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이학 석사학위 논문
나노섬유를 기반으로 한 3차원 환경에서 면역세포와 폐 상피세포의
공배양에 대한 연구
A study on co-culture of immune cells and lung epithelial cells in a three-dimensional
environment based on nanofibers
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
신 정 인
나노섬유를 기반으로 한 3차원 환경에서 면역세포와 폐 상피세포의
공배양에 대한 연구
지도교수 곽 종 영
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2021 년 2 월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과
신 정 인
감사의 글
어느새 시간이 흘러 석사과정을 마치며 학위 논문을 제출하게 되었습니다.
학위 논문을 작성하며 저 혼자서는 절대 할 수 없었을 것이라는 생각이 듭니다.
곽종영 교수님께 처음 인사드리던 날을 잊지 못합니다. 실험에 대한 흥미만 가지고 무작정 진학하였고 교수님께서는 연구는 어떻게 하는 것인지, 다양한 시각으로 바라보라며 찬찬히 자세하게 지도해 주셨습니다. 17 년도 찬바람이 불던 겨울, 처음 등교하던 날의 앙상한 나뭇가지처럼 아무것도 모르던 저를 교수님께서 지도해 주셨기에 지금의 작은 결실을 맺은 제가 있을 수 있다고 생각합니다. 지금도 부족한 면이 많이 있지만 교수님의 그 동안의 가르침이 앞으로의 제 앞날에 빛나는 초석이 되었습니다. 석사과정에서 교수님의 가르침을 가슴에 새기며 앞으로 나아가겠습니다. 다시 한번 감사드립니다.
그리고 한 공간에서 실험하며 함께 지내온 실험실 식구들에게도 감사드립니다. 실험에 대해 여러 의견을 주시며 방향성을 제시해주신 유민숙 박사님, 실험에만 열중할 수 있게 해주시고 하루에 한 번 웃음 주신 전혜영 선생님, 처음 학기를 시작할 때부터 동기로서 늘 옆에서 든든한 도움이 되었던 민호, 긍정적인 생각으로 위로와 힘이 되어주었던 상원, 실험에 도움이 되어준 용수, 같이 실험도 하고 힘든 일 도맡아 해준 지현, 한 학기 밖에 같이 못했지만 많은 웃음을 준 규민, Perry! who always smiled. Thanks for talking first.
마지막으로 저에게 아낌없는 지원과 격려해 주신 부모님께 감사드립니다.
저의 결정을 믿어주시고 기다려주셔서 감사합니다. 철없는 동생의 하소연도 곧잘 들어주던 형에게도 감사드립니다. 부족하지만 저를 격려해 주시고 힘이 되어 주신 모든 분들께 다시 한번 감사드립니다. 더욱 노력하여 발전하는 모습 보여드리겠습니다.
신정인 드림
요 약
일반적인 세포 배양 시 사용하는 세포배양접시와 같은 2차원 환경과 체내 해당 조직 내 미세환경의 차이가 있어, 세포 실험과 임상실험에서의 결과의 차이가 난다. 2차원 환경에서는 공배양 환경을 구현하기 힘들기 때문에 이를 보완하기 위하여 세포가 평면적인 2차원의 구조가 아닌 입체적인 3차원의 형태를 갖출 수 있는 나노섬유 환경에서 배양함으로써 체내 유사 환경을 구현할 수 있다. 나노섬유를 기반으로 한 3차원 환경에서 면역 세포와 폐 상피 세포의 공배양 환경을 구축하여 이를 토대로 비임상 모델을 개발할 수 있다.
Poly ε-caprolactone (PCL) 나노섬유는 chloroform을 용매로 하여 전기방사(electrospinning)를 통해 제작된다(이하 C-PCL). 이런 공배양 환경을 구축하기 위해 3차원의 나노섬유를 2개의 층으로(Two-layer) 만들어 공배양 환경을 구축한다. C-PCL을 상층(Transwell)과 하층(24 well 세포배양 접시)에 부착하여 공배양 환경을 구축한다. 천식 모델을 구현하기 위해 알레르겐으로 가장 잘 알려진 세로무늬 먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinu)에 의해 생성되는 단백소화효소(이하 Der p)를 이용한다.
세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에 수지상세포를 배양하여 Der p를 농도별로 처리하여 수지상세포의 활성도를 측정한 후, Der p의 적절한 농도를 결정한다.
결정된 Der p의 농도를 기반으로 마우스 폐 상피세포의 배양일을 결정한다.
이후 2개의 층으로 C-PCL을 부착하였고, 상층에는 폐 상피 세포인 MLE-12 세포를 배양하고 하층에는 면역 세포를 배양한다. 그 후 2개의 층을 조립하여 공배양을 환경을 가능하도록 했다. 나노섬유를 기반으로 한 3차원 공배양 환경에서 Der p를 처리하였을 때, 면역 세포와 폐 상피 세포에서 분비되는 사이토카인을 측정하고, 이를 바탕으로 나노섬유를 기반으로 한 3차원 환경에서 면역세포와 폐 상피 세포의 공배양을 실현시켜 천식 모델로 사용 될 수 있다.
