특성과 특성과

2005 2005 2005 2005년 년 년 년 8888월 월 월 월 석사학위논문 석사학위논문 석사학위논문 석사학위논문

치성유령세포종의 치성유령세포종의 치성유령세포종의 면역조직화학 치성유령세포종의 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 특성과

특성과 특성과

특성과 ββββ-catenin -catenin -catenin -catenin 돌연변이 돌연변이 돌연변이 돌연변이 검색 검색 검색 검색

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2005 2005 2005

2005년 년 년 8888월 년 월 월 월 일 일 일 일

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황 황 황 덕 황 덕 덕 호 덕 호 호 호

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특성과 특성과

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지 도 교 수 안 안 안 상 안 상 상 상 건 건 건 건

이 이 이

이 논문을 논문을 논문을 치의학 논문을 치의학 치의학 석사학위신청 치의학 석사학위신청 석사학위신청 논문으로 석사학위신청 논문으로 논문으로 제출함 논문으로 제출함 제출함. . . . 제출함

2005 2005 2005

2005년 년 년 년 4444월 월 월 월 일 일 일 일

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황 황 덕 황 황 덕 덕 호 덕 호 호 호

황덕호의 석사학위논문을 인준함

위원장 조선대학교 교수 윤 정 훈 인

위 원 조선대학교 교수 김 도 경 인 위 원 조선대학교 교수 안 상 건 인

2005 2005

2005 2005년 년 년 년 5555월 월 월 월 일 일 일 일

조선대학교 조선대학교 조선대학교

조선대학교 대학원 대학원 대학원 대학원

Contents Contents Contents Contents

도목차 도목차도목차 도목차 Abstract AbstractAbstract Abstract

Ⅰ

ⅠⅠ

Ⅰ. . . . 서론 서론 서론 서론

··· 1111

Ⅱ

ⅡⅡ

Ⅱ. . . . 재료 재료 재료 재료 및 및 및 및 방법 방법 방법 방법

··· 2222

A. A. A. A. 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 및 및 및 Tunel 및 Tunel Tunel Tunel assay assay assay assay

··· 2222

B. B. B. B. ββββ-catenin-catenin-catenin-catenin의 의 의 의 돌연변이 돌연변이 돌연변이 검색 돌연변이 검색 검색 검색

···3333

ⅢⅢⅢ

Ⅲ. . . . 연구결과 연구결과 연구결과 연구결과

··· 4444

A. A. A. A. 병리조직학적 병리조직학적 병리조직학적 병리조직학적 소견 소견 소견 소견

··· 4444

B. B. B. B. 면역조직학적 면역조직학적 면역조직학적 면역조직학적 소견 소견 소견 소견

··· 4444

C. C. C. C. ββββ-catenin-catenin-catenin의 -catenin의 의 의 돌연변이 돌연변이 돌연변이 검색 돌연변이 검색 검색 검색

··· 6666

Ⅳ

ⅣⅣ

Ⅳ. . . . 고찰 고찰 고찰 고찰

···

ⅤⅤⅤ

Ⅴ....참고문헌 참고문헌 참고문헌 참고문헌

··· 10 10 10 10

Abstract Abstract Abstract Abstract

Immunohistochemical Immunohistochemical Immunohistochemical characterization Immunohistochemical characterization characterization and characterization and and and ββββ-catenin -catenin -catenin -catenin mutation mutation mutation mutation in

in in

in oooodontogenic dontogenic dontogenic dontogenic ghost ghost ghost ghost cell cell cell tumor cell tumor tumor tumor

Adviser: Prof. Sang-Gun Ahn PhD Department of Dentistry,

Graduate School of Chosun University

Odontogenic ghost cell tumor (OGCT) is considered as a neoplastic counterpart of the calcifying odontogenic cyst (COC). β-catenin mutations have been described in COC suggesting a critical role in its histogenesis. In this study, we report a patient with OGCT contains a missense mutation on codon 3 (ACT -> TCT). Immunohistochemistry showed nuclear, cytoplasmic, and membranous accumulation of β-catenin in the tumor cells.

TUNEL assay showed positive signals in nucleated cells adjacent to the ghost cells. Our data suggest that β-catenin plays an important role in the tumorigenesis of OGCT. OGCT may developed by improper differentiation process coordinated by WNT signaling pathway. Further studies are needed to determine a genotypic/phenotypic characteristics of ghost cell containing odontogenic lesions.

