFMP vs SBT 98 (49/50)
SBT vs HC 88 (44/50)
HC vs RFMP 88 (44/50)
Table 1.Comparison of the HPV genotyping results obtained by RFMP, sequencing, and hybrid capture analyses for 50 clini- cal specimens
2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 mz
RFMP
HPV81
HPV62 2162.4
2191.4
4006.6
4083.6 3761.4 3659.4
3990.6 2162.4
2206.4 3668.43761.4 4059.6
Sequencing
Relative Intensity
Fig. 1.RFMP and sequencing results of patient samples showing discordance with hybrid capture assay. HPV genotype 81 (belong- ing to low risk group) identified in Patient 20 (upper panel) and HPV genotype 62 (belonging to unassigned risk group) detected in Patient 8 (low panel) by both RFMP and sequencing assays show high risk positivity in HC assay. Sequences in genotype- specific motifs were underlined.
고 찰
국내의 HPV DNA 검사는 HC법과 HPV DNA microarray, HPV PCR 등이 주로 사용되고 있다. HC법은 RNA probe에 HPV DNA를 교잡반응하여 생성된 DNA-RNA hybrid에 항체 를 붙여, chemiluminescence signal의 증폭을 측정하는 방법으로 검사실에서 널리 사용되고 있다. HC법은 FDA 공인 방법이지만, 엄격한 의미의 HPV의 유전자형 판독이라기 보다는, 위험군 분류 의 성격을 지니므로, 특정 유전형 바이러스의 지속성 감염 여부를 확인할 수 없는 근본적 한계가 있다. HPV DNA chip 검사법은 개발 기관에 따라 다양한 primer에 의존하는 검사가 개발되어 사 용되고 있으며, 검사의 원리상 HC법과 마찬가지로 교잡반응에 기 초하므로, signal intensity가 다양하게 나타날 수 있으며, signal intensity의 판독에 따라 다양한 민감도를 나타낼 수 있는 단점이 진단 원리상 내재하고 있다. 보고된 바에 의하면 hybridization- based assay로서 진단 검사에 사용된 기간이 오래되어, 표준화가 비교적 잘 수립되어 있는 HC법의 경우에도, 비특이적 교잡 반응 (non-specific hybridization)으로 인한 문제점들이 수 차례 지적 된 바 있다[33-36]. Peyton 등은 HC II probe cocktail이 HPV 53형을 비롯하여 66, 67, 73, CP6108 등과 비특이적 교잡반응을 보여 고위험군으로 판독될 수 있다고 보고하였으며[33], Poljak 등도 HC 검사에서 고위험군 probe cocktail이 6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 61, 66, 70, 73, 81형 등의 고위험군이 아닌 유전자형이 고 위험군으로 판독될 가능성이 있다고 보고한 바 있다[34].
임상적 유전자형 분석을 위해 가장 중요한 필수적 요건인 정확 성은 RFMP genotyping의 경우 MALDI-MS 분석 기기의 장점 과 RFMP 분석 원리에 유래한다. 첫째, RFMP의 분석 원리상 판독하고자 하는 변이가 포함된 amplicon을 hybridization 과정 을 수행하지 않고, 바로 amplicon 자체를 절단하여 질량을 분석하 므로, 비특이적 교잡 반응에 의한 위양성의 가능성을 원천적으로 배제하는 장점이 있다. 둘째, 질량을 분석하고자 하는 DNA 단편 (genotype-diagnostic fragment)에 primer에서 유래되지 않고 표적 유전자 부위(genotype-specific motif)에서 기원된 염기서 열이 있으므로 분석 시 DNA 단편의 질량이 예측치에서 벗어날 경우, PCR 반응의 특이성 문제를 알 수 있으므로 분석이 원하는 표적에서 정확하게 일어났는지를 자체 점검(self-validation)함으 로써 정확도를 검증할 수 있다. 셋째, RFMP는, signal 측정과 더불어 유전자형에 따른 고유질량 값을 측정하기 때문에 signal에 만 의존하는 검사 기법에 비교하여 볼 때, 애매모호한 signal의 판 독의 문제를 원천적으로 배제한다. 넷째, 검사의 원리상 DNA의 단일가닥에서 유래하는 signal 만을 측정하는 것이 아니고 DNA 의 다른 가닥도 동시에 측정함으로써 검사의 정확성을 제고할 수 있는 장점을 지닌다.
