pISSN 1598-642X eISSN 2234-7305
Rhizopus oryzae N174를 이용한 액체종국 저장조건에 따른 밀누룩의 품질특성
최정실·정석태·최지호·최한석·백성열·여수환*
농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효식품과
Received : May 30, 2012 / Revised : September 21, 2012 / Accepted : September 22, 2012
Quality Characteristics of Wheat Nuruks by Storage Conditions of Liquid Starters Using Rhizopus oryzae N174. Choi, Jeong-Sil, Seok-Tae Jung, Ji-Ho Choi, Han-Seok Choi, Seong-Yeol Baek, and Soo- Hwan Yeo*. Fermented Food Science Division, Department of Agro-food Resource, NAAS, RDA, Suwon 441- 853, Korea − Production of liquid starters using wheat bran as a medium for Rhizopus oryzae N174 and the changes in their characteristics noted during storage were investigated in this study. The optimal culture condi- tions of the liquid starters were determined to be 5~15% (w/v) wheat bran and 48~72 hrs of incubation. The effects of liquid starters with different storage periods and temperatures (-18, 4, 10 and 25oC) on the quality of wheat nuruk were evaluated. According to the results of the pH, acidity, reducing sugar and enzyme activities, it was found that liquid starter using wheat bran preserved for one day, at any temperature, is the best method of storage for seed cultures for R. oryzae N174.
Key words: Rhizopus oryzae N174, mycelium, wheat nuruk, liquid starter, enzyme activity
서 론
우리나라는 오래 전부터 술을 빚을 때, 발효제인 누룩을 사용하였다. 특히, 누룩은 술의 품질을 결정짓는 중요한 요 소이다[23]. 전통적으로 전분 분해효소와 발효 미생물원으로 사용한 누룩은 증자과정을 거치지 않은 소맥을 주원료로 제 조되어 왔다. 그러나 누룩 제조시 미생물이 자연적으로 착 생되어 유용 균주의 생육을 억제시키거나 누룩의 변패를 일 으킬 가능성이 있다[19]. 따라서, 누룩의 품질 관리뿐만 아 니라 효소 역가 유지가 쉽지 않아[12] 증자한 곡류에 종국 균을 인위적으로 접종·배양한 입국을 발효제로 사용하게 되었다[14, 24]. 종국은 주류와 장류의 품질 향상을 위해, 1920년경 일본에서 우리나라에 처음 도입되었고 1934년 최 초로 제조·시판되었다[22]. 입국 제조시 씨앗으로 사용하 는 종균용 곰팡이는 우리나라 전통누룩에 많이 분포하는 Absidia 속, Rhizopus 속, Aspergillus 속을 들 수가 있다 [13]. 전통누룩에서 각종 효소 활성이 뛰어난 우수 균주를 분 리·선발하여 새로운 유형의 누룩을 제조하려는 연구가 지 속적으로 이루어지고 있다[3, 24, 25, 26]. 이중 생전분 당화 성 amylase 생산능이 강하고 산을 생성하는 Rhizopus 속은 동북아 3개국(한국, 일본, 중국)에서 전통주를 빚을 때 주로 사용하는 균주[9]로 지금까지는 고체종국을 제조하기 위한
최적조건을 규명하기 위한 연구가 진행되어 왔다[24, 25, 26].
그러나 고체종국 제조시 전처리의 복잡성, 유해 미생물의 오 염, 제국실의 적절한 온·습도 및 저장관리기술 등의 여러 가지 문제점이 보고되었다[5, 10, 15]. 이와 반대로, 액체종국 제조는 잡균번식에 비교적 안전하고 공정을 간이화 하거나 세포외 효소, 균사체 및 포자 회수 등이 용이한 장점을 가지 고 있다[2, 5].
특히, 액체 종국용 배지로 사용한 밀기울은 약 40~50%
섬유소와 무기질 및 비타민 B가 함유된 것이 알려지면서 식 이섬유가 보강된 기능성뿐만 아니라[16, 20] 천연배지의 좋 은 원료로서 효소능이 뛰어난 것으로 알려져 있다[4, 8].
