․윤태기․강재성

Vol. 47 No. 1 January 2004

조기 난소부전 (premature ovarian failure, POF)은 정상 적인 발육을 보인 40세 미만인 여성에서, 4개월 이상 지

속되는 무월경과 1개월 이상 간격으로 2번 시행한 혈청 난포자극 호르몬 수치가 각각 40 mIU/ml 이상인 경우에

조기 난소부전 환자에서 실시간 중합효소 연쇄 반응을 이용한 사립체 DNA copy 수의 정량적 분석

차병원 여성의학연구소 산부인과학교실, *유전학 연구실,

†고려대학교 의과대학 산부인과학교실, ^‡병리과

김정환․이숙환․조성원*․정혜진*․김현아*․이윤정․나중열

김인선

․윤태기․강재성

=ABSTRACT=

The Quantitative Analysis of Mitochondrial DNA Copy Number in Premature Ovarian Failure Patients Using the Real-time Polymerase Chain Reaction

Jeong Hwan Kim, M.D., Sook Hwan Lee, M.D., Sung Won Cho, M.Sc.*, Hye Jin Jeong, M.Sc.*, Hyun Ah Kim, M.Sc.*, Yun Jung Lee, M.D.,

Joong Yul Na, M.D.

, In Sun Kim, M.D.

, Tae Ki Yoon, M.D., Jae Seong Kang, M.D.

Department of Obstetrics & *Gynecology and Human Genetics Laboratory, Infertility Medical Center, CHA General Hospital, Seoul, Korea,

†Department of Obstetrics and Gynecology, ^‡Department of Pathology, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea

Objective : To design a screening method which identifies women with a potential of progression to the premature ovarian failure (POF) in near future, particularly among young women who have high FSH level but no symptoms and signs of POF.

Methods : Peripheral venous blood samples were collected from 30 patients with POF (age range, 19- 39 years) and from 30 controls with normal serum FSH level who had delivered two or more naturally conceived babies (age range, 32-39 years). mtDNA/28S rRNA ratio was determined by real-time quantitative PCR. Comparative threshold cycle (CT) method was adopted for the relative quantitation between two groups and the effectiveness of the method was evaluated.

Results : A significant decrease in mtDNA/28S rRNA ratio was found in the POF group (0.58 0.38) when compared with the control group (1.15 0.67) (P<0.01). In both control and POF groups, there was positive correlation between mtDNA and mtDNA/28S rRNA ratio (r=0.774, P<0.001; r=0.556, P=0.001, respectively) and negative correlation between 28S rRNA and mtDNA/28S rRNA ratio (r=-0.677, P<0.001;

r=-0.627, P=0.001, respectively), which indicated the suitability of the method.

Conclusion : This study showed a significant decrease in mtDNA copy number in the peripheral venous blood of POF patients. The comparative CT method was found to be an effective and efficient alternative for the screening purposes. With this basis, further studies on the early diagnostic and/or screening method for the POF might be enriched.

Key Words : Premature ovarian failure, Mitochondrial DNA, Real-time polymerase chain reaction

접수일：2003. 8. 1.

주관책임자 : 이숙환

* 이 연구는 보건복지부 보건의료기술진흥사업의 지원에 의하여 이루어진 것임 (01-PJ10-PG6-01GN13-0002).

진단되며,^1,2 희발 월경, 저 에스트로젠증 등 다양한 임상 증상과 소견을 나타낸다. 조기 난소부전은 전체 가임기 여성의 약 1-2%에서 발견되며,³ 원발성 무월경 여성의 10-28%에서 관찰되고, 속발성 무월경 여성에서는 4-18%

의 빈도로 확인된다.⁴

초기의 연구에서는 혈청 난포자극 호르몬 수치가 40 mIU/ml 이상을 보이는 조기 난소부전의 경우, 원시 난포 의 결여를 동반한 비가역적인 변화로만 여겨져서 영구 적인 불임을 나타내는 지표로 생각되었다. 그러나, 1회 실시한 혈청 FSH 수치만으로는 난포의 소진을 판단할 수 없다는 것이 밝혀졌고,⁵ 동시에 조기 난소부전의 징 후를 보이는 환자의 일부에서 간헐적이나마 정상 난소 기능이 확인되어, 이들 환자에서 보다 적극적인 조기 진 단과 처치 계획 수립이 중요하게 대두되게 되었다.⁶ 조기 난소부전의 병태생리는 아직까지 완전히 밝혀지 지 않았으나, 환자의 이질성 (heterogeneity), 잔여 난포의 상태, 난소의 면역학적인 요소, 난포의 세포자멸사 등이 주된 인자로 이해되고 있다.⁷ 이러한 원인 인자 중 주어 진 원시생식세포에 대한 조절과 이후 성숙 난포 발달의 조절이 중요한 부분을 차지한다. 난포의 퇴화와 소멸은 프로그램화 된 세포 사멸인 자멸사에 의해 이루어진다.¹ 성선자극호르몬, 에스트로젠, 성장 인자, 싸이토카인, 액 틴 세포골격 (actin cytoskeleton)의 재조직화, 질소 산화물 등은 자멸사로부터 세포를 구해내는 것으로 알려져 있 고,⁸ TNF-α, Fas ligand, 안드로젠 등은 반대로 자멸사를 촉진하는 것으로 알려져 있다.⁹ 이런 여러 물질들의 조 절 과정을 통해 자멸사의 속도가 변화되고, 이것이 조기 난소부전의 기전을 파악하는데 매우 중요할 것으로 여 겨지고 있다.

