유류오염대수층 고온공기분사공정시 제한효소다형성 미생물 군집
이준호†ᆞ박갑성
한국외국어대학교 자연과학대학 환경학과
Microbial Community in the TPH-Contaminated Aquifer for Hot Air Sparging using Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism
Junho Lee†⋅Kapsong Park
Department of Environmental Science and Engineering, Hankuk University of Foreign Studies (Received 10 April 2007, Accepted 17 December 2007)
Abstract
Hot air sparging is a groundwater remediation technique, in which organic contaminants volatilized into hot air from the saturated to vadose zone. In the laboratory diesel (10,000 mg TPH/kg) was spiked in contaminated saturated aquifer soil. The hot air (34.9±2.7°C) was injected in intermittent (Q=1,500 mL/min, 10 minute injection and 10 minute idle) modes. We performed microcosm tests using the groundwater samples to assess TPH reductive remediation activity. For Terminal- Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) analysis of eubacterial communities in sludge of wastewater treatment plants and soil of experiment site, the 16S rDNA was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from the sludge and the soil. The obtained 16S rDNA fragments were digested with Msp I and separated by electrophoresis gel. We found various sequence types for hot air sparging experiment with sludge soil samples that were closely related to Bacillus (149 bp, Firmicutes), Methlobacterium (149 bp, Euryarchaeotes), Pseudomonas (492 bp, ɤ-Proteobacteria), etc., in the clone library. In this study we find that TPH-water was reduced to 78.9% of the initial value in this experiment aquifer. The results of the present study suggests that T-RFLP method may be applied as a useful tool for the monitoring in the TPH contaminated soil fate of microorganisms in natural microbial community.
keywords : Hot air sparging, Microbial community analysis, Polymerase chain reaction (PCR), Terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), Total petroleum hydrocarbons (TPH)
1. 서 론1)
유류로 오염된 토양 및 지하수를 복원하기 위한 기술로 공기분사공정법(Air Sparging, IAS)이 있는데 이는 오염된 지하 포화대수층, 불포화층의 오염물질을 대기중 공기 주입 을 통해 오염된 지역의 오염농도를 저감할 수 있다. 지하 포화대수층에 있는 휘발성 유기화합물, 석유계 탄화수소류 (Total Petroleum Hydrocarbon, TPH)와 NAPLs층에 포함하 고 있는 물질을 효과적으로 처리하며 이는 지하 포화대수 층(토양층)으로 직접 압을 가해 강제적으로 공기 주입하는 방법이다(Hinchee, 2000; Peterson et al., 2000; US EPA, 1992). 또한 고농도의 유류에 의한 토양 오염에 적용하여 복원할 경우 시간이 경과되면서 휘발성이 낮은 유류 성분 비율이 증가함에 따라 저농도까지도 처리가 쉽고 지하 포 화 대수층에도 적용하기 좋다. 그러나 대기 중으로 방출되 는 배기가스의 2차처리가 필요하며, 이런 문제점에 대한 대처방안으로 여러 측면에서 생각하게 되는데(송정훈 등,
†To whom correspondence should be addressed.
2002; Cline, 1993), 이 중 생물학적 복원법은 높은 비용이 소요되는 소각법과 넓은 대지를 필요로 하는 매립처리법에 비해 비용면에서 경제적이며, 해로운 오염물질의 제거에 비 교적 효과적이다.
상온 공기 주입이 아닌 고온공기 주입의 경우 토양 안에 서 평균 온도가 10°C 증가시 미생물의 활성도는 2배이상 증가된다고 알려져 있다. 또한 200여종의 미생물이 TPH 오염물질에 대해 생물학적 분해에 관여한다고 알려져 있다.
즉, 토양미생물 중 약 20% 정도가 유류계탄화수소 물질을 분해할 수 있는 능력을 가지고 있다고 보고되고 있다. 일 반적으로 친냉성은 12~18°C, 친온성은 25~40°C, 친열성은 55~65°C에서 활발한 것으로 알려져 있다. 고온공기를 점토 질 토양에 주입할 경우 고온에 의하여 수분함량이 감소하 고 토양의 공극이 증가하는 특성을 보이게 되므로 공기 등 과 오염물질의 접촉기회가 증가하게 된다. 고온공기를 이용 하여 생물복원 공정을 적용하는 경우에 토양의 온도를 미 생물 활성도가 가장 양호한 온도로 조절하면 유류오염물의 분해율을 증가시켜 복원기간을 크게 단축시킬 수가 있게 된다.
Table 1. Terminal electron accepting process for toluene oxidation*
Microbial Process Degradation reactions for toluene (C7H8)
Decreasing energy yield
Aerobic degradation C7H8 + 9O2 ⇒ 7CO2 + 4H2O Denitrification 5C7H8 + 36NO3-
+ H+ ⇒ 35HCO3-
+ 3H2O + 18N2
Manganese(IV) reduction C7H8 + 18MnO2 + 29H+ ⇒ 7HCO3
- + 18Mn2+ + 15H2O Fe(III) reduction C7H8 + 36FeOOH + 65H+ ⇒ 7HCO3
- + 36Fe2+ + 51H2O Sulphate reduction 2C7H8 + 9SO42-
+ 6H2O ⇒ 14HCO3-
+ 5H2S + 4HS- Methanogenesis 2C7H8 + 10H2O ⇒ 5CO2 + 9CH4
* : Electron acceptors are shown in bold.