본 연구에서는 잡균의 오염을 방지하고 고역가 누룩제조에 액체종국의 이용성이 높아지며, 이들의 저장조건과 배양특성 에 관한 정보가 향후, 신한국형 누룩제조의 기본자료로서 그 활용의 가치가 높아질 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서 는 시판되는 전통누룩에서 분리·동정한 거미줄 곰팡이인 R.
oryzae N174를 이용한 밀기울 액체종국의 최적 배양조건 규 명과 더불어 저장온도와 기간을 달리한 액체종국으로 밀누룩 을 제조하여 이들의 배양학적 특성 등을 조사하였다.
재료 및 방법 사용 균주 및 액체종국 제조
본 실험에 사용한 곰팡이는 국립농업과학원 발효식품과에 보관중인 R. oryzae N174를 사용하였고, 액체배지는 다음과 같이 제조하였다. 밀기울을 분쇄하여 20-mesh sieve를 통과
*Corresponding author
Tel: +82-31-299-0580, Fax: +82-31-299-0554 E-mail: [email protected]
시킨 후, 증류수 100 mL에 대한 무게비율로 분쇄된 밀기울 을 0, 5, 10, 15 및 20%(w/v)되게 첨가하여 121oC에서 25 분간 고압멸균하였다. R. oryzae N174를 1백금이 접종하고 30oC, 100 rpm으로 24시간 전배양한 후, 본배양 배지에 5%
접종하여 동일조건에서 48~96시간 배양하였다.
밀누룩 제조
밀누룩 제조는 통밀을 깨끗이 씻어 3시간 침지하였으며 1 시간 물빼기를 한 후, 50 g씩 삼각 플라스크에 넣고 121oC에 서 25분간 고압멸균하였다. 여기에 저장온도(-18, 4, 10, 25oC) 및 저장기간(0, 1, 3, 5일)에 따라 제조된 액체종국으로 건조 통밀(수분 7.78 ± 0.2%)의 무게 비율로 5% 접종하여 30oC에서 40시간 배양한 후, 이들의 특성 변화를 조사하였다.
균사체량 분석
액체종국의 원료 최적 배합비율과 배양조건을 구명하기 위해, R. oryzae N174의 균사체량을 분석하였다. 건조 균사 체량 측정은 50oC에서 미리 건조한 여과지(Adventec no. 2, Japan)를 이용하여 배양액을 여과하고 증류수로 3회 세척하 여 가용성 물질을 제거한 후, 균사체를 회수하여 50oC에서 건조시킨 후 여과지 무게를 뺀 값으로 건조 균사체량을 구 하였다.
액체종국과 밀누룩의 효소활성 분석
액체종국이 가지는 효소활성은 배양액을 조여과한 효소액 을, 밀누룩은 밀누룩 10 g에 염화나트륨 5 g을 증류수에 녹 인 후, 0.2 M 초산 완충액(pH 5.0) 50 mL를 넣고 물을 가해 1 L로 제조한 염화나트륨용액 50 mL를 넣고 실온에서 3시 간 침출·여과한 것을 조효소액으로 사용하였다. 효소분석 은 일본 국세청소정분석법[21]에 따라 각각의 효소활성(α- amylase, glucoamylase, acidic protease)을 측정하여 액체종 국이 가지는 효소활성은 units/mL로 밀누룩의 효소활성은 units/g-nuruk으로 나타내었다.
저장조건에 따른 액체종국의 형태학적 특성
위의 방법으로 액체종국(밀기울 5% 첨가)을 제조하여 4 가지 조건(-18, 4, 10 및 25oC)에서 5일간 저장하면서 균사 체의 변화를 광학현미경(Axioskop50, Zeiss, Germany, 400×)으로 관찰하였다.
