서론
최근 임상의학연구의 지속적인 발전에 따라 대량의 검체 를 동시에 분석하거나, 임상 검체를 안정적으로 보관하여 연구에 사용하는 것에 대한 요구가 높아져 왔다. 이에 연구 용 검체를 수집, 보존하여 안정적으로 공급할 수 있는 검체 은행의 역할이 중요하게 제기되고 있다. 검체은행의 보관대 상은 시술 후 공여된 조직, 검사 혹은 연구를 위해 제공된 핵산 검체와 혈액 검체로 구분된다. 이 중 혈액 검체는 임상 의학에서 가장 일반적으로 사용하는 검체로 혈장 혹은 혈청 의 형태로 보관된다. 이는 적은 양으로도 개인의 전반적인
단백질 프로파일을 반영하면서 비교적 안전하게 얻을 수 있 기 때문이다. 따라서 새로운 바이오마커를 조직에서 발견한 다고 하더라도 임상에서의 적용은 혈청이나 혈장을 사용하 는 경우가 많다.
임상검사실에서 혈액검사가 시행될 때는 원활한 검사 수 행, 재검 또는 추가검사 등을 위하여 충분한 양의 검체를 사 용하여 왔으며, 검사가 완료된 후의 잔여 검체를 적절히 보 관하였다가 각종 의학연구 혹은 검사실 장비 평가 등에 이 용하여 왔다. 대량의 검체를 사용하는 연구가 증가하면서 보관된 검체의 품질에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다 [1-10]. 이는 검체의 수집과 보존과정에서 검체의 안정성
Long-Term Stability of Selected Serum Biomarkers in Leftover Samples
Borae G Park
1, Chunhwa Ihm
1, Yong-Hak Sohn
1, and Eun-Hye Choi
21
Department of Laboratory Medicine, Eulji University School of Medicine;
2Eulji Medi-Bio Research Institue, Eulji University, Daejeon, Korea
Background: The purpose of this study was to assess the quality of long-term-stored leftover blood samples, and to evaluate the long-term stability of selected serum biomarkers such as proteins, enzymes, electrolytes, and tumour markers.
Methods: Stored blood samples were transferred to our biobank after being used to conduct tests for routine medical examinations in one health care institution, and were preserved at or below -70°C for 4 years. We analysed 24 biomarkers whose levels had been reported 4 years ago and tested them using the same analyser, reagents, and methods by utilizing an ADVIA Centaur Immunoassay System (Siemens Healthcare Diagnostics, USA) or an ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens, USA).
Results: A total of 15 out of the 24 tested biomarkers showed significant differences in paired Student t-tests (P<0.01). Among them, 5 biomarkers (free T3, free T4, thyroid stimulating hormone, carcino-embryonic antigen, and alpha feto-protein) showed significant differences and high correlation coefficients (R
2>0.975). Two biomarkers, creatinine and rheumatoid arthritis factor, showed no significant differences but were poorly correlated with previously analysed data.
Aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, hepatitis B virus (HBV) surface antigen, and insulin levels were discordant according to their reference ranges. A total of 3 biomarkers, C-reactive protein, cancer antigen 125, and HBV surface antibody, showed no significant differences and good correlations without discordant data.
Conclusions: Our findings showed that long-term storage for more than 4 years can result in a considerable bias for variable biomarkers. Only 3 of the 24 biomarkers evaluated were found to be stable biomarkers. Long-term storage of leftover samples is not recommended for most chemical analyses.
(J Lab Med Qual Assur 2013;35:122-32)
Key Words: Protein Stability, Enzyme Stability, Serum markers, Blood serum
Corresponding author:
Chunhwa Ihm
Department of Laboratory Medicine, Eulji University Hospital, Eulji University School of Medicine, 95 Dunsanseo-ro, Seo- gu, Daejeon 302-799, Korea Tel: +82-42-611-3478 Fax: +82-42-611-3464 E-mail: [email protected]
pISSN: 1225-097X
eISSN: 2288-7261 Received May 21, 2013, Revision received September 9, 2013, Accepted September 16, 2013
과 내부에 존재하는 물질의 질적인 변화로 연구결과에 치명 적인 결과를 초래하기 때문이다. 따라서 여러 곳의 검체은 행 검체를 사용할 경우 표준화된 품질관리조건을 성립해 검 체은행 간의 차이를 최소화할 수 있어야 한다.