대부분의 토양에는 석유계탄화수소를 분해할 수 있는 토 양미생물(박테리아, 진균류 등)이 풍부하게 존재하며 이 중 약 200여종의 미생물이 석유계탄화수소의 생물학적 분해에 관여하는 것으로 알려져 있다. Cookson(1995)의 연구에서 토양 미생물 중 약 20% 정도가 석유계탄화수소를 분해할 수 있는 능력을 가지고 있다고 보고(송정훈 등, 2002;
Autry and Ellis, 1992)하고 있으며 이들 토양미생물을 이용 한 생물학적 복원 방법이 석유계탄화수소로 오염된 토양을 정화하는데 있어서 가장 비용경제적인 기술로 인정되고 있 다. 또한 지하수에는 그 지역 환경특성에 가장 알맞은 여 러가지 미생물이 살고 있으나 오염물질의 특성, 토성에 따 라 우점하는 미생물종이 다양하게 나타난다. Table 1과 같 은 오염물질로 오염된 토양이라도 전자수용체의 이용가능 성에 의해 크게 좌우하는데 여러 개가 동시에 존재하는 경 우 대부분 에너지 발생효율에 따라 우점종이 결정된다. 최 근 분자생물학적 기술인 무배양적기법을 통해 실제로 미생 물의 군집구조의 분석이 가능하며, 기초적인 정보부터 특성 화된 정보까지 얻을 수 있다. 이를 이용한다면 실제 오염 현장의 이해를 통한 분자생물학적 정화에도 기여 가능할 것이다(김재수, 2006). 적용사례로는 석유로 오염된 대수층 에서 황환원성세균의 개체군을 파악(Kleikemper et al., 2002), PCE나 TCE로부터 ethene까지 완전한 생물학적 분해가 이 루어졌는지를 알기 위한 Dehalococcoide의 개체군을 파악 하는데 이용된 사례가 있다(Smidt and de Vos, 2004). 또한 유류와 토양 미생물이 최적 조건으로 반응하여 정화할 수 있는 온도는 15~45°C에서 생물학적 분해가 일어난다고 알 려져 있다. 문헌에서 제시되고 있는 수분함량이나 온도의 적정범위는 모든 유기화합물질에 적용될 수 있는 수치는 아니고 토성이나 대상오염물질에 따라 달라질 수 있는 광 범위한 조건뿐이다(안난희와 장덕진, 2002).
석유의 탄화수소는 생화학적, 그리고 생태학적으로 많은 종의 미생물에 의해 분해되어진다. 특히 Pseudomonas종은 여기에 매우 중요한 역할을 한다. 기름에 오염된 토양과 오염되지 않은 토양을 통과한 물속에서 미생물 수를 각각 조사해 보았을 때, 기름에 오염되지 않은 토양을 통과한 물에 비해 오염된 토양을 통과한 물에서의 박테리아의 수 는 몇 달 동안 계속 증가된 수치를 보였다. 이러한 현상은 투과된 물에서보다 토양에서 더 강하게 나타났다. 이는 기 름분해 미생물이 토양 입자에 부착되어 성장할 수 있었기 때문이다. 특정 미생물을 석유의 분해에 적용할 때, 종 특
유의 탄화수소 분해효소가 유도된다.
본 연구는 Laboratory simulation 규모 실험으로 지하 10~15 m에서 채취한 현장토양을 가지고, 디젤오염된 대수 층ㆍ불포화층의 오염물질을 저감하기 위한 Lab-scale 규모 의 Air sparging(공기분사공정법) 공법으로 진행하였다. 또 한 상온, 고온 공기 주입시의 반응조 내부의 평균온도와 미생물의 동정 사이의 상관관계를 확인하여 오염물질 이동 및 분해 특성을 파악하고자 하였으며 상온 공기 주입대비 고온 공기 주입시의 오염농도 저감비율, sludge 내부에 존 재하는 미생물 군집들의 유류 오염토양 적용 가능성을 평 가하였다.
2. 연구방법
2.1. 토양 채취
실험 시료 채취는 Fig. 1과 같이 198△년 개장한 규모
￭￭만평의 경기도 하남시 ○○동 장이다. 토양채취는 2004년 1월 2일부터 1월 8일까지 실시되었다. 토양채취 작 업 과정은 관정을 뚫는 Large-케이싱 작업(지표면 지하 5 m 이내) 후에 Small-케이싱 작업(지름 2.54 cm, 지표면 지 하 5~15 m까지)이 끝날 무렵에 지하 포화대수층 토사를 채취하였다. 토사 채취량은 약 180 Kg이었으며, 채취 후 50°C의 건조기 안에서 충분히 건조시킨 후 2 mm의 Sieve 로 걸러주어 퇴적물 입자의 크기를 비교적 고르게 분포시 킨 후 사용하였다(Carter, 1993).
Fig. 1. Location of test site.
2.2. 실험탱크 반응조
Fig. 2와 같이 가로 100 cm, 세로 85 cm, 폭 15 cm 크 기의 2D Plexiglas box(투명 아크릴 두께: 20 mm)를 제작 하여 실험반응조로 사용하였다. 이 반응조에 자연 풍건시킨 토양을 바닥에서부터 60 cm 높이까지 채운 후 N2 gas로 Deoxidization(탈산소)하여 산소가 제거된 물을 바닥으로부 터 40 cm정도 채워 포화층을 만들었고, 윗부분 20 cm는 불포화층이 형성되도록 하였다.
실험반응조 아래 중심에 Sparging diffuser를 설치한 후 Compressor(Italy, Balma)를 사용하여 대기중 공기를 주입 하였다. 또한 실험 목적에 맞도록 주입된 공기가 diffuser에 주입되기 직전에 diffuser heater장치를 이용하여 100~120°C 까지 공기온도를 높였다. 또한 반응조내 토양 온도를 측정 하기 위한 Thermo couple(Autonics, T4WM, PT100)을 12 개 지점에 설치하여 토양내 평균온도를 측정하였으며 토양 및 지하수 sampling point를 12개 설치(LS: Left Sampling, CS: Center Sampling, RS: Right Sampling, LT: Left Ther- mocouple, CT: Center Thermocouple, RT: Right Thermo- couple)하여 물의 액상 또는 토양의 고체시료를 채취할 수 있었다.
N, P 영양소로서 Nitrogen 100 mg/L, Phosphorus 60 mg/L
(a) Photo diagram
(b) Schematics diagram
< 100 cm × 85 cm × 15 cm >
Fig. 2. Schematics diagram of 2 dimension air sparging experi- ment apparatus. (a) photo diagram, (b) schematics diagram
농도로 제조하여 미량펌프(Peristaltic pump 3, MASTER- FLEX, model 7519-05)를 이용하여 날라간 수분만큼 보충 주입하였다. 또한 외부와의 공기 접촉을 막기 위해 밀봉하 였고, 외부의 빛도 차단하였다.