노화가 진행된 난포에서는 성장 인자의 생성 변화와 함께 과립막 세포 생성의 감소가 관찰되며,¹⁰ 그 결과 스 테로이드와 당단백의 생성이 감소하고 증식이 감소하게 되어, 난소 기능 소실을 초래한다.¹¹ 이러한 과립막 세포 의 자멸사에 사립체 DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 결손 (deletion)의 증가가 관여하며, 이들은 세포 노화와 직접적인 관계가 있는 것으로 알려져 있다.¹²

세포의 자멸사에 큰 역할을 하는 인간의 mtDNA 는 16.6 kbp의 원형 dsDNA이며, ATP의 주 공급원인 respiratory chain complex의 13개 essential subunit을 coding 한다. mtDNA copy 수는 해당 세포의 에너지 수요에 따 라 매우 큰 차이를 보이며,¹³ 태아 발달 단계에서 정교하 게 조절된다.¹⁴ 포유류의 체세포는 약 10²-10⁴의 mtDNA copy를 갖는 반면, 인간의 난소는 약 200,000 copy를 갖 는데, 이러한 차이는 사립체의 산화적 인산화 체계를 급 속히 확립시키고, 착상 후 발달을 위한 준비 과정으로 이해된다.¹⁵ 또한, 사립체의 생합성과 mtDNA 의 복제는 난자의 성장에 관여하며,^14,15 난자의 성숙에도 난자의

ATP 양과 생성 정도가 매우 중요하다.¹⁶ 최근의 보고는 난자의 mtDNA copy 수가 난자의 수정 능력에도 직접적 인 영향을 미친다.¹⁷

세포자멸사는 산화적 인산화와 무관하게 일어날 수 있으므로, 사립체가 세포자멸사의 과정에 필수적인 것은 아니지만, 자멸사의 조절에 기여하는 역할은 잘 규명되 어 있다.¹⁸ 세포 사멸에 대한 사립체의 역할은 첫째, 전 자 운송, 에너지 대사, ATP 생성의 방해, 둘째, 세포의 산화환원 전위 (redox potential) 변화 유도, 셋째, caspase 활성 단백 (caspase-activating proteins) 분비의 3가지로 대 별할 수 있다.¹⁹ Caspase는 세포자멸사를 위해 특화된 장 치의 주 구성 요소인 단백분해 체계를 뜻하는데, 이들은 cytochrome C나 bcl-2와 같은 proapoptotic signal에 반응하 여, 일련의 단백을 분해하고, 궁극적으로 세포를 해체한 다.²⁰ 사립체 막 구조에는 bcl-2 단백이 존재하며,²¹ bcl-XL

도 사립체 내막 단백과 교통하여 세포자멸사에 영향을 미친다.²²

선택적 사립체 막 투과성 (mitochondrial membrane permeabilization, MMP)이 세포자멸사의 기본 개념으로 고려되고 있으며,²³ 이는 빈도-한계 단계로서, 세포자멸 사 시 특징적으로 증가함이 확인되었다.²⁴ 이론적으로 사 립체 막 전위차 (ΔΨm)의 감소, ATP 생성 장애, 반 응성 산소총의 생성 증가 등에 의해 사립체 투과 공 (permeability transit pore)이 열리고,²⁴ 고장성인 기질이 종 창되어 상대적으로 표면적이 작은 외막이 파열되고, cytochrome C, pro-caspase 2,3,9, apoptosis-inducing factor) 등이 막간 공간으로부터 분비되어,²⁵ 그 결과 세포자멸사 가 초래된다.²⁶ 이러한 사립체 투과성 천이 (permeability transition) 는 특히 세포자멸사 시 증가하며, 자멸사의 가 장 중요한 단계를 형성한다.²⁷

mtDNA 결손 증가가 투과 공 개방을 촉진시키고 자멸 사를 초래할 수 있음이 보고되었고,²⁸ 최근에는 과립막 세포자멸사와 mtDNA 결손과의 연관성도 보고되고 있 다.¹² mtDNA 결손의 축적은 특히 폐경을 전후해서 급격 히 증가하므로 최근에는 노화에 따르는 난소 기능장애 와의 연관성이 부각되고 있고,²⁹ 축적된 oxidative damage 와³⁰ 손상된 mtDNA 복구의 효율성 저하³¹ 등이 그 기전 으로 이해되고 있다.