밀누룩의 이화학적 특성
배양한 밀누룩 20 g에 물 100 mL을 넣고 실온에서 3시간 침출한 후, 이 여과액으로 pH, 산도, 아미노산도[18] 및 환 원당[17] 등의 이화학적 특성을 분석하였다. pH는 pH meter (TGA, JP/HM-21P)로 측정하였고 산도는 여과액 10 mL를 삼각 플라스크에 넣고 혼합지시약 2~3방울을 떨어뜨려 혼합 한 후, 0.1 N NaOH로 담록색을 나타낼 때까지 적정하여 그
값으로 표시하였다. 아미노산도는 여과액 10 mL를 취하여 삼각 플라스크에 넣고 페놀프탈레인 지시약 3~4 방울을 떨 어뜨려 혼합한 후, 0.1 N NaOH로 엷은 분홍색이 나올 때까 지 적정한 다음, 중성 포르말린 용액 5 mL를 넣어 원래 색 으로 돌아오게 하고 0.1 N NaOH로 엷은 분홍색이 나올 때 까지 적정하여 그 값을 표시하였다. 환원당은 여과액을 취 하여 DNS(Dinitrosalicylic acid)법[17]을 일부 변형시켜 분 석하였다. 즉, 25 mL 메스플라스크에 시료 당 용액 1 mL(시 료 희석액 1 mL 중에 당 0.2~2 mg 함유)와 DNS시약 3 mL 를 넣고, 5분간 중탕·냉각시킨 후, 물을 가하여 25 mL로 채워 흡광도(550 nm)로 측정하였고, 환원당 함량은 glucose 표준곡선으로 계산하였다.
결과 및 고찰
밀기울 첨가 비율에 따른 액체종국의 배양학적 특성 액체종국의 배양최적조건을 검토하기 위해, 액체배지에 밀 기울 농도(0, 5, 10, 15 및 20% (w/v))별로 첨가하고, 여기 에 R. oryzae N174를 배양한 후, 이들의 특성을 Table 1에 나타내었다. 액체종국의 pH는 밀기울을 첨가한 시료는 pH 4.0 이상으로 적정하였고, 산도와 아미노산도는 밀기울 첨가량이 많을수록 배지 내 영양분이 풍부하여 R. oryzae N174가 경시적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 이것은 Rhizopus 속 곰팡이가 다른 종류의 곰팡이보다 젖산이나 푸 마르산을 많이 생산한다는 보고[25, 27]에서처럼 밀기울에서 Rhizopus 속 곰팡이의 생육속도가 빨라 각종 유기산을 생성 함으로써 산도가 높아진 것으로 추측된다. 액국의 균사체 생 성능을 살펴보면, 밀기울 농도가 높아질수록 균사체 생성량 도 증가하였다. Table 1에서 밀기울 농도가 15% 이상일 때 균사체 생성량은 무첨가 액체종국보다 12.3~17.3배로 증가 되었다. 이러한 결과는 서 등[21]의 결과와 유사하였으며 R.
oryzae N174 곰팡이를 이용한 액체종국 제조에서 밀기울은 균사체 생육의 영양원으로서 역할을 하는 것으로 보인다.
밀기울 첨가 비율에 따른 액체종국의 효소활성 변화 밀기울 첨가비율에 따른 각각의 효소활성 결과를 Table 2 Table 1. Properties of liquid starters prepared with different concentrations of wheat bran.
Concentrations of wheat bran
(%)
pH Acidity (mL)
Amino acidity (mL)
Mycelium (mg/mL) 0
5 10 15 20
3.7 ± 0.21) 4.4 ± 0.5 4.2 ± 0.2 4.2 ± 0.1 4.3 ± 0.0
0.1 ± 0.1 1.3 ± 0.3 2.3 ± 0.2 3.8 ± 0.1 4.9 ± 0.1
trace 0.6 ± 0.1 1.0 ± 0.2 1.5 ± 0.1 1.9 ± 0.0
1.1 ± 0.2 2.4 ± 0.5 5.1 ± 0.7 12.3 ± 1.3 17.3 ± 1.1
1)Mean ± Standard deviation (n=3).
에 나타내었다. 각 효소의 활성은 밀기울 첨가비율에 따라 다른 양상을 띠었다. 전통누룩 제조시 가장 많이 사용하는 원료가 밀기울이므로 누룩의 효소력은 액화력과 당화력 뿐 만 아니라 생전분분해효소의 역할도 상당히 중요하다[7]. 전 통누룩에서 생전분의 당화작용은 Aspergillus 속의 누룩 곰 팡이보다 Rhizopus 속의 곰팡이가 강력하다는 사실은 오래 전부터 알려져 왔다[11]. 특히, 밀기울 5%를 첨가한 액체종 국에서 α-amylase와 glucoamylase는 각각 12.9, 4.74 units/
mL로 acidic protease는 밀기울 15%를 첨가한 액체종국에서 2.23 units/mL로 가장 높은 효소활성을 나타내었다. 따라서, R. oryzae N174 곰팡이를 이용한 액체종국 제조에서 밀기울 첨가비율에 따라 효소종류가 달라지는 것을 알 수 있다.