50예의 임상 검체를 이용한 본 연구에서는 RFMP 원천기술을 HPV 유전자형 검사에 적용하여, 염기서열분석법 및 HC법과 비 교하여 임상적 성능을 평가하였다. 전체적으로 50명의 검체에서
RFMP, 염기서열분석법, HC법이 모두 일치하는 경우는 43예로 86%의 일치율을 나타냈다. HC 검사법을 염기서열분석법과 RF- MP법과 각각 비교하여 볼 때 일치율은 공히 88% (44/50)로 나 타났으며, 불일치한 경우는 염기서열분석법과 RFMP법에서 저위 험군, 중등도위험군, 미결정위험군으로 판정한 6예를 모두 HC법 에서는 모두 고위험군으로 판독되었다. 염기서열분석법과 RFMP 법을 비교하여 볼 때 위험군 판독 기준에서는 100% 일치하였고, 검사의 판독에 있어서는 RFMP법이 염기서열분석법보다 signal 판독의 편의성을 나타내었으며, 염기서열분석법보다 혼합 감염을 더 잘 검출하였다.
본 연구에서는 그 동안 보고되지 않았던 드문 유형이 있었는데, 20, 21번 환자 시료의 경우에 직접염기서열 분석과 RFMP 모두 에서 저위험군에 속하는 HPV 81 유전자형으로 판독되었다. 흔하 지 않은 유전형으로 HC법을 이용하여 분석한 결과는 고위험군으 로 판독되었다. 반면에 염기서열분석법에 의해 분석한 결과 HPV 유전자형에 따라 특이한 염기 서열을 갖는 L1 motifs nucleotide number 6,604-6,625에서는 CATTTGTTGGTTTAATGAAA- TG의 유전자 서열을 갖는 것으로 관찰되었다. 이는 이전의 Pol- jak 등에 의해 보고된 바와 마찬가지로 HC 분석법의 저위험군의 유전자형 DNA가 고위험군 probe cocktail에 반응하는 cross-reac- tivity에 의한 것으로 잘못 판독될 수 있다고 사료된다[34].
HC 분석에서 cross-reactivity에 의해 저위험군의 바이러스뿐 만 아니라 중등도위험군 및 미결정위험군의 바이러스를 고위험군 으로 잘못 판독하는 사례가 관찰되었다. 13번, 37번 환자 시료의 경우 HC 분석 결과와 달리 RFMP HPV 분석 결과에서는 중등 도위험군으로 판독되었는데, 염기서열분석 결과 역시 CATAT- GCTGGGGTAAT CAGGTA 서열을 지니는 66형의 중등도위 험군으로 판독되었다. 또한 23번 시료의 경우 역시 HC 분석에서 는 고위험군으로 판독되었지만, 실제 RFMP와 염기서열분석법 모두 공히 CATCTGTTGGAACAATCAGTTA 서열을 갖는 53형의 중등도위험군으로 판독되었다. 8번 환자의 시료의 경우는 역시 HC 분석에서는 고위험군으로 판독되었지만, 실제 RFMP와 염기서열분석법 모두 공히 TATTTGATTATGCCCAGCAAA- CA 서열을 갖는 62형의 미결정위험군으로 판독되었다.
유전자형에서 불일치를 보였던 환자 중 2번 환자의 경우에는 RFMP에서는 mixed genotype으로 판독되었던 예이다. RFMP 에서는 각 유전자형 별로 다른 위치에서 peak를 만들 수 있기 때 문에 상이한 유전자형의 존재 유무를 판단할 수 있으며, peak의 상대적 높이 혹은 면적을 바탕으로 혼합 감염된 유전자형의 상대 비율을 판단할 수 있다. 염기서열분석법의 경우에는 혼합 감염에 서 열세종(minor population)이 우세종(major population)의 20- 50% 이상 존재할 때 열세종의 유전형 판독이 가능했지만, RFMP 유전자 분석법에서는 열세종이 1% 가량 존재하여도 판독이 가능 하였다. 본 연구에서는 RFMP의 background noise를 고려하여 우세종이 5-10% 이상의 peak를 보이는 경우에 mixed-genotype 으로 처리하였다. 2번 환자에서는 고위험군 18형과 중등도위험군
66형의 peak가 뚜렷하였으므로, 저자들은 mixed-genotype이 있 었던 것으로 판정하였으나, 염기서열분석법에서는 18형 단독감염 으로 판독되었다. 혼합 감염 여부를 정확히 파악하고자 추가로 클 로닝을 실시하여 10개의 클론에 대해 염기서열을 분석하여 검증 한 결과 2번 환자의 경우는 18형과 66형의 상이한 유전자형의 감 염이 분명하였다. 본 연구에서는 혼합 감염의 결과는 2번 환자이 외에도 5명의 환자의 경우에서 2가지 이상의 고위험군 유전자형의 바이러스에 의해 혼합 감염된 양상을 관찰할 수 있었는데, 염기 서열분석법의 경우에는 peak가 중첩되어 유전자형을 읽을 수 없었 으며, HC법의 경우에는 고위험군으로 판독되어 RFMP와 HC의 검사간에 정성적으로 일치하는 결과를 나타내었다. 이러한 혼합 감염의 가능성은 다양한 형태의 성 파트너를 지닌 여성의 상당수 에서 실제로 일어날 수 있는 HPV 감염 양상으로 사료된다. 향후 혼합 감염 환자들을 대상으로 상이한 유전형의 감염 양상과 임상 결과를 비교 분석하는 추가적인 임상 추적 조사가 이루어져야 할 것이다.