2.3. 토성 측정, 디젤 투입, 슬러지 특징
토성측정 방법은 미국농무성의 USDA(U.S. Department of Agriculture)의 토양삼각도(Calgon test)를 이용하여 분별 하였다. 각각의 체로 분류한 토양에 대한 Average Modal diameter Grains(AMG)를 계산하였다. 사용 토양에 대한 물 리ㆍ화학특성 실험결과는 Table 2와 같다. 디젤 오염물질 은 CS10(C: 가운데, S: 샘플링 포트, Diffuser로부터 10 cm 떨어진 지점)에만 150 mL를 한번 주입하여, 실험 과정 중 포화층 내의 디젤에 의한 NAPLs을 조성하였으며 다른 port에는 디젤을 주입하지 않았다. 여기에서 CS30 및 CS50 은 각각 Diffuser로부터 윗 방향으로 30 cm, 50 cm 떨어진 샘플링 port를 의미한다. 즉, CS10 및 CS30의 토양은 포화 층에 접해 있고 CS50의 토양은 불포화층에 접해 있게 된 다. 실험에 사용된 미생물은 중랑하수처리장에서 채취한 호 기성 및 혐기성 슬러지이다. 호기성 및 혐기성 슬러지를 첨가한 이유는 유류로 오염된 토양에서 공기 주입을 통한 유류오염제거방법을 이용할 경우 공기와 접촉되는 부분 (affected area)과 접촉되지 않는 부분(unaffected area)이 존 재하게 되는데 공기와의 접촉 부분에서 슬러지의 우점종되 는 미생물과 공기와 접촉하지 못하는 부분에서 우점종되는 미생물을 찾기 위해서 호기성 및 혐기성 슬러지를 주입하 게 되었다. 포화대수층에 접하는 6개의 Port(LS30, CS30, RS30, LS10, CS10, RS10)에는 6일마다 각각 호기성 및 혐 기성 슬러지를 혼합(1:1 비율)하여 5 mL씩 주입하였다.
Table 2. Characteristic of sample soil samples used in this study
Soil sample
Classification Experiment sample
Particle size distribution
Sand(%) 0.05~2.00 mm 73.50 Silt(%) 0.002~0.05 mm 8.10
Clay(%) < 0.002 mm 19.50 Soil texture (USDAa)) Sandy loam Cation exchange capacity
(meq / 100 g dry soil) 1.40
Density (g/cm3) 1.43
pH (1:5b)) 6.74
Moisture retention, Field capacity (%) 27.60 Total organic carbon (%) 0.42
Conductivity (μS) 81.1
Porosity 0.34
d50c) (mm) 0.45
Uniformity coefficientd) 4.46
AMGe) (mm) 0.62
※ a)USDA: United States Department of Agriculture; b)1:5: a mass soil:a volume of distilled water; c)d60: sixty drawdown, d50: fifty drawdown, d10: ten drawdown; d)Uniformity coefficient: d60/d10; e)AMG: Average Modal diameter Grains
Table 3. CFU of aerobic and anaerobic sludge
Data R2Aa)
(24h, 37°C)
NBAb) (24h, 37°C)
R2A (24h, 25°C)
NBA (24h, 25°C) Aerobic sludge
(CFU/1 g Sludge) 8.85 × 106 1.45 × 106 4.70 × 105 6.90 × 105
Anaerobic sludge
(CFU/1 g Sludge) 4.00 × 107 5.30 × 105 2.30 × 106 5.30 × 105
※ a)R2A: Oligo Media; b)NBM: Nutrient Broth Media
Table 4. Operating condition for gas chromatograph
Gas chromatograph Hewlett packard 5890 series II
Detector Flame ionization detector (FID)
Detector temperature 300°C
Injector temperature 250°C
Column PTETM-5 FUSED SILICA capillary column
Carrier gas (flow rate) Nitrogen gas (2 mL/min)
Temperature program
Initial time 1 minute
Initial temperature 37°C
Progress rate 19°C/minute to 280°C
Final temperature 280°C (5 minute)
Final time 20°C/minute (to 310°C) and 310°C (30 min)
2.4. Colony Forming Unit 측정
실험 전후 sampling port에 해당하는 곳의 토양을 10 g씩 채취하여 BSM(1% Diesel), R2A, NBM배지를 이용하여 미 생물에 의한 Colony Forming Unit(CFU)변화를 관찰하였다.
그리고 각 배지를 25°C, 37°C에서 배양하여 그 변화 차이 를 비교 분석하였다.
BSM-Agar(Bifidus Selective Medium-Agar, 1% Diesel) 배지는 Fluka(88517) 제품이 사용되었으며, 이 제품은 Bifi- dobaterium logum, Bifidobateriuminfantis와 같은 Bifidobac- terium colonies 분리, 확인 및 성장에 사용된다. 실험순서 는 BSM-Agar 55.5 g을 1 L에 녹인후 pH를 6.8±0.2 (37°C) 에 맞춘 후 121°C에서 15 min (1.5 atm) 간 autoclaving 시 킨 후 45~50°C에서 냉각시킨 다음 116 mg BSM supple- ment(Fluka 83055, 5 mL 증류수에 녹임)를 가한 후 50장 의 Plate를 만들었다.
R2A(Oligo) 배지는 R2A Agar를 18.2 g/L에 녹인 후 121°C에서 15 min (1.5 atm)간 Autoclaving 시킨 후 55°C 에서 냉각시킨 후(pH 7.2±0.2) 50장의 Plate를 만들었다.
NBM(Rich, Nutrient Broth Media, agar X)는 NBM을 8 g/L에 녹인 후 Agar(Powder for Microbiological culture)를 1.5% 넣어준 후 121°C에서 15 min (1.5 atm)간 Autoclav- ing 시킨 후 55°C에서 냉각시킨 후 50장의 Plate를 만들었 다(Table 3).
2.5. 토양 TPH 측정
토양에 흡착되어 남아있는 TPH(Total Petroleum Hydro- carbons)와 물속에 녹아있는 액상의 TPH를 측정하기 위한 Gas Chromatogram(GC)의 조건은 Table 4와 같다.
토양의 TPH는 실험이 끝난후에 Sampling port에서 직접 토양 10 g을 채취하여 M.C.(MetylenCloride) 50 mL에 추
출하여 추출된 용액을 Gas Chromatogram(GC)로 측정(추출 효율 98.5%)하였다. 분석기기는 Hewlett-packard 5890 seriesⅡ GC/FID를 사용하였다. 액상의 TPH는 실험과정 중 에 주사기를 이용하여 채취하였는데, Sampling port에 주사 기 바늘 길이가 15 cm인 주사기를 이용하여 10 mL의 TPH 가 포함된 water를 채취하여 Methylene Cloride(M.C.) 50 mL에 추출하여 5000 RPM으로 Centrifuge한 후 추출된 M.C.를 GC를 이용하여 측정(추출효율 99.0%)하였다.