Key words: odontogenic ghost cell tumor, calcifying odontogenic cyst, β -catenin

I. I. I. I. 서 서 서 론 서 론 론 론

치성 유령세포종은 상아질 형성 유령세포종으로도 불리며 석회화 치성낭의 고형형 또는 종양형으로 알려져 있다¹⁾. 조직학적으로 법랑모세포종의 특성과 함께 유령세포와 유상아질이 혼재된 것이 특징이다^2,3). 이 종양은 기존에 존 재하던 석회화 치성낭으로 부터 발생하거나 또는 처음부터 새로이(de novo) 발생할 것으로 생각하고 있지만 그 병인론에 대해서는 알려진 바가 없다¹⁾. 최근에 조직학적으로 유령세포가 나타나는 종양인 석회화 치성낭, 모기질종, 두개인두종에서 β-catenin 돌연변이가 흔하고 과발현한다는 논문이 발표되 어 β-catenin이 유령세포를 포함하는 종양의 발생에 관여할 것으로 생각하 고 있다^4,5). 이에 저자는 치성 유령세포종에서 β-catenin 발현과 돌연변이를 관찰하여 이를 보고한다.

II. II. II. 재료 II. 재료 재료 재료 및 및 및 및 방법 방법 방법 방법

A.

A. A.

A. 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 및 및 및 및 TUNEL TUNEL TUNEL TUNEL assay assay assay assay

면역조직화학 염색은 통법에 따라 파라핀 포매조직을 만든 후 박절 표본을 xylene 용액에서 30분간 파라핀을 제거하고 95%, 90%, 70% 알콜과 증류수 에 순차적으로 함수하였다. 3% H2O2로 20분간 endogenous peroxidase를 제 거한 후, 0.1% trypsin으로 효소 처리하여 항원 부위를 노출시키고, goat serum에 30분간 반응시켰다. 일차항체로는 β-catenin(C19220, 1:200, Transduction Laboratories, Lexinton, KY), cytokeratin AE1/3(1:200, Biogenex, San Ramon), Bcl-2(1:50, Santa Cruz co., Santa Cruz, CA)를 4^oC overnight으로 반응시키고, avidin-biotin method로 면역조직화학 염색 을 시행한 후, Diaminobenzidine(DAB)로 발색하고 Mayer's hematoxylin으 로 대조염색하여 관찰하였다.

TUNEL assay는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 4 μm의 파라핀 연속 절편을 silane 으로 처리한 슬라이드에 채득하여 60^oC에서 30분간 방치한 후 실온에서 xylene에 10분간 2회 담그어 파라핀을 제거하고, 100% ethanol에 10분간 2번 처리하였다. Proteinase K 용액에 4^oC에서 10분간 preincubation 시키고, 증류수에 세척한 후, 3% H2O2 in methanol 용액에 5분 간 처리하였 다. TdT buffer용액에 실온에서 15분간 처리한 뒤, 200 mM NaCl의 humid chamber에서 TdT-enzyme 처리한 용액에 37^oC에서 1시간 처리하였다. 이 때, TdT enzyme 용액은 TdT 1.2 μl을 TdT buffer 25 μl과 dUTP 1 μl, 증 류수 23 μl에 섞어 1:50으로 희석하여 사용하였다. TB buffer에 10분간 처 리한 후, Streptavidin-peroxidase(Vector, Burlingame, Calif)로 37^oC 에서 30분간 처리하고 DAB로 발색, methyl green으로 대조염색을 시행하였다.

B. B. B.

B. ββββ-catenin -catenin -catenin -catenin의 의 의 돌연변이 의 돌연변이 돌연변이 검색 돌연변이 검색 검색 검색

β-catenin 돌연변이 검색은 파라핀 포매된 조직을 4 μm 두께로 박절한 후 종양조직을 선택적으로 채취하고 기존에 알려진 추출방법 (modified single step DNA extraction method)으로 DNA를 추출하였다. Lysis buffer는 10 mM Tris buffer (pH 8.0), 10 mM EDTA, 150 mM Nacl, 0.1% SDS, 100 μ g/mL proteinase K로 하였으며, 50^oC에서 조직이 완전히 녹을 때까지 12-24 시간 반응시켰다. 추출된 DNA는 TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 녹인 다음 분광광도계를 이용하여 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하 고 실험 전까지 4^oC에 보관하였다.

Sense 5'-ATGGCTACTCAAGCTGATTTGATGGAG-3'과 antisense 5'-GCTACTTGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3' primer를 이용하여 다음 과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 94^oC에서 4분, 변성반응을 94^oC에서 30초, 결합반응을 55^oC에서 30초, 중합반응을 72^oC에서 30초간 40주기를 반 복하고 마지막 중합반응은 72^oC에서 10분간 연장하여 반응시켰다. PCR반응 산물은 1.8% agarose gel에서 전기영동하여 확인하고 Gel Extraction kit (GIAGEN)을 이용하여 회수하였다. 회수된 PCR 산물은 pGEM-T Easy vector (Promega)에 cloning한 후 sequencing을 수행하였다.