본 연구는 혈중 성선자극호르몬 증가 외에 다른 증상 이나 징후가 없는 젊은 여성에서, 향후 조기 난소부전으 로의 이행 가능성을 선별할 수 있는 방법을 개발하고, 궁극적으로는 향후 임신을 위한 적극적인 처치에 대한 선택의 기회를 부여할 수 있는 환경을 조성하고자 계획 되었다.

선별 검사로서의 활용을 위하여 연구 재료로 정맥혈 을 선택하였고, 조기 난소부전의 병태생리에 관여하는 것으로 알려진 mtDNA를 이용하였다. 주로 결손, 돌연변

이, 축적된 oxidative damage에 의하여 감소하는 것으로 알려진 mtDNA copy 수를 정량적으로 분석하여, 조기 난 소부전과의 관계를 확인하였다. 기존의 고전적인 중합효 소 연쇄 반응에서는 불가피했던 완결 후 조작 (post-PCR manipulation)을 필요로 하지 않는 실시간 중합효소 연쇄 반응을 이용함으로써, 시간과 노력을 절약하고 오류를 최소화 할 수 있어, 선별 검사로서의 이용 가능성을 높 이고자 하였다. 결과 분석에는 표준곡선 법 대신 28S rRNA를 endogenous reference로 이용한 comparative CT법 을 사용하여,³² 단계적 희석에 필요한 시간과 노력을 줄 이고, 그에 따르는 오차를 감소시켜 결과적으로 선별 능 력을 증대하고자 하였다. 이러한 선별 검사를 통하여, 조 기 난소부전으로의 이행 가능성이 있는 젊은 여성을 선 별하여, 향후 임신을 위한 선택의 기회를 부여하고자 본 연구를 계획하였다.

연구 재료 및 방법

2002년 11월부터 2003년 1월까지 차병원 여성의학 연 구소에서 조기 난소부전 진단 하에 외래 추적 중인 환자 들 중, 1) 연령이 만 40세 미만이면서, 2) 2회 이상 시행 한 혈청 난포자극 호르몬 수치가 각각 40 mIU/ml 이상 이고, 3) 기왕력 상 수술, 내분비계 이상, 자가면역 질환 의 증거가 없고, 4) 이차성 무월경으로 확인되고, 5) 염 색체 검사 상 정상 여성 핵형 (46,XX)을 보인 30명을 환 자군으로 선택하였다.

같은 기간 차병원 건강 검진 센터에 정기 종합검진을 위해 내원한 여성들 중, 1) 내원시 연령이 만 40세 미만 이고, 2) 혈청 난포자극 호르몬이 40 mIU/ml 미만이면서, 3) 기왕력 상 수술, 내분비계 이상, 자가면역 질환의 증 거가 없고, 4) 자연 임신에 이은 2회 이상의 정상 출산이 확인된 30명을 대조군으로 설정하였다 (Table 1).

연구 계획은 차병원 윤리 위원회의 허가를 받았으며, 실험은 대상자들의 서면 동의서를 받은 후 시행되었다.

Table 1. General characteristics of control and POF groups

Characteristics Control POF

No. of cases 30 30

Age (yrs) 37.23±1.81 (32-39) 30.30±4.47 (19-39)

FSH (mIU/ml) 6.31±2.13 (3.1-8.9) 71.12±20.40 (42.3-107)

Age at menarche (yrs) 14.33±1.12 (13-17) 14.11±1.32 (12-17)

Age at menopause (yrs) NA 25.23±5.64 (16-37)

Year after menopause (yrs) NA 5.07±4.77 (1-18)

All values are mean SD (range), POF=premature ovarian failure, NA=not applicable.

2. 연구 방법 1) 혈액 채취

환자군과 대조군 각 30명을 대상으로 좌상완 전박부 에서 정맥 전혈 5 ml를 채취한 후 15% EDTA 100 µl Vacutainer^Ⓡ 관에 수집하였다.

2) DNA 추출

채취한 정맥혈 5 ml를 15 ml 원심분리관에 담은 후, 10 mM Tris-HCl [pH 7.6], 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA가 포함된 저염 완충액 (TKM1) 5 ml를 첨가 하였다. 세포 용해를 위하여 non-diet P-40 (NP-40, Sigma) 125 µl를 첨가하고 뒤집으면서 잘 섞은 후, 실온에서 10 분 동안 2,200 rpm으로 원심분리 하였다. 상층액을 조심 스럽게 걷어내고, nuclear pellet만을 남긴 후 TKM1 완충 액 5 ml로 세척하였다. 실온에서 10분 동안 2,200 rpm으 로 원심분리 한 후, 10 mM Tris-HCl [pH 7.6], 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA가 포함된 고염 완충액 (TKM2) 0.8 ml로 조심스럽게 재현탁하였다.