2.6. 토양 및 슬러지 DNA 추출
실험 전과 반응후의 토양 및 슬러지 시료 미생물의 DNA 증폭 및 PCR(polymerase chain reaction) 반응 저해요소로 작용하는 humic acid를 제거하는 것이 중요하다. 따라서 비 교적 DNA 추출 및 PCR 증폭 효과가 높은 Ultra Clean Mega Prep Soil DNA kit(Mo Bio Laboratories, Inc.)를 사 용하여 토양 및 슬러지의 DNA를 추출하였다. Fig. 3과 같 이 추출된 군집 DNA 내에 16S rRNA gene을 증폭하기 위 하여 pA(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), pH(5'-AAG GAGGTGATCCAGCCGCA-3') primer set(Takara)를 사용하 였다. 최종 반응 조건은 1 ng/μL의 각 sampling site로부터 얻어진 주형 DNA, 0.1 M의 27F, 1492R primer set, 1 μL 의 BSA(Roche), 25 μL의 MgCl2가 포함된 RED RaqTM ReadyMixTM PCR REACTION MIX(Sigma), 그리고 21 μL 의 증류수가 사용되었다. 각 DNA가 추출된 각각 샘플의 PCR 과정은 30 cycles 씩 반복되어 증폭 진행되었으며 그 온도는 95°C(5분간 예열), 95°C(30초간 denaturation), 42°C (30초간 annealing), 72°C(1분간 extension), 그리고 마지막 과정에서 72°C(20분간 extension)의 반응을 거치게 되었다.
모든 반응은 GeneAmp PCR system 9700(Applied biosys- tem)에서 수행되었으며, 오염에 의한 영향을 최소화하기 위
Fig. 3. Direct Extraction of DNA from soil for amplifica- tion of 16S rRNA Gene sequences by Polymerase Chain Reaction.
해서 여과 과정은 laminar flow hood에서 수행되었다. 또한 PCR product들의 amplification 결과를 확인하기 위해 1%
agarose gel 상에 10 μL씩 loading 하여, 100 V, 40분간 전 기영동하였다.
2.7. 미생물의 분석 동정(T-RFLP)
16S rRNA gene을 증폭하기 위하여, 사용된 pA primer는 T-RFLP analysis를 위하여 5’ 말단 부분을 형광 염료(6- Fam)로 변형하였다. PCR 조건은 16S rRNA gene PCR 조 건과 동일하게 실시하였으며, 증폭된 각각의 PCR product 들은 amplification 결과를 확인하기 위해 1% agarose gel 상에 10 μL씩 loading되었으며, 100 V, 45분간 전기영동하 였다. 증폭된 총 80 μL 중 전기영동에 사용된 40 μL를 제 외한 남은 40 μL의 PCR product는 제한효소(Msp I) 절단 과정을 거치게 되었으며, 이 혼합액에 10 × buffer 4 μL와 멸균된 증류수 2 μL, Msp I(5’-C-CGG-3’) 제한효소 4 μL 를 첨가하여 37°C에서 3시간 동안 digestion을 실시하였다.
절단된 단편들 중 10 μL를 취하여 1% agarose gel 상에서 digestion 유무를 확인하였으며, 나머지 30 μL PCR 단편들 은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)에 의해 정제되 었다. RFLP는 특정부위의 염기서열을 잘라내는 제한효소 를 이용하여 같은 패턴을 그룹화하는 절차인데(Braker et al., 2004)인데, 그룹화된 플라스미드를 염기서열분석 전문 회사인 마크로젠(주)에 의뢰하였다.
2.8. 통계 분석
모세관 전기영동으로 측정한 상온공기 및 고온공기 샘플 별로 흡광도 값과 바탕시험 control 흡광도 값과의 차이를 비교하기 위히여 시료샘플별 average well color develop- ment(AWCD) 계산하였다. 여기서 AWCD는 형광염료의 색 변화의 정도를 나타내며, 식 (1)과 같다.
(1)위 식에서 C는 시료샘플의 OD595nm 값을 의미하고, R은
control well의 OD595nm 값, n은 실험횟수를 의미한다. 이를 이용하면 미생물 군집의 잠재적인 능력 및 연관성 파악이 가능하다. 또한 실험 전후 토양 샘플별 그리고 반응조의 위 치별 미생물 군집 유사성을 통계적으로 분석하기 위하여 식 (2)를 이용하여 계산한 값을 이용하여 새로운 변수를 찾 기위한 목적인 Principal Component Analysis(PCA, 주성분 분석) 수행하였다. 이는 관찰된 여러 변수들 중에서 서로 연관성이 있는 변수들끼리 선형 결합 형태로 묶어 몇 개의 잠재 변수(latent variable)로 변수를 축약하는 기법이다.
(2)
PCA data는 샘플별로 나타내었으며, Cid는 OD595nm 값이 고, Rid는 control OD595nm 값이다. AWCDid는 OD595nm의 값 을 의미한다. 이렇게 계산된 PCA data는 0에서 약 4의 값을 가지며, 1보다 작은 경우는 Cid-Rid이 AWCDid보다 작음을 의미하고, 1보다 큰 것은 Cid-Rid이 AWCDid보다 큼을 의미 한다. 이렇게 구해진 수치들의 시료별 편차를 2개의 축 (Principal component 1, PC1; principal component 2, PC2) 으로 하여 유사성을 알 수 있다. 여기에 같은 사분면에 속하 는 시료들은 그렇지 않은 시료에 비하여 상대적으로 유사함 을 의미한다(Garland, 1997). 다만 주성분 분석인 PCA는 표 준화된 자료가 사용되므로 0을 중심으로 자료값이 분포하는 데 중요한 것은 이렇게 얻어진 주성분은 이대로 통계분석이 끝나는 것이 아니라 필요에 따라 다른 통계분석 및 분자생 태학적 미생군 군집 구조 연구와 연계되어야 한다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 토양 평균 온도 및 배지의 CFU
토양내 고온공기가 토양내 주입되기 직전의 온도는 가열 장치를 통하여 약 100~120°C였으나, 2차원적인 실험반응조 구조 및 아크릴 부분이 대기와 접촉하는 부분이 있기 때문 에 실험반응조의 토양내 평균온도는 34.9±2.7°C로 측정되 었다. 또한 상온 공기 주입시를 비교 관찰하기 위하여 상 온 공기 주입시 토양내 평균온도는 24.9±1.5°C로 측정되었 다. Table 5에서는 R2A, NBM, BSM 배지로 실험한 상온 (Room Temperature air 24.9±1.5°C) 및 고온(Hot Tempe- rature air 34.9±2.7°C) 공기 주입시 실험반응조 위치별 colony 숫자이다. R2A(37°C 배양) 배지의 경우 투명 아크 릴 실험 반응조에 고온 공기 주입의 경우 CS10 point(1.01×