III. III. III. 연구결과 III. 연구결과 연구결과 연구결과

A. A. A.

A. 병리조직학적 병리조직학적 병리조직학적 병리조직학적 소견 소견 소견 소견

병리조직학적으로 다수의 유령세포 군집과 석회화를 보이는 치성상피들이 판상이나 섬을 이루며 증식하고 있었다. 종양의 상피성분은 역극성을 보이는 원주형 기저세포로 둘러싸여 법랑모세포로의 분화가 보였고, 그 내부는 성상 망과 유사한 구조가 관찰되었다. 상피성분에 인접하여 상아질양 조직도 관찰 되었지만 상아세관은 없었다. 괴사나 비정형 세포분열, 다형성증은 보이지 않 았다 (Fig. 1).

Fig. 1. Tumor composed of sheets and islands of ameloblastic epithelium, including clusters of ghost cells with focal calcification.

B.

B. B.

B. 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 소견 소견 소견 소견

종양 구성성분에서 법랑상피의 책상배열을 하는 원주상피는 세포질과 세포막 에 중등도의 β-catenin 발현을 보였다. 유령세포에 인접하여 국소적으로 군집 된 세포에서 세포질, 세포막, 핵에 관계없이 강한 발현이 관찰되었다. 법랑상피

내의 성상망과 유사한 구조에서 국소적으로 군집된 세포에서도 유령세포에 인접 하여 국소적으로 군집된 세포와 유사하게 강한 발현이 관찰되었다. 그러나, 성상 망 자체의 세포는 미약하거나 중등도의 발현을 보였고 유령세포와 간질조직은 음성이었다 (Fig. 2).

종양세포에서 cytokeratin에 중등도의 발현이 있었고, 유령세포 바로 인접부 에 핵이 잔존해 있는 세포는 강한 양성반응을 보였으며, 유령세포는 미약한 양성반응을 나타냈다 (Fig. 3). Bcl-2염색에서는 전 부위에서 음성반응을 나 타내었다. TUNEL 염색에서 유령세포에 바로 인접한 핵이 잔존해 있는 세포 는 양성 반응을 보였고, 핵이 소실된 유령세포는 음성 반응을 보였다 (Fig.

4).

Fig. 2. Moderate nuclear, cytoplasmic, and membranous accumulation for β -catenin. Cells around the ghost cells showed strong nuclear and cytoplasmic accumulation, but the ghost cells were negative....

Fig. 3. Cytokeratin AE1/3 was highly expressed in the tumor and ghost cells.

Fig. 4. Nucleated cells immediately adjacent to the ghost cells showed a positive reaction in TUNEL assay.

C.

C. C.

C. ββββ-catenin -catenin -catenin -catenin의 의 의 돌연변이 의 돌연변이 돌연변이 검색 돌연변이 검색 검색 검색

DNA 서열 분석 결과 β-catenin 유전자의 세 번째 codon에서 돌연변이가 발견

되었는데 (ACT→ TCT) 이는 β-catenin codon 3를 threonine에서 serine 으로 변환시킨다 (T3S) (Fig. 5).

Fig. 5. DNA sequencing chromatogram. Arrow indicates missense mutation of β-catenin codon 3.

IV. IV. IV. IV. 고 고 고 찰 고 찰 찰 찰

β-catenin은 세포내 APC(Adenomatous polyposis coli)/β-catenin/Tcf (T cell factor) 경로 신호 전달체계와 세포막에서 cadherin-catenin계 세포간 접합 부를 구성하는 분자이다⁶⁾. β-catenin은 APC 단백과 결합하여 glycogen synthase kinase(GSK)-3β에 의해 인산화 되면 세포내 단백 분해 매개체인 ubiquitin과 결합하여 단백 분해 효소 복합체인 proteosome에 의해 분해된다⁷⁾. APC 유전자의 돌연변이로 β-catenin과의 결합이 이루어지지 않거나 β -catenin 유전자 자체의 돌연변이로 인해 인산화 과정이 이루어지지 않으면, β-catenin은 안정화되어 세포질 내에 축적되고, 핵내로 들어가서 Tcf/LEF (lymphoid effector factor) family의 단백질과 결합하여 DNA 전사를 촉진한 다^6,7). APC/β-catenin/Tcf 경로의 표적 유전자로는 종양유전자인 c-myc⁸⁾, 기질 복합체인 matrilysin⁹⁾, 세포주기에 관여하는 cyclin D1 ¹⁰⁾등이 보고된 바 있다. 이러한 일련의 과정은 Wingless/WNT 경로, 또는 APC/β -catenin/Tcf 경로라 불린다⁶⁾.