핵심어 : 나노섬유, 공배양, 3차원 세포배양, 면역세포, 폐 상피세포
차 례
요약•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ⅰ 차례•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ⅱ 그림차례•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ⅳ
Ⅰ 서론••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
Ⅱ 실험재료 및 방법••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3 A. 실험재료••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3 B. C-PCL 나노섬유의 전기방사 및 제작•••••••••••••••••••••••••••••••3 C. 마우스 골수에서 수지상세포 채취•••••••••••••••••••••••••••••••••••4 D. MLE-12 세포배양•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••4 E. 나노섬유를 2개의 층으로 만드는 공배양 환경••••••••••••••••••••••••5 F. 세포 면역 화학 염색법(Immunocytochemistry)•••••••••••••••••••••5 G. 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)••••••••••••6 H. 공초점 레이저 현미경(Confocal laser microscope)••••••••••••••••••7 I. 효소 결합 면역 흡착 검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••7 J. 사이토카인 배열 키트(Cytokine array kit)•••••••••••••••••••••••••••7
Ⅲ 결과••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9 A. C-PCL 나노섬유의 형태•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9 B. C-PCL 나노섬유에서 마우스 수지상세포와 폐 상피세포의 부착••••••10
C. 마우스 수지상세포에 다양한 농도의 Der p 처리••••••••••••••••••••12 D. 마우스 폐 상피세포의 밀착연접 형성과 Der p 처리•••••••••••••••••16 E. C-PCL 나노섬유에서 마우스 폐 상피세포 관찰•••••••••••••••••••••18 F. 나노섬유를 기반으로 3차원 공배양 환경에서 세포 관찰•••••••••••••20 G. 공배양 환경에서 배양한 세포의 배양액에서 사이토카인 측정•••••••••23 H. 공배양한 환경에서 배양액의 사이토카인 배열 키트•••••••••••••••••25
Ⅳ 고찰•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••27
Ⅴ 결론•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29 참고문헌••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••30 ABSTRACT••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••33
그림 차례
그림 1. C-PCL 나노섬유에서 수지상세포와 MLE-12 세포의 형태••••••••11 그림 2. 세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 배양한 수지상세포에 다양한 농도의 Der p••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13 그림 3. C-PCL 나노섬유에서 배양한 수지상세포에 Der p 처리하여 효소 결합 면역 측정(ELISA)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15 그림 4. 세포배양접시에서 MLE-12 세포의 밀착연접 형성과 Der p 처리••17 그림 5. C-PCL 나노섬유에서 수지상세포와 MLE-12 세포 관찰••••••••••19 그림 6. 나노섬유를 2개의 층으로 만드는 공배양 환경의 실험 모식도••••••21 그림 7. 나노섬유 공배양 환경에서 수지상세포와 MLE-12 세포의 관찰••••22 그림 8. 수지상세포와 MLE-12 세포의 단일 배양과 공배양 사이토카인 비교••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••24 그림 9. 수지상세포와 MLE-12 세포를 공배양한 배양액의 사이토카인 배열 키트••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
Ⅰ. 서 론
천식은 성인 및 소아에서 지난 몇 년간 계속 증가하고 있다[1-4]. 천식은 유전적(면역에 관여하는 유전자) 요인[5,6], 알레르겐(항원)의 자극[7] 혹은 환경인자(바이러스 감염과 같은)[8] 등이 천식에 발병률과 관련이 있다고 알려져 왔다. 천식의 정확한 병리기전은 아직까지 밝혀지지 않았으나 주로 알려진 것은 외부 항원에 대한 면역반응의 발생으로 항원 특이 면역글로불린 E(immunoglobulin E, IgE)의 생성으로 받아들여지고 있다[9]. 알레르겐에 노출되었을 때, 감작 항체로서 IgE의 급작스런 발현 증가가 이루어지며, 이 Ig E에 의해 알레르기와 같은 염증성 손상이 일어난다. 여러 가지 알레르겐 중에서 집 먼지 진드기는 세계적으로 호흡기 알레르기를 일으키는 질환에서 가장 잘 알려져 있다[10]. 집 먼지 진드기는 좀진드기의 일종으로 직접적으로 피해를 주지는 않으나 분변 배설물이나 죽은 충체에서 발생하는 알레르겐으로 알레르기성 천식, 비염, 결막염과 피부염을 일으킨다[11-13]. 집 먼지 진드기과 중에서 잘 알려진 세로무늬 먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)에 의해 생성되는 단백소화효소(Der p)를 이용한다.
상피세포의 밀착연접은 서로 인접한 상피세포들을 연결하고 세포나 물질의 이동을 차단하기 때문에 외부의 항원이나 병원성 미생물로부터 침투를 억제 한다. 상피세포 간의 밀착연접은 알레르겐 자극에 의해 손상된다. 알레르겐의 특징은 상피세포 사이의 밀착연접을 손상시켜 피부의 진피층까지 침투하여 면역세포를 활성화시킨다.
세포배양접시와 같은 일반적인 2차원 환경에서의 세포배양의 단점은 다른 유형의 두 세포를 동시에 배양하기 힘들다는 점이다. 이러한 단점 때문에 2차원 환경에서 공배양을 하기 위해서 대부분 하이드로겔이나 콜라겐을 사용하여 실험한다[14-16]. 일반적으로 사용하는 세포배양접시와 같은 2차원에서의 단점을 보완하기 위하여 세포를 입체적인 3차원의 형태로 배양할 수 있는 나노섬유를 개발하고 사용하였다[17]. 3차원의 나노섬유를 이용하면
마치 생체 내에서와 비슷한 세포의 형태를 관찰할 수 있다. 그러나 3차원 환경에서 마우스 폐 상피세포의 유무에 따라 면역세포의 영향을 확인할 수 있는 연구가 없었기 때문에, Der p의 자극 유무에 따라 마우스 수지상세포와 폐 상피세포가 서로에게 미치는 영향과 사이토카인에 대한 연구를 하였다.
나노섬유는 세포 외 기질과 유사한 공간적인 구조를 구현하여 세포를 3차원으로 배양하기 위해 개발되었다[18,19].