106)보다는 CS50 point(3.97×106)에서 CFU 개수가 약 4.0 배 더 많이 관찰되었으며, CS50 point에서만 비교해 보면 상온 공기 주입(24.9±1.5°C)보다는 고온의 공기(34.9±2.7°C) 를 넣어주었을 때 미생물의 CFU 개수가 약 3.3배 더 많이 관찰되었다. NSM(37°C 배양) 배지에서는 고온 공기 주입 의 경우 R2A의 배지보다는 CFU의 개수가 상대적 숫자에 서 약간 적게 측정되었으나 CS50 point에서 상온 공기 주 입 대비 고온 공기 주입의 경우가 3.10 배로 R2A 배지와 비슷하였다. 마지막으로 BSM(1% Diesel 첨가, 37°C 배양)
Table 5. Microcosm colony results of R2A, NSM and BSM in CS50, CS30 and CS10 points Mediaa)
Point R2Ab) NBMc) BSMd)
CS50 (CFU/1 g soil)
Room Temperature air 1.20 × 106 1.02 × 106 16,000
Hot air 3.97 × 106 3.15 × 106 34,000
CS30 (CFU/1 g soil)
Room Temperature air 9.24 × 105 9.59 × 105 6,200
Hot air 1.69 × 106 1.45 × 106 25,900
CS10 (CFU/1 g soil)
Room Temperature 6.45 × 105 9.92 × 105 34,000
Hot air 1.01 × 106 1.87 × 106 14,500
※ a)Media: condition of culture temperature for media: 37°C, 24 hour; b)R2A: Oligo Media; c)NBM: Nutrient Broth Media; d)BSM: Bifidus Selective Media (1% Diesel)
배지에서는 상온 공기 주입의 경우 CS50 point에서 R2A, NSM 배지보다 적은 16,000 CFU가 관찰된 반면에 고온 공기 주입의 경우 비교적 높은 34,000 CFU가 측정되었는 데 이는 BSM배지의 특성(1% Diesel) 때문이라고 사료되 며, BSM배지의 경우 디젤을 분해할 수 있는 균주의 배양 에 조금 더 가깝다고 평가된다. 배지의 CFU 측정 방법을 통하여 상온 공기 주입 및 고온 공기 주입 비교시에 매우 간단한 방법으로 고온 공기 주입의 경우 3배 이상 디젤과 관련된 미생물 및 박테리아 활성에 도움이 된다고 할 수 있다. 또한 R2A, NBM, BSM 배지 중에서 BSM colony를 통하여 디젤 분해 관련 미생물 배양에 쉬운 방법이다. 그 러나 배지 실험 방법은 전체 미생물 및 박테리아의 1% 정 도만 배양이 되는 것으로 알려져 있기 때문에 전체 미생물 군집을 파악하는 것은 힘들다.
3.2. DNA 추출 및 PCR 증폭
상온공기 주입 실험 반응조 CS50, CS30, CS10 port 토 양 시료의 미생물 군집 DNA를 Fig. 4에 나타내었다. Line a, b, c는 각각 CS50, CS30, CS10에 해당되는 DNA 추출 전기영동 사진이며 d, e, f line으로는 각각 CS50, CS30, CS10의 PCR 증폭 사진이다.
Fig. 5는 d, e, f DNA 증폭 산물을 Msp I 제한효소를 통 해 절단 후 QIAquick PCR Purification Kit(QIAgene)을 사 용하여 정제되었다. 이를 65°C, 15 K volts의 모세관 전기 영동 조건에서 형광으로 표지된 T-RF를 분석하고 이를 RDP(Ribosomal Database Project)에 존재하는 모든 미생물 의 16S rRNA gene sequence와 비교되었다.
상온 및 고온공기 분사공정의 T-RFLP 분석결과를 Table 6에 표시하였다. 상온 공기 분사 토양의 T-RFLP의 미생물 군집 분석 결과 실험 초기 64 bp, 138 bp, 449 bp의 미생 물 군집이 소멸한 대신에 58 bp Prevotella, 82 bp Gem- ella, 83 bp Agrococcus, 84 bp Flavobacterium, 144 bp Rhodothermus, 149 bp Thermoanaerobacter, 476 bp Flexi- bacter, 490 bp Pseudomonas, 492 bp Flexibacter, 499 bp Shewanella 등의 새로운 미생물 군집이 생성되었다. 고온 공기 분사에서는 토양 실험 초기 72 bp, 82 bp, 84 bp, 138 bp, 449 bp의 미생물 군집이 소멸하고 83 bp Agroco- ccus, 83 bp Streeptococcus, 138 bp Streptomyces, 138 bp Thermochromatium, 494 bp Pseudomonas 등의 미생물 군
Fig. 4. Genomic DNA extracted from experimental soils and 16s rDNA PCR products. And genomic DNAs from sampling ports CS50(a), CS30(b), and CS10(c) points and PCR-amplified 16s rDNAs from sampling ports CS50(d), CS30(e), and CS10(f) points.
Fig. 5. Schematic diagram of T-RFLP analysis. And electro- phoretograms of Msp I digested PCR amplicons from sampling ports CS50(g), CS30(h), and CS10(i) points.
집이 새로이 생성되었다.
Table 7과 같이 그람음성 철산화균이나 망간산화균, γ -Proteobacteria 그리고 질산화균 군에 속하는 종들이 우점 종을 차지하고 있는 경우가 있는데, 상온 및 공기 주입시 공기 흐름에 속하지 않은 위치에 있는 토양은 혐기적으로 자연저감에 진행중에 있다고 생각된다. 즉, 지하수의 유류 오염물질의 분해는 대수층의 특성에 의해 다양하게 나타나
Table 6. Computer sequencing analysis result of T-RFLP digested with Msp I Samples
Tem.