Table 1에 나타낸 균사체 생성량을 비교해 보면, 밀기울 20%
첨가구에서 균사체 생성량이 가장 많지만 각각의 효소활성 이 낮은 것으로 보아(Table 2) 균사체 생성량과 효소활성과 는 상관관계가 일치하지 않는다는 것을 알 수 있다.
배양시간에 따른 액체종국의 효소활성 변화
위의 결과(Table 2)에서 효소 역가가 뛰어난 5% 밀기울 액 체배지에 R. oryzae N174를 접종하여 배양 시간 별 당화효소 의 활성변화를 Fig. 1에 나타내었다. α-amylase 활성은 경시 적으로 증가하여 72시간에 최고치를 보였으며, glucoamylase 활성은 48시간 배양 시, 가장 높은 활성을 나타내었다. 이것 은 김 등[6]의 연구에서 거미줄곰팡이인 R. oryzae N174가 내는 α-amylase 생산 최적 배양시간인 48~72시간과 비슷한 결과를 보였다.
저장조건에 따른 형태학적 변화
Fig. 2는 저장 5일 후, 각 저장온도에서의 밀기울 액체종 국을 나타낸 것이다. 육안으로 보기에도 저장온도에 따른 균 사체 생육의 차이를 알 수 있었다. -18oC와 4oC에서 저장한 액체종국을 저장 전과 비교해 보면 큰 차이는 없었지만 10oC 에서는 균사체가 많이 생성되어 있었고 25oC에서는 균사체 의 생장은 물론 검은색의 포자가 이미 생성되어 있음을 알 수 있었다. 저장조건에 따른 액체종국의 형태학적 특성을 현 미경으로 살펴본 결과, -18oC에 저장한 액체종국은 저장 1
일째 급격한 냉동에 의해 조직파괴가 진행되었으며, 4oC의 경우는 균사체 성장이 거의 멈춘 상태이고 10oC에서는 균사 체 성장이 조금 진행되었고 25oC에서는 포자가 발생되었다 (Fig. 3A). 3일째는 -18oC에 보관된 액체종국은 이미 냉동에 의해 균사체가 손상을 입은 상태이고 4oC의 경우, 균사체가 서서히 자라면서 포자를 형성하려는 단계이며 10oC는 균사 체가 자라면서 포자를 형성하고 있었다. 더욱이, 25oC에서는 이미 포자가 왕성하게 형성되어 액체종국 표면에 포자가 떠 다니는 상태였다(Fig. 3B). 저장 5일째는 큰 차이 없이 -18oC 에 보관된 액체종국은 R. oryzae N174의 균사체 격막 (septum)에서 조직붕괴가 현저하게 진행되었으며 4oC에서는 포자형성이, 10oC는 포자가 왕성하게 진행되었고 25oC에서 는 검은색 포자가 액체종국 전체를 뒤덮은 상태였다(Fig.
3C).
제조된 밀누룩의 이화학적 특성변화
위의 결과를 토대로 거미줄 곰팡이인 R. oryzae N174의 액체종국 배양은 5% 밀기울 배지와 72시간 배양이 가장 최 적조건이었다. 액체종국으로 밀누룩을 제조하여 저장온도와 Table 2. Enzyme activities of liquid starters prepared with
different concentrations of wheat bran.
Concentrations of wheat bran (%)
Enzyme activity (units/mL) α-amylase Glucoamylase Acidic protease 0
5 10 15 20
0.20 ± 2.01) 12.9 ± 0.3 5.22 ± 1.7 4.95 ± 0.1 2.39 ± 0.9
0.35 ± 0.1 4.74 ± 0.7 4.60 ± 0.0 4.60 ± 0.2 3.40 ± 0.1
0.12 ± 1.0 1.81 ± 2.5 1.85 ± 1.5 2.23 ± 0.8 1.36 ± 0.2
1)Mean ± Standard deviation (n=3).