나노섬유를 제작하는 방법으로 전기방사를 통해 poly ε-caprolactone (PCL), poly vinyl alcohol (PVA)을 포함한 다양한 나노섬유를 만들 수 있다[20]. 나노섬유의 섬유 가닥의 직경 차이, 공극 크기의 평균이나 공극의 분포에 따라 나노섬유의 형태가 다양하고 나노섬유의 형태의 따라 세포 부착이나 증식에 있어 차이가 있다[21,22]. Chloroform을 용매로 전기방사로 제작한 C-PCL 나노섬유는 다양한 세포에 대해 생체 적합성이 높기 때문에 세포의 부착, 성장, 분화 및 증식을 위해 사용되어 왔다[23,24]. 이전까지의 연구에서 C-PCL 나노섬유를 이용한 마우스 면역세포와 폐 상피세포의 공배양이 적합한 지 확인되지 않았다. 이 연구에서는 생체 내 폐 상피세포와 면역세포의 반응을 모방하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해 전기방사된 C- PCL 나노섬유를 이용하여 3차원 환경에서 마우스 수지상세포와 폐 상피세포주인 MLE-12의 부착 및 증식을 확인하였다. 마우스 수지상세포와 폐 상피세포간에 서로 미치는 영향으로 세포의 성장이나 세포의 모양을 확인하기 위해 C-PCL 나노섬유를 2개의 층으로(Two-layer culture system) 3차원 환경을 구축하여 공배양하였다. Der p 자극 유무에 따른 수지상세포와 폐 상피세포 단독 배양과 공배양간의 분비되는 사이토카인에 대해 조사 및 분석하였다.
Ⅱ. 실험재료 및 방법
A. 실험재료
PCL (Mn = 700,000-900,000), Dimethyl Sulfoxide, Dimethylformamide (DMF), 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), DMEM F-12 medium (ATCC), DMEM 1640 medium (Welgene), penicillin/streptomycin (Gibco), Trypsin- ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)(Welgene), CD11c MicroBeads UltraPure (MACS), Anti-Ly-6G- MicroBead Kit (MACS), anti-F4/80 MicroBeads (MACS), Der p (Prolazen), Lipopolysaccharide from Escherichia coil (LPS)(SIGMA), Antibody Diluent OP Quanto (Thermo),anti-ZO-1 antibody (Invitrozen), Phalloidin-FITC (Sigma), Anti-CD86 antibody (abcam), Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rabbit Ig G (Invitrogen), 3% Thioglycollate, Traswell 24well (Corning), Polydimethylsiloxane (PDMS)(Corning), Mouse TNF-α Duoset ELISA (R&D), Mouse IL-23 Duoset ELISA (R&D), Mouse Cytokine Array Kit Panel A (R&D)를 사용하였다.
B. C-PCL 나노섬유의 전기방사 및 제작
다공성 PCL 나노섬유는 앞서 발표된 논문의 방법에 따라 제작하였다[25].
PCL 을 99.5% pure chloroform 에 15%로 용해시켜 5 시간 동안 교반하여 균일한 용액을 얻었다. 나노섬유는 전기방사(NanoNC, Seoul, Korea)를 통해 제작하였다. 전기방사된 섬유의 형태는 주사 전자 현미경(SEM) SEM4500 모델(Sec, Suwon, Korea)을 사용하여 관찰 및 촬영하였다. 전기방사로 제조된
나노섬유는 70% 에탄올 용액을 처리하여 12 시간 동안 UV 노출시켜 건조, 멸균하여 사용하였다.
C. 마우스 골수에서 수지상세포 채취
C57BL/6 마우스는 아주대학교 의료원 실험동물연구센터의 동물 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 관리 및 사용하였다. 골수 유래 수지상세포는 이전에 발표된 논문에 나온 방법에 따라 채취하였다[26,27]. 암컷 C57BL/6 마우스를 이산화탄소로 질식하여 희생시킨 후, 가죽과 근육을 제거하고 대퇴골과 경골을 드러나도록 하여 뼈의 양 끝을 절단하여 뼈의 골수 구멍을 확인한 뒤 2% FBS 가 포홤된 EDTA-BSS 를 1cc 주사기를 이용하여 골수 구멍에 넣어 골수세포를 채취하였다. 적혈구는 RBC lysis buffer 를 이용하여 제거하고, RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% antibiotics, 10 mM HEPES (PH 7.4), 50 µM beta-mercaptoethanol, 2 mM L-glutaminer 가 포함된 골수세포배양액에 골수세포를 현탁하고, 세포배양접시에 분주하여 CO2배양기에서 37℃, 5% CO2 상태로 7 일간 배양하였다[28]. 배양 7 일째에 미성숙한 골수 유래 수지상 세포를 세포배양접시에서 채취하여 anti-CD11c antibody-bound microbeads 를 이용하여 정제된 골수 유래 수지상세포를 채취하였다.
D. MLE-12 세포배양
MLE-12 세포는 마우스 폐 상피세포로 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 세포는 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin 을 첨가한 DMEM F-12 (ATCC 30-2006) 세포배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃와 5%
CO2의 조건을 맞춘 세포배양기에서 배양하였다.
E. 나노섬유를 2 개의 층으로 만드는 공배양 환경(Two- layer culture system)
면역 세포와 마우스 폐 상피세포를 3 차원 환경에서 공배양하여 세포들이 서로에게 미치는 영향이나 분비 물질을 알아보기 위해 transwell chamber 를 이용하였다. Transwell 과 24 well 세포배양접시에 PCL 나노섬유를 부착하는 방식으로 2 층 공배양 환경을 만들었다(그림 6). 2 개의 층에서 상층부를 제작하기 위해서는 transwell insert 의 polycarbonate Filter 를 제거하였다.
Filter 를 제거한 transwell 에 PDMS 를 바르고 접착력이 있을 때 5 mm 직경의 원형으로 자른 C-PCL 을 부착하는 방법으로 제작하였다. 하층부의 경우에는, 24 well 세포배양접시에 PDMS 를 접착력이 있을 정도로 굳힌 후 C-PCL 나노섬유를 PDMS 의 표면에 부착시키는 방법으로 제작하였다.