T-RF Size(bp, base pair) Bacteria [1 day, before experiment]
T-RF Size (bp, base pair) Bacteria [36 day, after experiment]
Room temperature
air sparging
64 bp Bacillus, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobaterium Thiocapsa
138 bp Actinocorallia, Allochromatium, Amoebobacter, Chromatium, Cryptosporangium, Desulfitobacterium, Desulfosporosinus, Desulfotomaculum, Ectothiorhodospira, Eubacterium, Lamprocystis, Marichromatium, Microsphaera, Paenibacillus, Phabdochromatium, Rubrobacter,
Streptomyces, Thermochromatium, Thiocapsa, Thiocystis, Thiohalocapsa, Thiorhodococcus
499 bp Shewanella, Xanthomonas
58 bp Prevotella
82 bp Gemella, Pseudomonas, Ruminococcus, Thauera 83 bp Agrococcus, Capnocytophaga, Pectobacterium, Streptococcus
84 bp Flavobacterium, Kingella, Sporocytophaga 144 bp Dermatophilus, Marinobacter, Microbacterium, Paenibacillus, Pseudomonas, Rhodothermus, Thiomonas 145 bp Bacillus, Kineosporia, Marinobacter, Paenibacillus, Planococcus, Sanguibacter, Sporosaricina 149 bp Thermoanaerobacter
490 bp Pseudomonas, Thodocyclus, Telluria, Thiobacillus, Variovorax, Wolbachia, Ruminococcus 476 bp Flexibacter
492 bp Cytophaga, Flexibacter, Herbaspirillum, Kingella, Methlobacillus, Pseudomonas 499 bp Shewanella, Xanthomonas
Hot air sparging
72 bp Mycobacterium
82 bp Gemella, Pseudomonas, Ruminococcus, Thauera 84 bp Flavobacterium, Kingella, Sporocytophaga 138 bp Actinocorallia, Allochromatium, Amoebobacter, Chromatium, Cryptosporangium, Desulfitobacterium, Desulfosporosinus, Desulfotomaculum, Ectothiorhodospira, Eubacterium, Lamprocystis, Marichromatium, Microsphaera, Paenibacillus, Phabdochromatium, Rubrobacter,
Streptomyces, Thermochromatium, Thiocapsa, Thiocystis, Thiohalocapsa, Thiorhodococcus
499 bp Shewanella, Xanthomonas
83 bp Agrococcus, Capnocytophaga, Pectobacterium, Streeptococcus
138 bp Actinocorallia, Allochromatium, Amoebobacter, Chromatium, Cryptosporangium, Desulfitobacterium, Desulfosporosinus, Desulfotomaculum,
Ectothiorhodospira, Eubacterium, Lamprocystis, Marichromatium, Microsphaera, Paenibacillus, Phabdochromatium, Rubrobacter, Streptomyces, Thermochromatium, Thiocapsa, Thiocystis, Thiohalocapsa, Thiorhodococcus
494 bp Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Zymobacter
Table 7. Anaerobic bateria existing in various environments including groundwater
Phylogenetic group Species References
Methanogens Euryarchaeotes Methanobacterium thermoautotrophicum Klein and Schnorr, 1984
Fe(III)-reducers
Firmicutes Bacillus sp. Nealson and Saffarini, 1994
γ-Proteobacteria Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas sp. Lovely, 1993; Nealson and Saffarini, 1994
Mn(IV)-reducers
Firmicutes Bacillus sp. Nealson and Saffarini, 1994
γ-Proteobacteria Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas sp. Lovely, 1993; Nealson and Saffarini, 1994
Nitrate-reducers
Firmicutes
Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus licheniformis Bacillus stearothermophius Bacillus subtilis
Philippot, 2005
γ-Proteobacteria Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens Philippot, 2005
는데 특히 유류의 대부분을 차지하는 탄화수소화합물은 혐 기적으로 자연저감에 의해 잘 분해되는 것으로 알려져 있 다(김재수, 2006; Warren et al., 2004). 기존의 연구에서 혐 기성 조건에서 오염퇴적물내 PCBs의 생물학적 분해와 PCBs의 생물분해시 우점종인 미생물을 분리하고자 할때 분자 생물학적 방법을 이용하여 순수한 미생물 동정 결과 Pseudoxanthomonas 속으로 밝혀졌다. 따라서 본 연구에서 도 디젤로 오염된 토양 및 지하수에서 T-RFLP의 미생물 군집 변화를 통하여 물리ㆍ화학적 복원 방법과 더불어 생 물학적 복원의 검증 가능성을 보여주는 자료가 될 수 있다
고 생각된다. 그러나 다른 연구에서는 폐기물로 오염된 토 양내 미생물 군집 평가 방법 개발 결과 Psudomonas 선발 특이프라이머를 사용시 오염토양의 평가 지표로서 가능하 다고 주장하였으나, HaeⅢ 1개 제한효소로 사용해 더욱 뚜 렷한 경향성을 찾을 수 없다고 하였다(정성영, 2001). 본 실험에서도 MspⅠ 1개 제한효소만을 사용하였지만 추후 연 구에서는 제한효소의 다양성과 PCR 산물의 시퀸싱을 통한 검정도 필요하며 다양한 제한효소 처리에 의해 구축된 database에서 공통적으로 존재하는 후보군들을 판단하여 여 러 개의 제한효소를 개별적으로 처리하여 T-RFLP 결과를
얻고 오류를 허용하여 결론을 도출하는 Fuzzy 알고리즘을 통해 미생물 동정의 추가 해석이 필요할 것으로 사료된다.
3.3. Cluster diversity
상온(24.5±1.5°C) 및 고온(34.9±2.7°C)공기 주입에 따른 포화 대수층내 미생물 군집의 구조와 다양성을 비교하기 위해 RFLP를 수행하였다. 상온 및 고온 공기 주입 실험 전후의 우점 RFLP 형태를 계통 발생학적으로 분석하여, 미생물 군집 미생물을 Cluster diversity 형태 및 정보와 군 집 구조를 표현하였다. 즉, T-RFLP 양상간의 유사도는 Spea- raman Rank Correlation Coefficient를 사용하여 계산하였으 며, 군집분석에는 UPGMA 알고리즘을 기반으로 excel (Microsoft corporation, USA)와 SYSTAT(Systat Software inc. USA)를 사용하였다. 염기서열의 다양성은 다음의 식 (3), (4)에 의해 계산되었다.
(3)
식 (3)에서 는 시료 내 전체 유전적 다양성, k는 시 료 내 상이한 염기서열의 수, Pi는 i번 염기서열의 빈도, Pj
는 j번째 염기서열의 빈도, dij는 i와 j번째 염기 서열상의 차이를 의미한다. 또한 시료간의 유전적 차이는 를 기반으로 다음의 식 (4)에 의해 계산되었다.
(4)
식 (4)에서 Fst는 군집 간 유전적 차이, 는 모든 시료 의 유전적 다양성, 는 개별 시료의 유전적 다양성을 의 미한다.