결론적으로 HPV 유전자형 검사에 있어 염기서열분석법과 RF- MP법을 비교하여 볼 때 위험군 판독 기준에서는 100% 일치하였 고, 유전자형 일치율은 98% (49/50)로 RFMP 검사를 임상에 적 용하는데 문제가 없을 것으로 사료된다. 염기서열분석법과 RFMP 결과 비교에서 불일치한 1예(환자 2)를 클로닝한 후 염기서열분 석을 실시하여 추가 분석하였을 때, 고위험군과 중등도위험군의 mixed-genotype이 존재하는 것으로 규명되었다. 따라서 이러한 혼합 감염의 경우에는 RFMP가 염기서열분석법보다 우수한 것으 로 사료되었다. 또한 비록 선진국의 FDA 공인을 받은 HC 분석 법이 비교적 표준화가 잘 설정되었을 것으로 신뢰되고 있지만, 본 연구에서는 기존의 연구자들에 의해 보고된 결과들과 마찬가지로 비특이적 반응에 의한 검사 판독의 사례들(12%, 6/50)이 발견되 었다. 저자들의 연구 결과, RFMP법을 이용한 HPV 유전자형 결 정은 매우 정확하며 대용량 자동화 분석에 응용 가능하므로 임상 검사로서 유용한 방법이라 사료되었다.
요 약
배경 : HPV 감염은 자궁경부암 발생의 주원인으로서, HPV의 유전자형에 따라 발암위험도가 상이하므로 임상 예후 예측이나 치 료 대책에 HPV 유전자형 검사의 중요성이 더욱 커지고 있다. 본 연구에서 저자들은 matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry 분석을 토대로 정확하고 대용 량 자동화 분석이 가능한 restriction fragment mass polymor- phism (RFMP) HPV 유전자형 검사를 확립하고, 그 성능을 직 접 또는 클로닝 염기서열법과 hybrid capture (HC)법과 비교하 였다.
방법 : 서울아산병원에서 자궁 경부 조직 이상 소견과 HPV DNA 양성 판정을 받은 50명을 대상으로 하였다. HPV 유전자
형은 RFMP법, 염기서열법, HC법으로 결정하였고, 세 방법의 결과를 유전자형 수준과 발암 위험군(risk group) 수준으로 비교 분석하였다.
결과 : 유전자형 수준에서 RFMP와 염기서열법, 염기서열법과 HC법, HC법과 RFMP법과의 일치율은 각각 98% (49/50), 88%
(44/50), 88% (49/50)이었다. RFMP와 염기서열법은 RFMP에 서만 혼합 유전자형으로 판독된 1예의 고위험군 유전자형이 일치 하는 것을 고려하면 100%의 일치율을 보였다. HC법과 다른 두 방법의 결과가 불일치하는 경우는 염기서열법과 RFMP법에서 저 위험군, 중등도위험군, 미결정위험군으로 판정한 6예를 HC법에서 는 모두 고위험군으로 판독한 결과였다.
결론 : RFMP는 염기서열법, HC법과 비교할 때, HPV 유전자 형 검사에 있어 우수한 일치율을 보였고, 혼합 감염의 경우 직접 염기서열법보다 우수하다고 판단되었다. RFMP법을 이용한 HPV 유전자형 결정은 매우 정확하며 대용량 자동화 분석에 응용 가능 하므로 임상 선별 검사로서 신뢰도 높은 방법이라고 사료되었다.
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