10% SDS 50 µl를 첨가한 뒤 pipet을 이용하여 전체 현탁 액을 골고루 섞은 후, 37℃에서 밤새 부란하였다. 용액을 15 ml 관에 옮긴 후, 6 M NaCl 0.3 ml를 첨가하고 잘 섞 고, 실온에서 미세 원심분리기를 이용하여, 10분 동안 12,000 rpm으로 원심분리 하였다. DNA를 포함한 상층액 만 남기고, protein pellet은 버린 후, 실온에서 전체 양의 2배의 100% 에탄올을 첨가하고, DNA가 침전될 때까지 관을 수 차례 뒤집어주었다. 침전된 DNA strands를 수확 하여 ice-cold 70% 에탄올 1 ml가 들어있는 미세 원심분 리기 관에 옮긴 후, 4℃에서 5분간 12,000 rpm으로 미세 원심분리하였다. Speed-vac에서 pellet을 건조한 후, DNA 를 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA 완충액에 55℃에서 밤새 재현탁하고, 사용 전까지 -20℃에 보관하 였다.

3) 실시간 중합효소 연쇄 반응 (1) Primer와 probe

연구에 사용된 primer의 염기 서열은 Table 2와 같다.

Table 2. Sequences of the forward and reverse primers for mtDNA and 28S rRNA

Gene Primer Sequence of oligonucleotide^†

mtDNA Forward (mt2981^‡) 5'-ACGACCTCGATGTTGAATC-3'

Reverse (mt3245^‡) 5'-GCTCTGCCATCTTAACAAACC-3'

28S rRNA Forward (28S-7358) 5'-TTAAGGTAGCCAAATGCCTCG-3'

Reverse (28S-7460) 5'-CCTTGGCTGTGGTTTCGCT-3'

†Designed using Primer Express^Ⓡ software version 2.0 (Applied Biosystems Inc., CA).

‡Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence.

Table 3. Sequences of the fluorogenic TaqMan

probes for mtDNA and 28S rRNA

Gene Fluorogenic probe^† Target sequence

mtDNA 5'-FAM-TTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCG-TAMRA-3' nt 3071-3095

28S rRNA 5'-FAM-TGAACGAGATTCCCACCTGTCCCTACCTACTATC-TAMRA-3' nt 7408-7440

†Designed using Primer Express^Ⓡ software version 2.0 (Applied Biosystems Inc., CA).

mtDNA-specific probe와 28S rRNA-specific probe를 제 작하고, 5' 말단과 3' 말단을 각각 5-carboxyfluorescein (FAM) reporter와 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA) quencher로 표지하였다 (Table 3). 연구에 사용 된 primer와 FAM-labeled TaqMan^Ⓡ probe는 Primer Express^Ⓡ software version 2.0 (Applied Biosystems Inc., CA, USA)을 이용하여 디자인하였다. mtDNA primer 의 염기 서열은 Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence를 참조하였다.

(2) 반응 조건과 분석 기법

mtDNA와 28S rRNA에 대하여 각각의 독립된 중합효 소 연쇄 반응 (PCR)을 시행하였다. 각각의 25 µl PCR 혼합물은 다음과 같이 준비되었다: 10 pmol forward primer와 10 pmol reverse primer, 200 nmol/l specific TaqMan^Ⓡ probe (Perkin-Elmer, CT, USA), 200 nmol/l dATP, 200 nmol/l dCTP, 200 nmol/l dGTP, 400 nmol/l dUTP, 4.5 mmol/l MgCl2, 1.25 U AmpliTaq Gold^TM DNA polymerase (Perkin-Elmer, CT, USA), 0.5 U AmpErase^Ⓡ Uracil N-glycosylase (UNG), 1x TaqMan^Ⓡ buffer A.

TaqMan^Ⓡ polymerase는 5'-3' exonuclease를 이용해 target sequence에 특이적인 internal fluorogenic probe를 5' 말단부터 분리시키고, 이 과정에서 5' 말단의 reporter dye가 3' 말단의 quencher dye와 분리될 때 나타나는 형 광을 감지하여 PCR 산물의 양을 정량하였다.³³ 모든 중합효소 연쇄반응은 ABI PRISM^Ⓡ 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc., CA, USA)을 이용하여 3배수로 진행되었다. 이것은 96개의 광섬유가 부착된 96-well built-in thermal cycler로 구성되 어 있으며, 이들 광섬유를 통하여 전달된 laser가 표본의

fluorochrome을 자극하고, 그 결과로 방출된 형광은 다시 광섬유를 통하여 내장된 CCD camera에 연결된 spectrograph에 전달되는 방식을 취한다. 각각의 well에 대해 매 6초마다 형광이 측정되며, 이렇게 얻어진 결과 는 연결된 real-time sequence detection software에 의해 실 시간으로 분석되어, normalized reporter fluorescence증감 값 (ΔRn)과 cycle number의 관계로 모니터에 표시된다.