Fig. 6의 각 line에 나타난 band는 한 개의 샘플에 대한 시료의 우점종을 나타내는 band 위치를 비교하여 유사도를 구한 것이다. Aerobic sludge와 anaerobic sludge의 경우 약 55%의 유사한 restriction pattern을 보여 주었다. 그리고 room air(1 day)와 room air(36 day)의 경우 멀게 묶여 있 는데, 이는 실험과정중에 미생물의 군집 변화가 일어 났다 고 평가된다. 그러나 hot air(1 day)와 hot air(36 day)은 유 사도가 약 10%였는데 이는 고온 공기 주입으로 인한 미생 물 군집구조가 조금만 변화했을 가능성과 고온 공기 주입 으로 인해 특정 소수 미생물만 군집 형성을 한 것으로 생 각된다. 실험 과정 중에 주기적으로 첨가한 호기성 슬러지 와 혐기성 슬러지의 경우 83 bp가 우점 종인 Agrococcus, Capnocytophaga, Pectobacterium, Streptococcus가 측정되었 다. 이는 호기성과 혐기성 슬러지는 미생물의 군집이 거의 비슷했는데 같은 시간에 같은 라인과 연결된 중랑 하수처 리장의 슬러지 샘플이기 때문이라고 사료된다. 또한 상온 공기 주입결과 145 bp가 우점종에 해당되었는데 주로 Bacillus, Kineosporia, Marinobacter, Paenibacillus, Plano- coccus, Sanguibacter, Sporosaricina가 나타났으며, 상온 공
Fig. 6. Cluster analysis of T-RFLP profiles generated by Msp I digestion of amplified 16S rDNA clone lib- raries in sludge and room air/hot air temperature sparging samples.
Fig. 7. Cluster analysis of T-RFLP profiles generated by Msp I digestion of amplified 16S rDNA clone lib- raries in sludge and hot air sparging samples (CS 50, CS30 and CS10 point).
기 주입 실험 종료 시점에서는 146 bp의 종들이 측정되었 는데, Amycolatopsis, Bacillus, Cellulomonas, Clostridum, Listeria, Microbispora, Planococcus, Pseudomonas가 종을 이루었다.
Fig. 7은 고온 공기 주입시 샘플링 높이(CS50: 불포화층 토양, CS30: 포화층 토양 CS10: air diffuser 근처 포화층 토양)에 따른 미생물 군집 종이의 계통 발생학적 특징을 보여주고 있다. 고온공기 주입시 1일에는 CS30 port와 CS10 port가 약 68% 유사도를 보였으며, 36일 실험 종료 후에는 CS30 port와 CS10 port가 약 82% 유사도가 높아졌 다. 이는 상온 및 고온 공기 주입시 미생물 군집 종이 계 통 발생학적으로 군집이 형성했다는 것을 보여 주고 있다.
호기 및 혐기 슬러지와 상온 및 고온 공기 주입 시료 T-RFLP profile의 Principal Component Analysis(주성분 분 석)을 Fig. 8에 도식하였다. 그리고 factor loading plot의 분 석결과 PCA 1, PCA 2로 설정하여 다양성 지수는 50.0%로 설명이 가능하였다. 호기성과 혐기성 슬러지는 하나의 미생 물 군집인 1군으로 실험 토양에 있어서는 상온 공기 주입 (1일)이 제 2군, 상온 공기 주입(36일), 고온공기 주입(1일),
Fig. 8. Factor loading plot of T-RFLP profiles generated by Msp I digestion of amplified 16S rDNA clone lib- raries in sludge and room temperature/hot air spar- ging samples.
고온공기 주입(36일)이 제 3군으로 분류되었다. 유사도면에 서는 상온공기 주입(36일)과 고온공기 주입(1일), 고온공기 주입(36일)이 유사도가 높은 군에 속하였다. 상온 공기 주 입(1일)과 고온공기 주입(1일)의 미생물의 군집을 따로 묶 여서(호기성 및 혐기성 슬러지, 상온공기 시작점, 상온 및 고온 공기 종료점)에 분류되어진다는 것은 분사공정 중 미 생물들이 자신만의 안정화 단계로 움직이고 있다는 것을 보여 주는 것으로 판단된다. 그러므로 미생물의 변화 과정 중에 미생물 순응단계를 나타낸 주성분 분석이라 볼 수 있 을 것이다. 그러나 정확한 T-RF의 크기가 일치하지 않은 것은 분석과정에 있어서 약간의 오차가 있었던 것으로 생 각된다. 이와 함께 TPH 농도 감소 실험 결과 CS10 sampling port에 10,000 ppm 양의 디젤을 주입 후 상온공 기(24.9±1.5°C) 및 고온공기(34.9±2.7°C) 분사 후 36일후에 포화대수층상의 토양농도를 측정하였다. 그 결과 상온공기 분사 주입의 경우 초기 1,000 mg/L에서 254 mg/L로 74.0% 디젤 농도가 감소하였으며, 고온공기 분사 주입에서 는 초기 1,001 mg/L에서 211 mg/L로 78.9%가 제거 되었 다. 최저 254 ppm(mg/kg)에서 최고 895 ppm(mg/kg)의 분 포를 보였다. 이는 간헐적 실험시 공기 Channel이 붕괴ㆍ 소멸될 때 공기 Channel의 영향이 덜 미치는 지역에서의 오염원과 지하수가 공기 Channel로 이동하는 효과와 공기 Channel을 통과하는 공기입자가 기-액 평형 그리고 수리전 도도를 증가시켜 주입된 공기의 충분한 체류시간으로 공기 Channel 내에 정체하여 산소전달효과가 좋게 작용하기 때 문이며 고온 공기 주입에 따른 생분해 효과 증진에 있었다 고 생각된다. 또한 실험 과정 중 사용한 sludge의 영향에 의해 같은 실험 공정을 진행하였음에도 불구하고, 실험 전, 후의 미생물 군집이 다른 양상을 보이고 있었다. 이는 첨 가된 sludge 내부에 존재하는 미생물 군집은 일반적인 토 양에 존재하는 미생물 군집에 비해 좀 더 복잡한 구조를 가지고 있음을 암시하는 것이며, 첨가된 유기물질을 이용하 여 번식할 수 있는 미생물 군집들이 토양 미생물 군집에 비해 다량으로 존재함을 암시한다고 볼 수 있다.
Fig. 9. Factor loading plot of T-RFLP profiles generated by Msp I digestion of amplified 16S rDNA clone lib- raries in sludge and hot air sparging samples (CS50, CS30 and CS10 point).
Fig. 9와 같이 호기성․혐기성 슬러지는 같은 미생물 군 집으로 묶었다고 할 수 있으며 Component Analysis의 분석 결과 PCA 1, PCA 2로 설정하여 다양성 지수가 44.2%로 상온공기 주입과 고온공기 주입비교(Fig. 8)보다 낮아졌다.