상층부에는 MLE-12 세포를 500,000 cells/well 로 분주하였고 하층부에는 면역세포(수지상 세포)를 100,000 cells/well 로 배양하였다. MLE-12 세포는 세포배양접시에서 밀착연접이 생기는 시간을 고려하여 48 시간 동안 배양하였고, 수지상세포는 C-PCL 나노섬유에 부착 및 안정화를 위해 4 시간 동안 배양하였다. MLE-12 세포는 분주한 후 48 시간, 수지상세포는 분주한 후 4 시간이 되었을 때 2 개의 층을 조립하고, 두 세포를 DMEM F-12 와 RPMI1640 을 1:1 로 혼합한 배지, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin 를 포함한 배지에서 24 시간 배양하였다.
F. 세포 면역 화학 염색법(Immunocytochemistry)
나노섬유와 세포배양접시에서 실험에 필요한 시간 동안 배양한 세포를 4%
paraformaldehyde 를 넣고 10 분 동안 실온에 보관하여 세포를 고정하였다.
1X PBS 로 10 분씩 3 번 반복하여 세척하고 5% goat serum 과 0.2% Triton X-100 이 포함되어 있는 1X PBS 로 1 시간 동안 block 하였다. 1 차 항체를 희석 배수에 맞게 antibody diluent OP Quanto (Thermo)에 희석하여 18 시간 동안 4℃에서 보관하였다. 1 차 항체로는 anti-ZO-1 antibody (1:100 희석) (Invitrogen, CA, USA), Anti-CD86 antibody (1:100 희석) (abcam)을 사용하였다. 18 시간 후 고정한 세포를 1X PBS 로 10 분씩 3 번 반복하여 세척하고 2 차 항체를 희석 배수에 맞게 antibody diluent OP Quanto (Thermo)에 희석하여 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 2 차 항체로는 Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rabbit Ig G (1:200 희석) (Invitrogen)와 Alexa Fluor 488-conjugated Phalloidin (1:400 희석) (Sigma)을 사용하였다. 1X PBS 로 10 분 1 번 세척하고 DAPI (1:500 희석)를 희석시킨 1X PBS 에 10 분간 반응시켰다. 1X PBS 로 10 분 1 번 세척한 후 세포배양접시에 남아있는 1X PBS 를 전부 제거한 후 mounting gel 과 cover slide 를 이용하여 샘플을 봉입하였다.
G. 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)
전기방사를 통해 제작된 PCL 나노섬유의 형태 및 나노섬유에 부착된 세포의 형태를 SEM 을 사용하여 관찰하고 촬영하였다. SEM 을 이용하여 관찰하고 촬영하기 위해서는 전처리가 필요하다. 전처리 과정은 배양된 세포를 1X PBS 로 2 회 세척하고 3% glutaraldehyde 가 포함된 0.1 M phosphate buffer 로 18 시간 동안 4 ℃에서 보관하여 고정하였다. 18 시간 후 고정된 나노섬유 및 부착된 세포를 0.1 M phosphate buffer 로 10 분씩 3 번 반복하여 세척하고 2% OsO4 (Sigma)가 포함된 0.1 M phosphate buffer 로 1 시간 동안 실온에 보관하여 2 차 고정을 하였다. 탈수를 하기 위해 에탄올의 농도를 저농도에서 고농도로 실온에서 10 분씩 순차적으로 증가시키며(30%, 50%,
70%, 90%, 95%, 100%) 반응시켰다. 탈수한 후 완벽하게 건조해 주었다.
건조한 나노섬유를 양면 탄소섬유 테이프로 알루미늄 마운트에 부착하고 금으로 2 번 코팅하였다. 금으로 코팅된 나노섬유와 나노섬유에 부착된 세포의 형태는 SEM (SNE-4500M, Sec, Korea)을 사용하여 분석하였다.
H. 공초점 레이저 현미경(Confocal laser microscopy)
나노섬유와 세포배양접시에서 배양한 세포들을 고정하고 세포 면역 화학 염색법을 한 세포들에 부착한 특정 형광을 K1 공초점 현미경(Nanoscope, Korea)을 사용하여 관찰하고 촬영하였다. 촬영한 세포들은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하였다.
I. 효소 결합 면역 흡착 검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
마우스의 수지상세포와 폐 상피세포에서 나온 특정 사이토카인은 ELISA assay kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 분석하였다. 세포배양접시와 나노섬유에서 마우스 수지상세포와 폐 상피세포를 배양하였다. 실험을 통해 확립한 기간 동안 배양한 후, 상층액을 수집하여 Microplate reader Synergy H1 을 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
J. 사이토카인 배열 키트(Cytokine array kit)
샘플간 다양한 사이토카인의 분비를 동시에 측정, 비교하기 위해 proteome profiler mouse cytokine array kit (R&D System)를 사용하였다.
나노섬유에서 Der p 의 존재 유무에 따라서 마우스의 수지상세포와 폐 상피세포를 공배양 하였다. 기재된 기간 동안 배양한 후에 제품의 제조사의 설명서에 따라 상층액을 수집하여 분석하였다. 화학 반응시켜 발광한 신호의 밀도는 ImageJ 로 정량화하였다.
Ⅲ. 결 과
A. C-PCL 나노섬유의 형태
PCL 을 Chloroform 에 15%로 용해시키고 5 시간 동안 교반하여 농도가 균일한 용액으로 만들어 전기방사를 통해 C-PCL 나노섬유를 제작하였다.
나노섬유의 초미세 구조는 주사 전자 현미경(SEM) 을 SEM4500 을 통해 관찰 및 촬영하였다(그림 1). ImageJ 를 이용하여 나노섬유의 공극의 크기를 측정하였다. 나노섬유의 공극 크기를 분석한 결과 C-PCL 나노섬유의 직경은 300 nm ~ 5 µm 으로 다양한 크기로 구성되었다. 이러한 방법으로 전기방사된 나노섬유는 규칙적인 배열 없이 무작위적인 구조를 가지고 있어 콜라겐과 유사했다. 전기방사로 제조 C-PCL 나노섬유는 소수성의 성질을 가지고 있어 수용성 용액을 처리하면 젖지 않는다. 세포를 키우기 위해서는 나노섬유가 배양액과 같은 용액들이 스며들 수 있도록 70% 에탄올 용액을 처리하였고 12 시간 동안 UV 노출시켜 건조, 멸균하여 사용하였다.