Fig. 1. Changes in enzyme activities of liquid starter during culture time. The optimum condition of liquid starter was 5%
wheat bran in this study. So, cultivation was carried out with the liquid starter of 5% wheat bran.
Fig. 2. Liquid starters after 5 days of storage at different tem- peratures. Symbols: (A) -18oC; (B) 4oC; (C) 10oC; (D) 25oC.
저장기간에 따른 이들의 특성을 조사하였다. Table 3에 나타 낸 것처럼, pH의 경우, -18oC와 4oC에서 저장한 액체종국으 로 접종한 밀누룩은 저장기간 5일까지 계속 증가하는 경향 을 보였다. 특히, 4oC에 저장한 액체종국으로 제조한 밀누룩 에서 완만하게 증가하다가 감소하였다. 제조된 밀누룩 추출
액의 산도와 환원당을 분석해 보면, 저장기간이 길어질수록 이들 값이 감소하는 경향을 볼 수 있었다. 환원당의 경우, 저장 3일째, 급격히 감소하였는데 이것은 Table 4에서 보는 바와 같이 저장 1일째 상승하였던 효소 활성능이 저장 3일 째 급격히 떨어진 것과 상관관계가 있다고 여겨진다. 저장 Fig. 3. Changes in morphology of Rhizopus oryzae N174 fungi in liquid starters at different temperatures during storage. Symbols:
(A) 1 day; (B) 3 days; (C) 5 days; (1) -18oC; (2) 4oC; (3) 10oC; (4) 25oC.
Table 3. Changes in cultural characteristics of wheat grain nuruk with liquid starters of different storage conditions.
Storage periods (days)
Temperature (oC)
-18 4 10 25
pH
0 1 3 5
5.18 ± 0.21) 5.22 ± 0.1 5.40 ± 0.1 5.61 ± 0.0
5.18 ± 0.2 5.24 ± 0.0 5.32 ± 0.1 5.47 ± 0.1
5.18 ± 0.2 5.22 ± 0.0 5.46 ± 0.1 5.37 ± 0.1
5.18 ± 0.2 5.33 ± 0.2 5.40 ± 0.0 5.34 ± 0.0 Acidity of
liquid starter (mL)
0 1 3 5
1.27 ± 0.1 1.20 ± 0.1 0.87 ± 0.1 0.70 ± 0.2
1.27 ± 0.1 1.37 ± 0.2 1.10 ± 0.3 0.77 ± 0.1
1.27 ± 0.1 1.43 ± 0.1 1.10 ± 0.1 0.73 ± 0.1
1.27 ± 0.1 1.27 ± 0.1 1.27 ± 0.1 0.83 ± 0.1 Reducing
sugar (mg/mL)
0 1 3 5
17.98 ± 0.2 16.59 ± 2.4 07.20 ± 0.7 04.70 ± 0.4
17.98 ± 0.1 16.97 ± 0.3 6.08 ± 0.5 4.95 ± 1.2
17.98 ± 0.2 18.44 ± 1.6 7.46 ± 1.2 5.35 ± 0.3
17.98 ± 0.2 17.62 ± 0.7 8.96 ± 1.3 5.83 ± 0.9
1)Mean ± Standard deviation (n=3).
기간이 길어짐에 따라 pH는 다소 상승하였고, 이와 반대로 산도는 낮아졌다(Table 3).
제조된 밀누룩의 효소활성 변화
저장온도와 저장기간에 따른 밀누룩의 효소 활성능을 측 정한 결과, 저장 1일째, 25oC에서 저장한 액체종국으로 만 든 밀누룩에서 3종류의 효소활성이 가장 높았다. 이것은 Fig.