Reporter fluorescence가 반응 초기 (cycle 3-15) background signal에 의한 baseline fluorescence를 통계학적으로 유의 한 정도 (10x SD)로 초과하기 시작하는 cycle을 threshold cycle (CT)이라고 정의하고 (Fig. 1), threshold cycle과 target DNA sequence copy수의 log값은 정확히 반비례한 다는 점을 이용하여 시료를 정량분석한다.³⁴

Fig. 1. Amplication plot showing terms commonly used in real-time quantitative PCR.

Sequence Detection System (SDS) software version

1.9.1 for Macintosh OS (Applied Biosystems Inc., CA,

USA).

실험에 사용된 primer와 probe의 양은 가장 높은 reporter fluorescence와 가장 낮은 threshold cycle을 나타 내도록 조절하였다. PCR 시료는 MicroAmp^Ⓡ optical cap 이 달린 MicroAmp^Ⓡ optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems Inc., CA, USA)에 준비하였다. PCR amplification condition은 다음과 같다. 즉, UNG를 활성화 시켜 potential contaminant PCR product를 파괴하기 위하 여 50℃에서 2분간 반응시킨 후, UNG를 변성시키고 AmpliTaq Gold^TM DNA Polymerase를 활성화하기 위해 95℃에서 10분간 반응시키고, 증폭을 위해 95℃에서 15 초, 60℃에서 1분간 40회 반복하였다.

4) Comparative CT법을 이용한 mtDNA 정량

mtDNA copy 수의의 정량적 분석을 위하여 내적 대조 (nuclear DNA, 28S rRNA) 증폭을 이용한 비교 분석을 시 행하였다. 결과를 분석하기 전, mtDNA와 28S rRNA에 대한 효율을 확인하기 위하여 각각의 반응 물질의 양을 달리 하여 유효성 검증 실험을 시행하였다.³²

내적 기준에 대한 target의 양 (mtDNA/28s rRNA비, XN)은 다음의 식으로 표현될 수 있다.

XN=X0/R0=2-^(CT,R-C T,X)

=2^-ΔCT

X0: target의 initial amount R0: reference의 initial amount

CT,X: target amplification의 threshold cycle CT,R: reference amplification의 threshold cycle

1.15

0.58

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

mtDNA/28S rRNA

Control POF

**

Fig. 2. Comparison of mtDNA/28S rRNA ratio in control (n=30) and POF (n=30) groups (**P<0.01).

실시간 중합효소 연쇄 반응의 결과 얻어진 mtDNA의 threshold cycle (mtDNA CT)과 28S rRNA의 threshold cycle (28S rRNA CT)을 이용해 환자군과 대조군 사이의 mtDNA/28S rRNA비를 비교하였다. 또한 mtDNA CT, 28S rRNA CT, mtDNA/28S rRNA비, 연령 사이의 상관 관계를 분석하였다. 그리고 환자군 내에서는 채혈시 연령, 난소 부전 진단 후 채혈까지의 기간, mtDNA/28S rRNA비간의 상관 관계도 확인하였다.

5) 통계학적 분석

모든 중합효소 연쇄 반응은 3배수로 시행되었고, 결과 는 mean SD로 표현하였다. 통계학적 분석에는 StatView^Ⓡ software version 5.0 for Macintosh^Ⓡ (Abacus Concepts Inc., CA, USA)를 이용하였다. 환자군과 대조군 간의 비교는 Student's t test로 분석하였고, 각 군에서의 mtDNA CT, 28S rRNA CT, mtDNA/28S rRNA비, 연령 사이의 연관성 은 correlation Z test로 분석하였다. P<0.05 미만인 경우만 통계학적 유의성이 있다고 판단하였다.

결 과

1. 환자군과 대조군의 mtDNA/28S rRNA비 비교 환자군의 평균 연령은 30.30±4.47세 (범위, 19-39세) 였 고, 대조군의 평균 연령은 37.23±1.81세였다 (범위, 32-39 세) (Table 1). 28S rRNA copy수에 대한 mtDNA copy수의 비 (mtDNA/28S rRNA비)는 환자군과 대조군에서 각 각 0.58±0.38과 1.15±0.67로 유의한 차이를 보였다 (P<0.01) (Fig. 2).

1.15

0.5

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

mtDNA/28S rRNA

Control POF

**

Fig. 3. Comparison of mtDNA/28S rRNA ratio of subjects in the same age range in control (n=30) and POF (n=18) groups (**P<0.01).

T.R T,X T

대조군의 연령 범위를 고려하여 새로이 선택한 환자군 (범위, 30-39세) 간의 비교에서도 mtDNA/28S rRNA 비 는 환자군과 대조군 사이에서 각각 0.50±0.29과 1.15±

0.67로 유의한 차이를 보였다 (P<0.01) (Fig. 3).