검체은행의 목적은 단순히 인체자원의 보관이 아니라 잘 보존되고 분석전 변이요인을 최소화한 고품질의 인체자원 을 분양하는 것이다. 자원의 품질은 생물학적 변이뿐 아니 라 채취, 처리, 보관조건 등의 분석 전 변이에 의해 결정된 다. 분석 전 변이의 영향은 수행될 연구, 분석물질, 사용방 법 등과 직접적인 연관이 있다. 일반적으로 혈액 검체에 대 한 품질관리는 DNA나 RNA 같은 핵산과 비교할 때 쉽지 않다. 이는 적당한 안정성 표지자도 없고, 보관 전 상태, 보 관형태, 용기, 온도 및 기간 등에 따라 변화가 매우 다양하 기 때문이다. 또한 동일한 프로토콜로 채취되고 보관된 검 체일지라도 숙련되지 않은 검사자에 의해 수행되는 경우 사 람에 의한 변이 역시 존재할 수 있다.
그럼에도 불구하고 혈액 검체 내 바이오마커에 대한 안정 성 연구는 전립선특이항원(prostate specific antigen) 혹 은 MMP-9 (matrix metalloproteinase-9) 등 일부 종목 에 대해서만 제한적으로 진행되어 왔으며, 일상적으로 이루 어지고 있는 단백질, 효소, 종양표지자 등의 일반검사항목 에 대해서는 장기간 보관에 대한 검체의 안정성 연구는 상 대적으로 적게 이루어져 있다[1-10]. 대표적인 선행연구의 내용은 Table 1과 같다.
실제 임상검사에 사용되고 있는 시약설명서에서는 2-8
oC 온도에 검체를 냉장 보관하는 경우 검사가 가능한 허용시간을 2일 혹은 7일 이내로 제시하고 있다. 이는 임상 검사용 시약은 채취 후, 짧은 시간에 검사가 이루어져야 한 다는 전제조건이 있기 때문이며, 장기간 냉동 보관한 혈액 검체의 결과 변화에 대한 연구는 많이 이루어지지 않았다 [11].
본 연구에서는 미래의 연구를 위하여 보관하고 있었던 잔
Table 1. Historical aspects of biochemical biomarker stability evaluation
Year Analyte Analysis method Result Reference
The analyses did not involve the use of an automatic analyser
1998 Total PSA, free PSA Hybritech Tandem-R Stable for 2 yr at -70°C Woodrum et al. [1]
2004 MMP-9 Zymography, ELISA,
western blotting MMP-9 degrades over time, unstable
for 2 yr at -80°C Rouy et al. [2]
2008 Aflatoxin B1 HPLC, mass spectrometry Stable for 10 yr Scholl et al. [3]
2010 CRP ELISA Stable for 34 mo at -20°C Brindle et al. [4]
2010 Cholesteryl ester, TG,
phospholipid Gas chromatography Stable for 10 yr at -80°C Matthan et al. [5]
The analyses were performed by using automatic analysers
2008 PSA - PSA: Stable for 7 yr at -80°C Reed et al. [6]
2008 UA, bilirubin, K+ - UA, bilirubin: decrease, potassium:
increa se after 25 yr Gislefoss et al. [7]
2009 Alb, AST, ALT, CK, insulin, C-peptide, ferritin, transferrin, cystatin C, IgE, IgG, SHBG
- ALT, CK, insulin, C-peptide, ferritin:
decrease, transferrin: increase after 25 yr Alb, AST, cystatin C, IgE, IgG, SHBG:
stable for 25 yr
Gislefoss et al. [8]
2010 BUN, TP, Cr - Cr and TP: stable, BUN: unstable
for 3 yr at -80
oC Kim et al. [9]
2010 Free T3, free T4, TSH - Free T3, free T4, TSH: decreased after 5 yr Panesar et al. [10]
Abbreviations: PSA, prostate specific antigen; MMP-9, matrix metalloproteinase-9; CRP, C-reactive protein; TG, triglyceride;
UA, uric acid; Alb, albumin; CK, creatinine kinase; IgE, immunoglobulin E; IgG, immunoglobulin G; SHBG, sex hormone
binding globulin; BUN, blood urea nitrogen; TP, total protein; Cr, creatinine; TSH, thyroid stimulating hormone.