β-catenin 유전자 돌연변이는 대장암에서 주로 연구되었고^8-10), 최근 유령 세포가 나타나는 모기질종¹¹⁾, 두개인두종과 석회화 치성낭에서 β-catenin 돌 연변이가 흔하고 과발현된다는 논문이 발표되어 β-catenin이 유령세포를 포 함하는 종양의 발생에 관여할 것이라 생각되고 있다^4,5). WNT 신호 경로는 치 아 발생에도 필수적인 역할을 수행한다¹²⁾. 치아발생 과정에서 β-catenin 유전 자에 돌연변이가 일어나면 β-catenin의 안정화가 초래되어 Tcf/LEF-1 경로에 따른 표적 유전자의 전사가 지속적으로 활성화된다. 이에 따라 WNT 신호경로 에 의한 정상적인 분화과정이 방해받게 되면 석회화 치성낭이 형성될 것이라 생 각된다⁵⁾. Sekine등⁵⁾은 석회화 치성낭 10예 중 9예에서 β-catenin 돌연변이를 관찰하여 β-catenin 돌연변이가 석회화 치성낭의 발생에 중요한 역할을 할 것 이라 주장하였다. 특히, 돌연변이가 GSK-3β에 의한 인산화 부위에 일어남으로

써 GSK-3β 의존 인산화가 억제되고 이어지는 proteosomal degradation에 의 해 β-catenin이 분해되지 못하므로 세포질과 핵내에 축적되어 표적유전자의 발 현을 유도하는 것으로 믿고 있다⁵⁾.

이 연구에서도 DNA 서열 분석 결과 β-catenin 유전자의 세 번째 codon에서 돌연변이가 발견되었는데 (ACT→ TCT), 이는 β-catenin codon 3를 threonine 에서 serine으로 변환시킨다 (T3S). Codon 3의 돌연변이는 조직학적으로 유령 세포를 나타내는 모기질세포종이나 다른 악성종양에서 이전에 보고된 경우도 없 고 GSK-3β에 의한 인산화 부위도 아니지만 면역조직화학적으로 종양세포의 세포질과 핵에 강한 β-catenin의 발현이 관찰되었다. Codon 3의 돌연변이에 의 해 β-catenin이 안정화 되었을 가능성이 희박하기 때문에 이 종양에서 확인된 증가된 β-catenin의 발현은 WNT ligand나 receptor의 증폭, APC나 axin과 같 이 WNT/β-catenin/LEF signal에 관여하는 다른 단백질의 유전적 변화에 의할 가능성이 높다. 한편 Sasaki등¹³⁾은 LEF1 유전자를 결여시킨 마우스에서 치성상 피의 apoptosis가 증가함을 관찰하여, 치아형태 발생에서 LEF1이 치성상피의 생존에 중요한 역할을 수행할 것이라는 사실을 보고하였다. 이 증례에서도 유령 세포에 바로 인접한 핵이 잔존해 있는 치성상피 세포가 TUNEL assay 결과 apoptosis 양성 반응을 보였다. 따라서 앞으로 이 부위에서 LEF1의 돌연변이 에 대한 검증을 수행함으로써 LEF1의 돌연변이로 인해 치성상피의 apoptosis가 초래되어 종양이 발생하였을 가능성을 확인하는 과정이 필요하며 이는 종양 발 생과정에서 β-catenin/LEF1의 역할을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 것이 다. 아울러 유령세포에 β-catenin의 발현이 없는 점과 TUNEL assay 결과를 종합할 때 유령세포가 종양발생 과정에서 apoptosis과정을 밟아 최종분화가 일 어나는 것으로 추측되지만¹⁴⁾ 이는 앞으로 풀어야 할 과제이다.

Ⅴ Ⅴ Ⅴ Ⅴ. . . . 참고문헌 참고문헌 참고문헌 참고문헌

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(별 지)

저작물 저작물 저작물 저작물 이용 이용 이용 이용 허락서 허락서 허락서 허락서

학 과 치의학과 학

번 20037062 과

정 석사

성 명 한글: 황덕호 한문 : 黃德虎 영문 : Deok-Ho Whang

주 소 200-180 강원도 춘천시 석사동 대우아파트 103동

1304호

연락처 E-MAIL : hdh10177@naver.com

논문제목

한글:치성유령세포종의 면역조직화학특성과 β-catenin 돌연변이 검사

영문:Immunohistochemical characterization and β -catenin mutation in odontogenic ghost cell tumor

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년 월 일

저작자: (서명 또는 인)

조선대학교 총장 귀하