B. C-PCL 나노섬유에서 마우스 수지상세포와 폐 상피세포의 부착
C-PCL 나노섬유에 마우스 수지상세포와 폐 상피세포를 배양한 후 세포의 부착력과 생존을 관찰하였다. 두 세포를 C-PCL 나노섬유에 각각 분주하고 하루 동안 배양한 후, 방법대로 주사 전자 현미경을 통해 관찰하였다. C- PCL 나노섬유에서 수지상세포와 MLE-12 세포가 나노섬유의 가닥을 따라 배양되는 것을 관찰하였다(그림 1).
그림 1. C-PCL 나노섬유에서 수지상세포와 MLE-12 세포의 형태. C-PCL 나노섬유에 수지상세포와 MLE-12 세포를 분주하고 하루 동안 배양하였다.
주사 전자 현미경(SEM)을 통해 관찰한 C-PCL 나노섬유에서 부착한 형태.
주사 전자 현미경의 배율은 2K로 촬영(size bar=10 µm).
C. 마우스 수지상세포에 다양한 농도의 Der p 처리
세포배양접시의 2 차원 환경과 C-PCL 나노섬유를 기반으로 한 3 차원 환경에서 배양한 수지상 세포에 여러 가지 농도의 Der p 를 처리하였을 때, 세포의 형태나 세포 수에 큰 영향을 주지 않으며 사이토카인의 분비를 유도하는 농도를 찾기 위한 실험을 하였다. 수지상세포를 24well 배양접시와 C-PCL 나노섬유에 분주한 후 안정화 및 부착할 수 있도록 세포배양기에 4 시간 동안 보관하였다. 안정화된 수지상세포에 각기 다른 농도의 Der p 를 처리하였고, 하루 동안 세포배양기에서 배양한 후 4% paraformaldehyde 고정하고 세포 면역 화학 염색 후 공초점 현미경으로 관찰하였다(그림 2).
2 차원의 세포배양접시에서 배양하여 세포 면역 화학 염색 후 관찰 한 결과 Der p 처리하지 않은 수지상세포는 CD86 의 발현이 거의 없지만 Der p 60 µg/ml 과 100 µg/ml 에서는 CD86 의 발현이 증가하였고, 세포의 모양에는 변화가 없었다. 하지만 Der p 150 µg/ml 를 처리한 수지상세포는 모든 세포에서 CD86 을 발현하였고, 세포의 모양이 변하였다(그림 2A). 동일한 조건으로 실험을 C-PCL 나노섬유에서 진행하였을 때 2 차원의 세포배양접시와 같이 Der p 를 처리하지 않은 수지상세포에서는 CD86 의 발현이 거의 없었고, Der p 150 µg/ml 를 처리한 수지상세포는 다른 농도의 수지상세포보다 CD86 의 발현이 다수 발현되었다(그림 2B). 또한 적절한 농도의 Der p 를 찾기 위해 위의 실험과 같이 24well 배양접시와 C- PCL 나노섬유에서 배양한 배양액을 채취하여 효소 결합 면역 측정(ELISA)를 진행하여 TNF-α, IL-1β와 IL-23 사이토카인의 차이를 보았다(그림 3).
농도적인 차이로 Der p 60 µg/ml 보다 100 µg/ml 에서 TNF-α, IL-1β 와 IL-23 의 분비가 더 많이 일어났고 세포배양접시와 나노섬유간의 차이는 거의 없었다.
그림 2. 세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 배양한 수지상세포에 다양한 농도의 Der p. (A) 24well 세포배양접시에서 배양한 수지상세포, (B) C-PCL 나노섬유에서 배양한 수지상세포에 여러 농도의 Der p를 처리하였을 때 면역 화학 염색 후 공초점 현미경을 통해 세포의 모양과 CD86의 발현 정도를 관찰.
공초점 현미경의 배율은 400배로 촬영(size bar=50 μm). DAPI (blue), Phalloidin (green), anti CD86 antibody (red).
그림 3. C-PCL 나노섬유에서 배양한 수지상세포에 Der p 처리하여 효소 결합 면역 측정(ELISA). C-PCL 나노섬유에서 배양한 수지상세포에 여러 농도의 Der p 를 처리하였을 때 효소 결합 면역 측정(ELISA)을 진행하여 분비되는 사이토카인을 측정. 측정 결과는 mean ± SD 로 표시하였다(n = 3).
D. 마우스 폐 상피세포의 밀착연접 형성과 Der p 처리.
세포배양접시와 같은 2차원 환경에서 마우스 폐 상피세포 MLE-12 세포를 배양하였을 때 밀착연접이 형성되는 시기를 관찰하였다. MLE-12 세포의 밀착연접을 관찰하기 위해 8well 세포배양접시에 세포를 분주하였다. 1일부터 3일에 걸쳐 세포를 배양하고 세포 면역 화학 염색법을 통하여 관찰하였다(그림 4A). 이를 바탕으로 실험에서 Der p라는 알레르겐을 이용하여 밀착연접이 손상되는 것을 관찰하였다. MLE-12의 밀착연접이 손상되는 것을 관찰하기 위해 8well 세포배양접시에 세포를 배양하고 밀착연접이 가장 선명하게 형성된 2일에 Der p 100 µg/ml를 처리하였다. Der p 처리 후 하루 뒤에 세포를 면역 화학 염색 후 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 배양된 MLE-12 세포에서 모두 밀착연접이 형성되지만 2일동안 세포배양기에서 배양한 MLE-12 세포에서 가장 선명한 밀착연접을 관찰할 수 있었다(그림4A). 그러므로 2일의 배양일 후 Der p를 처리하고 하루 동안 배양하였다. Der p를 처리하지 않은 MLE-12 세포는 밀착연접을 그대로 형성하고 있고, Der p 100 µg/ml를 처리한 MLE-12 세포는 밀착연접이 손상되었다(그림4B).