여 검체를 대상으로 보관 전의 검사결과와 비교를 통해 연 구용 검체로서 잔여 검체의 유용성 여부와 잔여 검체를 장 기간 보관한 뒤 분석물질의 안정성을 평가해보고 이를 통해 연구용 혈액 검체를 위한 안정성 표지자에 대한 후보물질을 제시해 보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 검체보관
2006년 12월부터 2007년 3월까지 1개 의료기관에 건강 검진을 위해 내원한 환자에서 의뢰된 모든 검사를 완료한 뒤, 남은 검체량이 충분한 763명을 대상으로 잔여 검체를 혈청 분리하여 냉동 보관하였다. 모든 검체는 -70
oC 이하 를 유지하도록 24시간 온도 감시가 이루어지고 있는 냉동 고에 보관하였다. 잔여 검체는 총 4 mL의 검체를 1.5 mL tube에 0.85 mL씩 5개로 나뉘어 보관하였고, 모든 검체는 환자정보를 추적할 수 없도록 검체정보에 대한 암호화 작업
을 진행하고, 검체번호로 조회 시 잔여 검체량, 검체보관 기 간, 검체보관 위치, 검사결과 값만이 조회될 수 있도록 검체 를 보관하였다.
2. 검사항목, 검체선정과정
분석대상항목은 자동화 장비로 측정하는 항목 중 2006-2007년과 2011년 사이에 측정방법 및 측정시 약이 바뀌지 않은 항목을 선택하였다. 혈청검사항목 중 보관 전후 동일하게 사용하고 있는 장비는 ADVIA Centaur immunoassay system (Siemens Healthcare Diagnostics; Deerfield, IL, USA)과 ADVIA 2400 chemistry system (Siemens Healthcare Diagnostics) 이었다. ADVIA Centaur에서 지속적으로 측정하고 있 는 9항목(hepatitis B virus surface antigen [HBs Ag], hepatitis B virus surface antibody [HBs Ab], free T3, free T4, thyroid stimulating hormone [TSH], insulin, carcino-embryonic antigen [CEA], cancer antigen 125
Table 2. Individual analytes and analysis methods according to the analyser used
ADVIA Centaur ADVIA 2400 Chemistry System
Analyte No. of samples Analysis method Analyte No. of samples Analysis method HBs Ag 47 CLIA Creatinine 60 Jaffe reaction
HBs Ab 49 CLIA CRP 60 Turbidimetric immunoassay
Free T3 24 CLIA RA factor 55 Turbidimetric immunoassay
Free T4 29 CLIA AST 60 UV without P5P
TSH 27 CLIA ALT 60 UV without P5P
Insulin 23 CLIA LDH 60 Pyruvate to lactate
CEA 48 CLIA ALP 60 p-nitrophenylphosphate kinetic method CA 125 32 CLIA Phosphorus 60 Phosphomolybdate with reduction method AFP 48 CLIA LDL cholesterol 60 Elimination/catalase
HDL cholesterol 60 Elimination/catalase Uric acid 60 Uricase
CK 60 NAC activated
Sodium 60 ISE diluted (indirect) Potassium 60 ISE diluted (indirect) Amylase 60 Ethyidene blocked-PNPG7
Abbreviations: HBs Ag, hepatitis B virus surface antigen; CLIA, chemiluminescent immunoassay; HBs Ab, hepatitis B virus
surface antibody; CRP, C-reactive protein; RA, rheumatoid arthritis; UV, ultraviolet; TSH, thyroid stimulating hormone; LDH,
lactic acid dehydrogenase; CEA, carcino-embryonic antigen; ALP, alkaline phosphatase; CA 125, cancer antigen 125; AFP,
alpha feto-protein; CK, creatinine kinase; ISE, ion-selective electrodes; NAC, N-acetyl cysteine; PNPG7, p-nitrophenyl-D-
maltoheptaoside.