3에 나타낸 것처럼, 25oC에 저장한 액체종국(Fig. 3A-4)은 포자와 포자낭이 형성되어 생육 속도가 빠르고 높은 효소 활 성능을 가진 것으로 여겨진다. 균사체의 생육과 포자의 생 성유무에 따른 밀누룩의 효소 활성능에 영향을 미칠 것이라 는 예상과는 달리 각 효소의 활성능과 균사체의 생장, 포자 의 생성과는 큰 차이가 보이지 않았다. 그렇지만, 저장하지 않고 바로 사용한 밀누룩보다는 저장을 하루 정도하고 제조 한 밀누룩에서는 효소 활성능이 급격히 상승하였다. 저장기 간이 3일째 되는 날 모든 효소의 역가가 떨어졌으며 3일째 이후 다시 소폭의 증가 추세를 보였다(Table 4).
요 약
거미줄곰팡이인 R. oryzae N174를 이용한 액체종국 배양 기술을 개발하기 위해, 밀기울 농도별(0, 5, 10, 15 및 20%) 로 액체종국을 제조하여 이들의 품질 특성을 조사하였다. 배 지에 밀기울 첨가량이 많을수록 균사체량이 많아졌을 뿐 아 니라 산도, 아미노산도가 증가하는 특성을 보였다. 또한, 밀 기울을 5% 첨가한 군에서 α-amylase와 glucoamylase의 활 성도가 높았으며 acidic protease의 경우에는 15% 밀기울 첨 가 배지에서 활성도가 높았다. 배양시간 별(0, 24, 48, 72 및 96 hrs) 효소 활성은 48~72시간에 효소활성이 가장 높은 것 으로 나타났다. R. oryzae N174 액체종국 최적조건은 5~15% 밀기울 배지에서 48~72시간 배양이 최적조건이었다.
이를 토대로 밀기울 액체종국을 제조하여 저장온도와 저장 기간을 달리하여 저장한 후, 밀누룩 제조시 종국으로서 적 합한지를 구명하고자 하였다. 제조된 밀누룩의 효소 활성뿐 만 아니라 pH, 산도 및 환원당 함량을 비교 분석한 결과, 저 장온도와 상관없이 하루 정도 저장한 액체종국을 사용하여 만든 밀누룩에서 높은 수치를 보였다. 저장조건에 따른 형 태학적 변화를 살펴본 결과, 저장된 액체종국에서 균사체의 생육과 포자의 생성유무에 따라 밀누룩의 효소 활성에 영향 을 미칠 것이라는 예상과는 달리 각 효소의 활성과 균사체 의 생장, 포자의 생성과는 큰 차이가 보이지 않았다.
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was carried out with the support of “Research Program for Agricultural Science & Technology Development (PJ006764)”, National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Republic of Korea.
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(Enzyme activity: units/g nuruk) Enzymes Storage periods
(days)
Temperature (oC)
-18 4 10 25
α-amylase
0 1 3 5
5.3 ± 2.61) 32.7 ± 1.8 14.2 ± 0.6 13.1 ± 1.2
5.3 ± 2.6 30.2 ± 1.9 12.9 ± 2.0 12.0 ± 0.2
5.3 ± 2.6 31.4 ± 1.5 12.2 ± 0.2 15.7 ± 0.0
5.3 ± 2.6 37.4 ± 3.0 7.9 ± 0.1 9.5 ± 0.6
Glucoamylase
0 1 3 5
35.8 ± 0.1 138.8 ± 0.1 98.3 ± 0.7 13.9 ± 0.1
35.8 ± 0.1 118.2 ± 0.1 14.0 ± 0.0 45.5 ± 0.0
35.8 ± 0.1 193.3 ± 0.2 14.0 ± 0.1 60.1 ± 0.1
35.8 ± 0.1 188.0 ± 0.0 33.6 ± 0.1 33.4 ± 0.0
Acidic protease
0 1 3 5
1622.0 ± 1.0 2295.5 ± 4.5 1297.6 ± 2.2 1804.3 ± 2.9
1622.0 ± 1.0 2700.7 ± 5.1 1096.5 ± 0.8 1160.9 ± 4.1
1622.0 ± 1.0 2225.0 ± 0.8 716.9 ± 4.4 1043.6 ± 1.0
1622.0 ± 1.0 3265.0 ± 2.5 1111.5 ± 1.6 1218.2 ± 0.1
1)Mean ± Standard deviation (n=3).
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