이는 고온 공기 분사시 주변 온도 조건에 가장 적합한 특 정 미생물 군집만 순응한 것으로 여겨진다. PCA 1, PCA 2 분석결과 상온공기 시작점의 1일 CS50, CS30, CS10가 같은 미생물군 사면체로 실험 종료점인 36일 CS50, CS30, CS10 이 같은 미생물군 사면체로 분류되었다. 이러한 결과는 미 생물 순응과 더불어 생분해가 이루어지고 있다는 사실을 제시하고 있다. 대체적으로 PCA 1, PCA 2에 의해서 고온 공기 시작점의 CS50, CS30, CS10 point 모두 같은 미생물 군집으로 묶었으며, 실험종료 시점에서 CS50, CS30, CS10 point 모두 같은 미생물 군집으로 묶을 수 있다. 또한 상온 공기 주입는 달리 고온 공기 주입 실험에서 Principal Com- ponent Analysis(주성분 분석)에 있어서 더 높은 신뢰를 가 지고 설명이 가능하다고 사료된다. 실험 과정 중 사용한 sludge의 영향에 의해 같은 실험 공정을 진행하였음에도 불구하고, 실험 전, 후의 미생물 군집이 다른 양상을 보이 고 있었다. 이는 첨가된 sludge 내부에 존재하는 미생물 군 집은 일반적인 토양에 존재하는 미생물 군집에 비해 좀 더 복잡한 구조를 가지고 있음을 암시하는 것이며, 첨가된 유 기물질을 이용하여 번식할 수 있는 미생물 군집들이 토양 미생물 군집에 비해 다량으로 존재함을 암시한다. 또한 복 잡 다양한 환경 내 존재하는 미생물의 군집 및 구조를 분 석하는데 있어서 T-RFLP 분석방법을 이용하면 다양한 미 생물 구성 및 구조를 밝히는데 유효하다는 결론을 얻었다.
또한 다양한 미생물로 이루어진 미지의 토양 시료에 대한 T-RF에 상응하는 미생물을 정확하게 동정하는 것은 한계 가 있으므로 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 하나의 샘플 시료에 대해 다양한 제한효소를 처리하고 각각의 제 한효소로 처리된 시료에서 측정된 말단 단편을 database와 비교하여야 할 것으로 판단된다. 그리고 다양한 제한효소 처리에 의해 구축된 database에서 공통적으로 존재하는 후
보군들을 판단하여 여러 개의 제한효소를 개별적으로 처리 하여 T-RFLP 결과를 얻고 오류를 허용하여 결론을 도출하 는 Fuzzy 알고리즘을 통해 미생물 동정의 추가 해석이 필 요할 것으로 사료된다. 그러나 T-RFLP법은 토양 시료에 존재하는 미생물 종 조성 또는 군집구조를 상호 비교하는 측면에 있어서 효휼적인 방법 중의 하나라고 판단된다.
T-RFLP 분석법과 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 분석법으로 해양 미생물 군집의 비교를 한 연구에 서도 operational taxonomic unit(OTU)의 탐지에 있어 T- RFLP 분석법의 민감도가 우수하였다(Garland, 1997). 또한 물리․화학적 측면에서 볼 때 Lab-scale의 공기분사공정 실 험 결과 위 실험 결과 이외에 정확한 복원 효율을 도출해 내기 위해서는 실내실험, 오염물질의 특성, 공기확산기의 모양변화에 따른 실험, 컴퓨터 모델링 그리고 현지 미생물 군집실험사이의 분석이 필요하다. 또한 토양 깊이에 따른 복원 효율이 다르므로 정확한 토양평가가 이루어질 수 있 을 때, 오염된 지하수ㆍ토양에 대한 적절한 복원 방법을 설계를 할 수 있을 것이다.
4. 결 론
본 연구는 유류로 오염된 포화대수층의 정화방안의 하나 로 고온 공기분사공정(Hot Air Sparging)에 의한 오염된 포 화대수층 복원의 현장적용 가능성, 실험 전․후의 미생물 군집 변화 가능성을 평가하는 실험이다. 토양 반응조에 고 온 공기주입결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1) 고온 공기 주입시 실험 전과 비교하여 83 bp Agrococ- cus, 83 bp Streeptococcus, 138 bp Streptomyces, 138 bp Thermochromatium, 494 bp Pseudomonas 등의 새로 운 미생물 군집이 발견되었는데, 이들은 보통 혐기성 그 람음성 철산화균이나 망간산화균, γ-Proteobacteria 그리 고 질산화균 군에 속하는 종들이다. 또한 이들은 추가적 으로 유류 오염 대수층에 관여하는 미생군 군집으로 알 려진 Bacillus(149 bp, Firmicutes), Methlobacterium (149 bp, Euryarchaeotes), Pseudomonas(492 bp, ɤ-Proteo- bacteria)과 유사한 염기서열 클론 우점종이었다.
2) 고온 공기 주입시 Principal Component Analysis 분석에 있어서 총 6개의 다른 T-RFLP 형태가 확인되었으며 492bp가 우점종인 Cytophaga, Flexibacter, Herbaspirillum, Kingella, Pseudomonas, Ruminococcus 종들이 주종을 이 루었다.
3) PCA 1, PCA 2 다양성 지수는 44.2%이였으며 미생물의 군집은 [호기성 및 혐기성 슬러지] → [상온공기 주입 시작점] → [상온 및 고온 공기 종료점]로 변화하는 것 을 관찰할 수 있었다. 이는 실험과정중에 환경에 적응한 미생물 군집들이 자신만의 안정화 단계로 움직이고 있 다는 증거로서 순응(Acclimation) 단계를 보여주는 Factor 분석으로 보면 타당할 것으로 사료된다.
4) 실험 과정 중 사용한 sludge의 영향에 의해 같은 실험 공정을 진행하였음에도 불구하고, 실험 전, 후의 미생물
군집이 다른 양상을 보이고 있었다. 이는 첨가된 sludge 내부에 존재하는 미생물 군집은 일반적인 토양에 존재 하는 미생물 군집에 비해 좀 더 복잡한 구조를 가지고 있음을 암시하는 것이며, 첨가된 유기물질을 이용하여 번식할 수 있는 미생물 군집들이 토양 미생물 군집에 비해 다량으로 존재함을 암시한다.
사 사
본 연구는 2007년도 한국외국어대학교 교내학술연구비 지원에 의하여 수행되었습니다.
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