[CA 125], alpha feto-protein [AFP])과ADVIA 2400에 서 측정하는 15항목(creatinine [Cr], C-reactive protein [CRP], rheumatoid arthritis [RA] factor, AST, ALT, lactic acid dehydrogenase [LDH], alkaline phosphatase [ALP], phosphorus, LDL cholesterol, HDL cholesterol, uric acid [UA], creatinine kinase [CK], sodium, potassium, amylase)을 대상으로 하였다.
각 항목별로 검사결과 값이 낮은 값부터 높은 값까지 고 르게 분포할 수 있도록 검체를 선택하고, 분석 가능한 검체 량을 고려하여 항목별로 ADVIA Centaur와 ADVIA 2400 에서 각 50검체와 60검체의 분석을 시행하였다. 이 중 검체 량이 부족하거나 이전 검사결과를 확인할 수 없는 경우 연 구에서 제외하여 각 항목별 연구에 포함된 검체 수는 Table 2와 같다.
3. 통계분석
검체분석은 2일에 걸쳐 진행되었으며, 첫째날 ADVIA 2400의 15 측정항목에 대해 60검체를 먼저 분석하고, 둘 째날 ADVIA Centaur의 9측정항목에 대한 50검체를 분석 하였다. 잔여 검체는 소량씩 분주되어 있으므로, 실온에서 1시간 동안 완전 해동시킨 후 검체를 한 개의 튜브에 모아 각 해당 장비에서 분석하였다. 검체에 미치는 온도 및 외부 조건의 영향을 최소화하기 위해 해동 후 2시간 이내에 모든 분석과정을 완료하였다. 검체보관 및 분석과정에 영향을 줄 수 있는 다양한 온도조건은 Fig. 1에 나타내었다.
통계분석은 대응표본 t-검증(paired t-test)을 이용하여 양측검증으로 유의한 차이를 분석하였으며, 회귀분석을 통 해 검사결과 사이의 상관성 여부를 확인하였다. 각 분석결 과는 단위 및 정상 범위가 모두 다르기 때문에 보관 전 측 정결과와 보관 후 측정결과 사이의 퍼센트 변화를 기준으로 차이를 분석하였다. P값은 0.01 미만인 경우 유의한 차이로 분석하였으며, R
2값은 0.975 이상인 경우 상관관계가 좋은 것으로 분석하였다. 또한 정상 혹은 비정상으로 결과가 나
뉘는 검사결과에 대해서는 보관 전후 측정값의 변화에 따라 보고 값이 바뀌게 되는지 여부를 확인하였다. 통계분석 프 로그램은 MedCalc ver. 11.4 (Broekstraat, Mariakerke, Belgium)를 사용하였다.
결과
대응표본 t-검증 분석결과 총 24개의 검사항목 중 15항 목에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P＜0.01). 이 중 5항목(free T3, free T4, TSH, CEA, AFP)은 대응표본검 증에서는 유의한 차이가 있었으나 상관관계는 좋은 것으로 분석되었다(Table 3).