2. 각 군에서의 mtDNA CT, 28S rRNA CT, mtDNA/

28S rRNA비 간의 상관관계

대조군과 환자군 모두에서 mtDNA CT는 mtDNA/28S rRNA비와 유의한 양성 상관관계를 보였다 (각각, r=0.774, P<0.001; r=0.556, P=0.001) (Fig. 4a, b). 반면, 28S rRNA CT는 유의한 음성 상관관계를 나타내었다 (각각, r=-0.677, P<0.001; r=-0.627, P=0.001) (Fig. 5a, b).

Regression Control (mtDNA CT) vs Control (mtDNA/28S rRNA)

y = 0.888x - 13.471 R² = 0.599

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

15 16 17 18

Control (mtDNA CT)

Control (mtDNA/28S rRNA

Regression POF (mtDNA CT) vs POF (mtDNA/28S rRNA)

y = 0.297x - 4.19 R² = 0.309

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

14 15 16 17 18

POF (mtDNA CT)

POF (mtDNA/28S rRNA

Fig. 4. Correlation between mtDNA C

and mtDNA/28S rRNA in control (a) and POF (b) groups.

Regression Control (28S rRNA CT) vs Control (mtDNA/28S rRNA)

y = -0.797x + 14.3 R² = 0.459

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

15 16 17 18

Control (28S rRNA CT)

Control (mtDNA/28S rRNA

Regression POF (28S rRNACT) vs POF (mtDNA/28S rRNA)

y = -0.312x + 5.914 R² = 0.393

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

15 16 17 18

POF (28S rRNA CT)

POF (mtDNA/28S rRNA

Fig. 5. Correlation between 28S rRNA C

and mtDNA/28S rRNA in control (a) and POF (b) groups.

3. 채혈시 연령, 폐경 후 채혈시 까지의 기간, mtDNA/

28S rRNA비 간의 비교

대조군의 경우, 채혈시 연령과 mtDNA/28S rRNA비 사 이에는 유의한 연관성이 없었다 (r=0.047, P=0.808) (Table 4a). 환자군의 경우에서는 채혈시 연령이 증가 할수록 mtDNA/28S rRNA비가 유의하게 감소하였다 (r=-0.487, P=0.006) (Table 4b). 그러나, 난소부전 진단 후 채혈까지의 기간과는 유의한 연관성이 없었다 (r=-0.099, P=0.604) (Table 4b).

Table 4. Correlation coefficient of age, year after menopause and mtDNA/28S rRNA ratio of control and POF groups

Age mtDNA/28S rRNA^†

r P r P

Age 1.000 0.047 0.808

†mtDNA/28S rRNA = 2^-△ (28S rRNA CT-mtDNA CT).

Regression Control (mtDNA CT) vs Control (mtDNA/28S rRNA)

Regression Control (mtDNA CT) vs Control (mtDNA/28S rRNA)

b. POF

Age mtDNA/28S rRNA† Year after menopause r P r P r P

Age 1.000 -0.487 0.006

Year after menopause -0.099 0.604 1.000

†mtDNA/28S rRNA = 2^-△ (28S rRNA CT-mtDNA CT), POF=premature ovarian failure.

4. 유효성 검증 실험 결과

반응 시료 양의 log에 대한 ΔCT의 기울기 절대값은 환자군과 대조군에서 각각 0.062, 0.051로 모두 0.1 보다 작아 실험의 유효성이 증명되었다.

고 찰

조기 난소부전은 전체 가임기 여성에서 약 1-2%의 적 지 않은 빈도로 확인되고 있다. 그러나, 희발 월경 등의 증상을 간과하는 여성이 많고 이들 대부분이 병원을 찾 지 않기 때문에 조기 진단과 처치에 어려움이 많다. 조 기 난소부전의 원인은 아직까지 정확히 밝혀지지 않고 있으나, 난포 소진 (follicle depletion)과 난포 기능 이상에 의한 것으로 대별할 수 있다.¹ 이들의 병태 생리에는 세포자멸사, 면역학적 요소, 유전적 요소, 생화학적 요 소 등 다양한 기전이 연관되어 있으며, 특히 사립체 (mitochondria)가 세포자멸사에 밀접하게 관여함이 밝혀 져, 그 응용에 대한 관심이 높아지고 있다.

지금까지의 연구 결과, 사립체 DNA (mtDNA) 결손이 나 돌연변이는 병적인 상태를 항상 유발하는 것은 아니 며, 정상인에서도 간혹 발견된다는 것이 확인되었다. 한 편, mtDNA copy 수는 정교하게 조절되며, 결손, 돌연변 이, 축적된 oxidative damage 등에 의해 감소한다고 알려 져 있다. 이러한 mtDNA copy 수는 인체의 각 장기마다 차이가 있기에 특정 장기의 질환과의 관계를 알기 위해 선 특정 장기의 mtDNA를 검사해야만 한다. 이러한 제약 때문에 아직까지 조기 난소부전으로의 진행이 의심되는 여성을 선별할 수 있는 적절한 검사가 확립되지 않고 있 다.