그림 4. 세포배양접시에서 MLE-12 세포의 밀착연접 형성과 Der p 처리.
(A) 세포배양접시의 2차원 환경에서 마우스 폐 상피세포 MLE-12 세포를 배양하여 밀착연접의 형성을 면역 화학 염색 후 공초점 현미경으로 관찰. (B) MLE-12 세포의 밀착연접이 형성된 후 Der p 처리. 공초점 현미경의 배율은 400배로 촬영(size bar=50 µm). DAPI (blue), Phalloidin (green), anti ZO-1 antibody (red).
E. C-PCL 나노섬유에서 마우스 폐 상피세포 관찰.
세포가 3차원 환경에서 성장할 수 있게 해주는 C-PCL 나노섬유에서 마우스 폐 상피세포 MLE-12 세포의 부착력과 형태를 관찰하였다. C-PCL 나노섬유에 수지상세포를 분주한 후 세포의 안정화와 부착을 위해 4시간 후에 Der p 100 µg/ml를 처리하였다. MLE-12 세포는 세포배양접시 실험에서 결정한 배양 2일 후에 Der p 100 µg/ml를 처리하고, 두 세포 모두 하루 뒤에 4% paraformaldehyde를 처리하여 고정하고 면역 화학 염색을 하였다. C- PCL 나노섬유에 세포를 배양하였을 때 세포가 섬유의 입체적인 구조에 부착하여 3차원으로 성장하는 특징이 있기 때문에 MLE-12 세포는 C-PCL 특성상 밀착연접을 형성하지 않으며 Der p의 여부와 상관없이 나노섬유에서 배양되었다(그림 5).
그림 5. C-PCL 나노섬유 에서 수지상세포와 MLE-12 세포 관찰.
마우스 수지상세포와 폐 상피세포인 MLE-12 세포를 C-PCL 나노섬유에서 배양한 후 Der p 를 처리하고 하루 뒤에 고정하고, 면역 화학 염색 후 공초점 현미경으로 촬영. 공초점 현미경의 배율은 400 배로 촬영(size bar=50 µm).
DAPI (blue), Phalloidin (green), 수지상세포는 anti CD86 antibody (red), 페 상피세포는 anti ZO-1 antibody (red).
F. 나노섬유를 기반으로 3차원 공배양 환경에서 세포 관찰.
C-PCL 나노섬유를 2개의 층으로 만들어 상층과 하층에 다른 세포를 분주하여 두 세포가 한 공간에서 입체적으로 배양되는 것을 관찰하기 위한 실험을 하였다. 이러한 실험을 하기 위해 C-PCL 나노섬유를 2개의 층으로 만들어 공배양 환경을 제작하였다(그림 6). 상층에는 마우스 폐 상피세포 MLE-12 세포를 분주하고 앞선 실험에서 결정한 2일 동안 세포배양기에서 배양하였다. MLE-12 세포의 배양일이 2일이 되는 날에 하층에 수지상세포를 분주한 후 안정화 및 부착되는 시간을 주기 위해 4시간 후에 Der p를 처리하였다. Der p를 처리하고 하루 뒤 상층과 하층에 있는 세포를 4%
paraformaldehyde를 처리하여 고정하고 면역 화학 염색을 하였다. 공배양 하여도 이전의 실험들처럼 Der p를 처리하지 않은 수지상세포에서는 CD86의 발현이 거의 없었고, Der p를 처리한 수지상세포에서는 CD86의 발현이 증가하였다. MLE-12 세포는 Der p 의 유무에 상관 없이 C-PCL의 특성상 세포 간의 밀접한 거리를 유지하기 힘들어 밀착연접은 형성되지 않았으며 세포의 부착력이나 세포의 수 차이는 나타나지 않았다. C-PCL 나노섬유에서 단일 배양과 공배양한 수지상세포와 MLE-12 세포의 세포 증식률, 세포의 부착력, 세포의 수에 있어 유의한 차이는 나타나지 않았다.
그림 6. 나노섬유를 2 개의 층으로 만드는 공배양 환경의 실험 모식도.
그림 7. 나노섬유 공배양 환경에서 수지상세포와 MLE-12 세포의 관찰.
수지상세포와 MLE-12 세포를 C-PCL 나노섬유 공배양 환경에서 배양한 뒤 면역 화학 염색 후 공초점 현미경으로 촬영. 공초점 현미경의 배율은 400 배로 촬영(size bar=50 µm). DAPI (blue), Phalloidin (green), 수지상세포는 anti CD86 antibody (red), MLE-12 는 anti ZO-1 antibody (red).
G. 공배양 환경에서 배양한 세포의 배양액에서 사이토카인 측정.
C-PCL 나노섬유를 2개의 층으로 만들어 두 세포를 공배양한 환경에서 배양액을 채취하여 분비되는 사이토카인을 효소 결합 면역 측정하였다.
상층에는 마우스 폐 상피세포인 MLE-12 세포를, 하층에는 면역세포인 수지상세포를 배양하여 공배양하고 알레르겐 Der p의 처리 유무에 따라서 두 세포가 서로 미치는 영향으로 분비되는 사이토카인을 측정하였다.
세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 MLE-12 세포는 Der p의 유무와 상관없이 TNF-α, IL-6, IL-23 모두 거의 분비되지 않았다.