Cr과 RA factor는 대응표본검증에서는 유의한 차이를 보 이지 않았지만 상관관계가 좋지 않은 항목으로 분석되었 다(R
2＜0.975) (Table 3). AST와 ALT의 경우 과거 결과 와 비교하여 좋은 상관관계를 나타내고 있었으며 통계적으 로 유의한 차이도 없었으나 각각 35.0% (21/60), 55.0%
(33/60)에서 정상 범위를 벗어나 높은 범위에 있던 값이 정 상으로 측정되거나 정상 범위였던 값이 정상보다 낮은 값으 로 측정되는 경우가 있었고 ALT의 경우 1검체에서 정상보 다 낮은 범위에 있던 값이 정상 범위 내로 측정되는 경우가 있었다(Table 3). CRP, insulin, CA 125의 세 항목에 대해 서는 통계적으로 유의한 차이 없이 좋은 상관관계를 보이고 있었으며, insulin의 경우 1검체에서 참고치를 기준으로 정 상이던 값이 낮은 값으로 측정되는 결과를 나타내었다.
정상 참고치를 기준으로 볼 때 Cr, AST, ALT, LDH, sodium 등의 항목은 측정한 검체의 1/3 이상에서 불일치 하는 결과를 나타내었다(Table 3, Fig. 2). 특히 sodium 의 경우에는 작은 차이지만 대부분의 검체에서 결과값이 증 가하여 83.3% (50/60)의 검체에서 이전에는 정상 범위 내 에 있던 결과값이 장기간 보관 후에는 정상 범위를 벗어나 는 값을 나타내고 있었다. Potassium, amylase, uric acid, phosphorus 등의 항목에서는 장기간 보관 후 높아지는 결
Fig. 1. Flow chart of pre-pre ser-
vation, preservation, and analysis
processes. Abbreviations: SST,
serum separate tube; RT, room
temperature; PPT, polypropylene
tube.
Ta ble 3. Da ta u se d f or sta tist ic al an al yses an d d isc re pan t r esul ts f or co m pari so ns t o r ef er en ce r an ges An al yt e M ean % di ffe re nce P-va lu e fo r pa ire d t-t est* R egr es sio n eq ua tio n* R
2* P-va lu e f or regr es sio n eq ua tio n*
N of d isc re pan cies H ig h→ no rm al N or m al → low Low → no rm al N or m al → hi gh C rea tin ine 1.62 0.3645 y=1.0283x -0.0118 0.7044 <0.001 9 4 7 C R P 17.85 0.0326 y=0.9796x+0.0450 0.9977 <0.001 R A f act or 92.08 0.2775 y=1.6513x -5.5475 0.7017 <0.001 1 1 A ST -26.32 0.0371 y=0.6219x+4.2240 0.9976 <0.001 6 15 A LT -57.32 0.0392 y=0.2714x+5.9810 0.9880 <0.001 10 1 23 LD H -30.64 <0.0001 y=0.3158x+141.8150 0.4448 <0.001 26 4 A LP -19.54 <0.0001 y=0.8102x -0.3662 0.9609 <0.001 5 Phos pho ru s 6.35 <0.0001 y=1.0394x+0.0883 0.9901 <0.001 2 LD L cho les te ro l -23.63 <0.0001 y=0.7783x -1.4894 0.8317 <0.001 9 H D L cho les te ro l -14.11 <0.0001 y=0.6600x+10.6319 0.7727 <0.001 11 5 U ric acid 2.38 0.0031 y=1.0286x -0.0311 0.9755 <0.001 1 2 C K -39.13 <0.0001 y=0.6958x -9.3412 0.9923 <0.001 4 5 So diu m 4.57 <0.0001 y=0.4308x+87.9101 0.2321 <0.001 50 Pot as siu m 9.28 <0.0001 y=0.9237x+0.6891 0.8636 <0.001 2 3 A m yl ase 19.57 <0.0001 y=1.1743x+1.2892 0.9961 <0.001 1 4 H Bs Ag
†N A N A N A N A 5 H Bs A b