본 연구에서는 mtDNA를 이용한 선별 검사의 가능성 을 확인하고자 하였다. 방법의 용이성을 위해 정맥혈의 mtDNA copy 수와 조기 난소부전과의 관계를 보았고, 검 사의 민감도를 높이기 위해서는 특정 염기서열에만 특 이적 결합을 하는 TaqMan^Ⓡ probe를 사용하였으며,³³ 실 시간 중합효소 연쇄 반응 (real-time polymerase chain reaction)을 이용하여 검사 시간과 노력을 절약하고, 효율 을 증대시켰다.

고전적인 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 시료 조작에 필요한 노력과 그에 따르 는 오류 등의 문제점이 있고, 반응 후의 최종 산물을 agarose gel에서 분리해 대강의 양을 어림잡는데 만족해 야만 했으므로 실험의 민감도나 특이성이 낮다. 또한 이 론상 반응 산물은 기하급수적으로 증가하나 실제 시험 관 내에서는 여러 제한 요인의 영향으로 어느 순간 이후 에는 더 이상 반응이 없는 plateau가 나타나는 단점도 지 적되어 왔다. 이러한 이유에서 end-point analysis만 가능 했던 기존의 방법은 plateau에 도달하는 시점이 서로 다 른 여러 반응 사이의 변별이 명확하지 않게 되므로, 결 국 정량적으로는 실제와 매우 다른 결과를 얻게 될 가능 성이 크다.

이와 같은 단점을 보완하기 위해 quantitative competitive PCR이 사용되어 왔으나, 매 PCR 마다 가장 적합한 competitor를 만들어 사용하여야 하고, target과 competitor의 적정한 비율 범위를 맞추기 위해 여러 농도 에서 실험을 해야 하며, 세심한 유효성 검사를 통해 증 폭 효율을 검증해야만 하는 등의 문제가 있다. 또한 미 묘한 효율 차이에도 정량 분석의 정확성이 크게 낮아지 고, 각 반응 종료 단계마다 세심한 정량 분석을 위한 까 다로운 post-PCR manipulation이 필요한 단점이 있다.

실시간 중합효소 연쇄 반응은 매 PCR cycle의 진행 상 황을 연결된 모니터 상에서 실시간으로 관찰하면서, 형 광 염료를 이용하여 각 PCR 단계를 exponential phase 범 위 내에서 실시간으로 측정한다.^33,34 시료의 반응 특성은 모든 반응이 끝난 후 축적된 반응 산물의 양 대신, 반응 산물 양 (Rn)이 일정 기준 (threshold)를 초과하기 시작하 는 시점의 cycle 수 (CT)로 표현된다. 이때 target DNA 의 양이 많을수록 역치에 도달하기까지의 PCR cycle 수는 적게 된다.

이 방법은 post-PCR manipulation이 필요 없고, 그에 따 른 시료의 오염이나 오류를 줄일 수 있다는 장점이 있 다. 또한, 정량 범위가 훨씬 넓고 효율이 증가되어 대규 모의 임상 연구에서도 사용이 가능하다.

실시간 중합효소 연쇄 반응의 정량 분석법은 Higuchi 등³⁴이 정의한 threshold cycle (CT)에 바탕을 두고 있으며, 단계적 희석을 통하여 얻은 표준곡선에 알고자 하는 시

료의 CT값을 대응시켜 분석을 시도하는 표준곡선법과 내인성 대조를 이용하여 상대적인 정량 분석을 하는 comparative CT법으로 대별된다. 후자는 target DNA와 endogenous reference의 증폭 효율이 비슷한 경우 표준곡 선법과 분석 효과에 차이가 없고, 표준곡선을 그리지 않 아도 되므로 단계적 희석에 따르는 시간과 노력, 오류를 줄일 수 있고, plate당 샘플 양을 늘릴 수 있어 매우 효율 적이다. 이러한 이유에서 본 연구는 선별검사로서의 가 치를 고려하여 comparative CT법을 택하였다.

Endogenous reference로는 전체 DNA 샘플의 대부분을 구성하는 ribosomal RNA (rRNA)를 이용하였다. rRNA는 여러 연구에서 시행한 조직 배양 세포의 실험에서 이미 일정한 농도를 유지하는 것으로 확인되어 endogenous reference로서의 유효성이 검증되어 있다. 본 연구에서도 mtDNA와 28S rRNA에 대해 각각 validation experiment를 시행하였다. 실험 결과 두 실험 모두 반응 시료 양의 log 에 대한 ΔCT의 기울기 절대값이 0.1보다 작았다. 이 결 과를 토대로 endogenous reference로 사용한 28S rRNA와 mtDNA의 PCR efficiency사이에 유의한 차이가 없다는 것을 확인함으로써, 두 시료간의 threshold cycle (CT) 차 이를 이용한 relative quantitation법을 인증할 수 있었다.