수지상세포는 세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양 시 Der p를 처리하지 않으면 TNF-α가 거의 분비되지 않았고, Der p 처리 시 분비가 증가하였다. 수지상세포와 MLE-12 세포를 공배양한 배양액에서는 Der p를 처리하지 않더라도 TNF-α가 소량 분비되었고, Der p 처리 시 세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 수지상세포보다 TNF-α 분비가 적었다. IL-6의 경우 세포배양접시에서 단일 배양한 수지상세포는 Der p의 유무에 약간의 차이를 보였다. C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 수지상세포와 공배양한 배양액에서는 Der p의 유무에 따라 차이가 확연히 나타났다. 다른 사이토카인의 분비량에 비해 상대적으로 적은 양이지만 IL- 23의 분비량은 공배양한 배양액에서 가장 많았다. 세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 수지상세포와 MLE-12 세포 보다 두 세포를 공배양한 배양액에서 특이적으로 더 많은 양의 사이토카인이 분비되었다.
그림 8. 수지상세포와 MLE-12 세포의 단일 배양과 공배양 사이토카인 비교. 세포배양접시에서 단일 배양, C-PCL 나노섬유에서 단일 배양, C-PCL 나노섬유를 2 개의 층으로 만들어 공배양한 수지상세포와 MLE-12 세포의 배양액으로 결합 면역 측정(ELISA)을 진행하여 분비되는 사이토카인을 측정.
측정 결과는 mean ± SD 로 표시하였다(n = 3). *p < 0.05, NS, not significant
H. 공배양한 환경에서 배양액의 사이토카인 배열 키트.
C-PCL 나노섬유로 만든 3차원의 공배양 환경에서 상층의 MLE-12 세포와 하층의 수지상세포간 상호작용으로 분비되는 사이토카인을 측정하였다.
24well 세포배양접시에서 수지상세포와 MLE-12 세포를 단일 배양한 배양액에서 사이토카인을 측정하였을 때 특이적인 분비가 발견되지 않았으나 C-PCL 나노섬유에서 공배양한 배양액에서 2차원의 세포배양접시와는 다른 IL-23 사이토카인의 분비량을 보았다. 수지상세포와 MLE-12 세포를 공배양한 배양액을 채취하여 사이토카인 배열 키트를 진행하였다. 이 배양액에서 검출된 사이토카인은 CXCL1, CXCL2, CXCL10, CXCL11, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL17, IL-1α, IL-1ra, IL-6, IL-10, IL-23, IL-27, CD54, G-CSF, M-CSF, TIMP-1, TNF-α 이다(그림 9). 확실하게 비교를 할 수 있는 사이토카인 중에서 CXCL10, CCL2, IL-1α, IL-1ra, IL- 6, IL-10, IL-23, IL-27, G-CSF, M-CSF, TNF-α 는 Der p 처리 시 발현 차이가 뚜렷하게 나타났다.
그림 9. 수지상세포와 MLE-12 세포를 공배양한 배양액의 사이토카인 배열 키트. C-PCL 나노섬유를 2 개의 층으로 만든 공배양 환경에서 상층에는 수지상세포를 배양하고, 하층에는 MLE-12 세포를 배양하여 공배양 한 후 Der p 의 유무에 따른 배양액의 사이토카인 배열 키트로 측정.
Ⅳ. 고 찰
C-PCL 나노섬유에서 마우스 수지상세포와 폐 상피세포 MLE-12 세포를 배양하여 관찰하였을 때 3 차원의 입체적인 구조를 지녔다. 부착력으로 봤을 때에도 두 세포 모두 C-PCL 나노섬유에 안정적으로 부착되어 있었다. 세포에 있어 Der p 는 알레르기 항원으로 유해하기 때문에 수지상세포에서는 CD86 의 발현이 있으며, 세포 수에 영향을 주지 않으며 TNF-α, IL-1β 와 IL-23 의 분비가 증가한 결과를 가지고 Der p 의 농도를 100 µg/ml 로 처리하였다.
2 일동안 세포배양접시에서 배양된 MLE-12 세포에서 가장 선명한 밀착연접을 관찰할 수 있었다. 2 일의 배양일 후 Der p 100 µg/ml 를 처리한 MLE-12 세포는 밀착연접이 손상되었다(그림 4B). 이를 통해 MLE-12 세포의 적절한 배양일을 결정할 수 있었고, Der p 의 농도가 적절하다는 것을 알 수 있었다. C-PCL 나노섬유에 세포를 배양하였을 때 세포가 섬유의 입체적인 구조에 부착하여 3 차원으로 성장하는 특징이 있기 때문에 MLE-12 세포는 C-PCL 특성상 밀착연접을 형성하지 않아 Der p 의 여부와 상관없이 큰 차이를 보이지 않았다(그림 5). C-PCL 나노섬유를 2 개의 층으로 만들어 상층에는 MLE-12 세포, 하층에는 수지상세포를 공배양하여 세포 면역 화학 염색법으로 세포의 형태와 CD86 발현을 관찰하였다. 공배양 하여도 이전의 실험들처럼 Der p 를 처리하지 않은 수지상세포에서는 CD86 의 발현이 거의 없었고, Der p 를 처리한 수지상세포에서는 CD86 의 발현이 증가하였다.
MLE-12 세포는 이 전과 같이 두 조건 모두 C-PCL 나노섬유의 특성상 세포 간의 밀접한 거리를 유지하기 힘들어 밀착연접은 형성되지 않았으며 세포의 부착력이나 세포의 수 차이는 없었다. C-PCL 나노섬유에서 공배양과 단일 배양한 수지상세포와 MLE-12 세포의 세포 증식률, 세포의 부착력, 세포의 수에 있어 유의한 차이는 나타나지 않았다.
세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 MLE-12 세포는 Der p의 유무와 상관없이 TNF-α, IL-6, IL-23 거의 분비되지 않았다.
수지상세포는 세포배양접시와C-PCL 나노섬유에서 단일 배양 시 Der p를 처리하지 않으면 TNF-α가 거의 분비되지 않았지만 공배양한 배양액에서는 Der p를 처리하지 않더라도 TNF-α가 소량 분비되었다. IL-6의 경우 세포배양접시에서 단일 배양한 수지상세포는 Der p의 유무에 따라 약간의 차이를 보였지만 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 수지상세포와 공배양한 배양액에서는 Der p의 유무에 따라 차이가 확연히 나타났다. 다른 사이토카인의 분비량에 비해 상대적으로 적지만 IL-23의 분비량은 공배양한 배양액에서 가장 많이 분비되었다. 이를 통해 공배양한 마우스 수지상세포와 폐 상피세포는 서로에게 영향을 미치며 세포배양접시와 C-PCL 나노섬유에서 단일 배양한 수지상세포와 MLE-12 세포 보다 두 세포를 공배양한 배양액에서 사이토카인의 차이를 보인다고 생각한다. 공배양한 두 세포가 Der p의 유무에 따라 분비되는 사이토카인을 전체적으로 관찰하기 위해 사이토카인 배열 키트를 진행하였다. 배양액에서 검출된 사이토카인은 CXCL1, CXCL2, CXCL10, CXCL11, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL17, IL-1α, IL-1ra, IL-6, IL-10, IL-23, IL-27, CD54, G-CSF, M-CSF, TIMP-1, TNF-α 이다(그림 9). Der p 유무에 따라 CXCL10, CCL2, IL-1α, IL-1ra, IL-6, IL-10, IL-23, IL-27, G-CSF, M-CSF, TNF-α 의 발현이 육안으로 확인할 수 있을 정도로 뚜렷하게 나타났다. 사이토카인 배열 키트는 정확한 분비량을 측정할 수 없어서 추가적인 실험이 필요하다. 지금까지의 결과들을 토대로 면역세포와 마우스 폐 상피세포의 공배양에 있어서 추가적으로 면역세포들을 하층의 나노섬유에서 함께 배양하거나 T 세포와 같이 공배양하여 세포 간의 상호작용의 차이를 볼 수 있는 연구 방향에 도움이 될 것이라 생각된다. 이 연구에서는 사이토카인의 정량적인 분비량을 검사하지 않았기 때문에 이에 따른 후속 연구들도 필요할 것으로 보인다.
Ⅴ. 결 론
본 연구에서는 나노섬유를 기반으로 하는 3 차원적인 환경을 2 개의 층으로 만들어 공배양하여 면역세포와 마우스 폐 상피세포에 알레르겐을 처리하는 연구를 하였다. 알레르겐 Der p 의 농도는 수지상세포의 형태를 변형시키지 않는 농도를 결정하였다. 결정한 농도의 Der p 를 마우스 수지상세포와 폐 상피세포인 MLE-12 세포에 처리하였다. 수지상세포와 MLE-12 세포를 세포배양접시와 나노섬유에서 단일 배양하여 Der p 를 처리하면 2 차원과 3 차원이라는 공간적 차이를 가지고 있어 부착한 세포의 형태에 차이가 있었지만 사이토카인을 측정하였을 때, 세포배양접시와 나노섬유의 큰 차이가 나타나지 않았다. 나노섬유를 2 개의 층으로 만들어 공배양 환경을 구축하여 상층에는 MLE-12 세포를 배양하고, 하층에는 수지상세포를 공배양하여 배양액으로 사이토카인을 측정하였다. Der p 처리 시 TNF-α, IL- 6 사이토카인은 나노섬유에서 단일 배양 한 배양액과 큰 차이를 보이지 않았지만 IL-23 사이토카인은 공배양한 배양액에서 가장 큰 증가를 보였다.
수지상세포와 MLE-12 세포와 공배양한 배양액의 전체적인 사이토카인을 관찰하기 위해 사이토카인 배열 키트를 진행하였다. Der p 의 유무에 따라 분비되는 사이토카인을 관찰할 수 있었다. 따라서 공배양 환경을 이용하여 알레르겐과 같은 항원의 유무에 따라 수지상세포와 상피세포 간의 상호작용을 생체 외에서 측정, 관찰할 수 있다.
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ABSTRACT
There is a difference between the two-dimensional environment, such as the cell culture plate used in general cell culture, and the microenvironment in the corresponding tissues in the body, so there is a difference in the results in cell experiments and clinical trials. Because it is difficult to implement a co-cultivation environment in a two- dimensional environment, it is possible to implement a similar environment in the body by cultivating cells in a nanofiber environment in which they can have a three-dimensional form rather than a flat two-dimensional structure. A nonclinical model can be developed based on the co-cultivation environment of immune cells and lung epithelial cells in a three-dimensional environment based on nanofiber. Poly ε-caprolactone (PCL) nano- fiber is manufactured by electro-spinning with chloroform as a solvent (C-PCL). In order to establish such a co-culture environment, it is going to build a co-culture environment by making three-dimensional nanofiber into two layers. C-PCL is attached to Transwell and lower (24 well cell culture plate) to establish a co-culture environment. To implement the asthma model, a proteinase (Der p) produced by the dust mites (Dermatophagoides pteronyssinu), best known as allergen, is used. After measuring the activity of dendritic cells by cultivating dendritic cells in cell culture plate and C-PCL nanofiber, treat der p by concentration, then determine the appropriate concentration of der p. Based on the concentration of the determined der p, determine the incubation date of mouse lung epithelial cells. Afterwards, C-PCL was attached to two layers, and MLE-12 cells, lung epithelial cells, were cultivated in the upper layer and immune cells in the lower layer.
After that, two floors were assembled to enable the environment for co-culture distribution.
When der p is treated in a three-dimensional co-cultivation environment based on nanofiber, it can be used as an asthma model by measuring cytokines secreted by immune cells and lung epithelial cells and realizing co-cultivation of immune cells and lung epithelial cells in a three-dimensional environment based on nanofiber.
Keyword: Nanofiber, co-culutre, 3D culture, immune cell, lung epithelial.