또한 대조군과 환자군 모두에서, mtDNA는 mtDNA/28S rRNA에 대해 유의한 양성 상관관계 (각각, r=0.774, P<0.001; r=0.556, P=0.001)를, 28S rRNA는 유의한 음성 상관관계 (각각, r=-0.677, P<0.001; r=-0.627, P=0.001)를 보여 이러한 검사법이 실제적으로도 유효하며, 단계적 희석에 의한 표준곡선을 그리지 않고도 상대적인 정량 이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

이렇게 얻어진 28S rRNA에 대한 mtDNA copy 수의 비 (mtDNA/28S rRNA)는 조기 난소부전으로 진단된 환 자군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다 (0.58±

0.38 vs. 1.15±0.67; P<0.01). 또한 대조군에서는 채혈시 연령과 mtDNA copy 수에 대한 연관성이 전혀 확인되지 않았던 반면 (r=0.047, P=0.808), 환자군에서는 유의한 정 도의 상관 관계가 입증되었다 (r=-0.487, P=0.006). 그러 나, 조기 난소부전의 증상 발현부터 채혈까지의 기간과 는 연관이 없었다 (r=-0.099, P=0.604). 따라서 난소 기능 이 정상인 경우에는 연령이 mtDNA copy 수에 미치는 영향을 무시할 수 있으나, 일단 난소 기능이 중단되면 mtDNA copy 수는 난소 기능 중단 시점부터의 기간보다 는 난소 기능 중단 시점의 연령에 의하여 더 큰 영향을 받는 것으로 생각된다.

이상의 결과로 조기 난소부전 환자의 정맥혈 내 mtDNA copy수의 감소가 확인되었고, endogenous reference를 이용한 comparative CT법이 검증되었다. 이로 써 조기 난소부전의 선별검사로 mtDNA copy 수 분석의 응용 가능성을 확인할 수 있었고, 향후 임신 등을 위한

난자 동결 등의 보다 적극적인 처치에 대한 선택 가능성 을 부여할 수 있으리라 생각된다. 향후 조기 난소부전에 서의 세포자멸사와 사립체의 역할에 대한 연구가 더 진 행되어야 하겠고, 민감도와 특이도를 유지하면서 난소의 기능을 쉽게 평가할 수 있는 방법을 개발하는데 더 많은 연구가 필요하다.

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=국문초록=

목적 : 본 연구는 조기 난소부전의 병태생리 중 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 세포자멸사에 사립체 DNA (mtDNA)가 연관되어 있음을 이용하여, 혈중 성선자극호르몬 증가 외에 다른 증상이나 징후가 없는 젊은 여성을 대상으로, 향후 조기 난소부전으로의 이행 가능성을 선별할 수 있는 방법을 고안하고자 계획되었다.

연구 방법 : 40세 미만의 조기 난소부전 환자군 (n=30)과 2회 이상 출산의 경험이 있고 혈중 성선자극호 르몬 수치가 정상인 40세 미만의 대조군 (n=30)의 정맥혈을 채취하여 DNA를 추출한 후 실시간 중합효소 연쇄 반응을 시행하고, comparative CT법으로 28S rRNA에 대한 mtDNA copy 수의 상대적인 비 (mtDNA/28S rRNA)를 계산하고, 두 군 간의 차이를 확인하였다.

결과 : 대조군의 mtDNA/28S rRNA비 (1.15±0.67)에 비해 환자군의 mtDNA/28S rRNA비 (0.58±0.38)는 유 의한 감소를 나타내었다 (P<0.01). 대조군에서 mtDNA/28S rRNA에 대해 mtDNA는 유의한 양성 상관관계 (r=0.774, P<0.001)를 나타낸 반면, 28S rRNA는 유의한 음성 상관관계 (r=-0.677, P<0.001)를 보였고, 환자군에서 도 mtDNA/28S rRNA에 대해 mtDNA는 유의한 양성 상관관계 (r=0.556, P=0.001)를, 28S rRNA는 유의한 음성 상관관계 (r=-0.627, P=0.001)를 나타냈다.

결론 : 본 연구에서 조기 난소부전 환자의 정맥혈 내 mtDNA copy 수의 감소를 실시간 중합효소 연쇄 반 응을 통해 확인할 수 있었고, 이를 응용한 선별검사를 고안할 수 있었다.

중심단어 : 조기 난소부전, 사립체 DNA, 실시간 중합효소 연쇄 반응

bulletin #2: ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. P/N 4303859 Rev. A.

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