†N A N A N A N A Fr ee T3 9.80 <0.0001 y=1.0323x+0.2052 0.9701 <0.001 1 Fr ee T4 13.45 <0.0001 y=1.1306x+0.0052 0.9645 <0.001 2 TS H -9.00 0.0004 y=0.9512x -0.3279 0.9944 <0.001 In su lin 1.12 0.8300 y=0.9268x+0.5268 0.9859 <0.001 1 C EA 33.26 <0.0001 y=1.0118x+0.2757 0.9817 <0.001 1 C A 125 0.70 0.7924 y=1.0009x+0.3065 0.9844 <0.001 A FP 10.87 0.0001 y=1.0718x+0.0599 0.9730 <0.001 2 The d at a t ha t sho w ed s ta tis tic al ly sig nific an t d iffe re nc es a re m ar ke d i n b old . A bb re via tio ns : C R P, C -react iv e pr ot ei n; R A , r heu m at oid ar th rit is; LD H, lact ic acid deh ydr og en ase ; A LP , a lka line phos ph at ase ; C K , c rea tin ine ki na se ; H Bs Ag , he pa tit is B vi ru s s ur fa ce a nt ig en ; N A , n ot a na ly se d; H Bs A b, h ep at iti s B v iru s s ur fa ce a nt ib od y; T SH , t hy ro id st im ul at in g ho rm on e; C EA , c ar ci no -e m br yo ni c an tig en ; C A 125, c anc er a nt ig en 125; A FP , a lp ha fet o- pr ot ei n. *C om pa ris on a na ly se s w er e pe rf or m ed b y us in g th e pa ire d St ud en t t -t es t a nd li ne ar r eg re ss io n an al ys is.
†H Bs A g/ A b w er e no t a na ly se d by u sin g st at ist ic al eq ua tio ns bu t w er e es tim at ed b y u sin g d isc or da nt d at a b ase d o n t he cu t-off r el at iv e l ig ht u nit (R LU ) v al ue.
과를 보였고, 반면 AST, ALT, LDH, ALP, cholesterol, CK 등은 낮아지는 결과를 나타내었다(Tables 3, 4, Fig. 3).
HBs Ag과 HBs Ab의 경우 relative light unit (RLU)값 을 측정하므로 통계적으로 유의한 차이나 상관관계를 분석 하는 데 한계가 있어 RLU값의 cut-off (RLU, 2.0)을 기준 으로 불일치 결과를 보이는 검체 수를 기준으로 차이를 분 석하였다. HBs Ab의 경우 모두 일치하는 결과를 나타냈으 나, HBs Ag은 음성을 나타내던 값이 양성으로 평가된 경 우가 10.6% (5/47)에 해당했으며, 모든 경우에서 음성이던 결과가 9 미만의 낮은 RLU값을 보이는 약양성 결과로 분 석되었다(Table 4). 각 측정항목별 평균값, 최대값, 최소값, 대응표본 t-검증 대한 P값, 회귀분석에 대한 R
2값 및 참고 치를 기준으로 정상 범위를 벗어나는 값을 나타내는 검체 건수는 Tables 3, 4와 Fig. 3에 정리하였다.
고찰
최근 국내에서는 체외진단검사용 시약이 의료기기법으로 통합되어 이에 대한 제도적 정비가 강화되고 있으며 식품의 약품안전처의 가이드라인 등을 통해 체외진단제품의 임상 평가에 대한 새로운 기준이 마련되고 있다[12]. 가이드라인 등에서 요구하는 검체의 종류, 요건 및 수량을 확보하는 것 은 현실적으로 쉽지 않지만, 임상검사실의 잔여검체를 이용 한 검체은행 네트워크 등을 구성한다면 불가능한 일도 아닐 것이다.
본 연구에서는 새로운 바이오마커를 위해 빈번하게 사용 되고 있는 혈액검체에서 검사항목에 따른 안정성 평가를 목 적으로 하였다. 본 연구에서 AST, ALT는 유의한 차이는 아니었지만, 낮아지는 경향을 보였다. 기존의 장기간 보관 Fig. 2. The linear regression analysis between analyte levels in preserved samples and in fresh samples measured 4 years ago.
(A-C) Linear regression analysis graphs for 3 analytes (AST, ALT, and sodium) that showed a high amount of discrepancy according to the RL. (D) Linear regression analysis graph for 1 analyte (CRP), which was found to be stable for 4 years.
Abbreviations: RL, reference range; CRP, C-reactive protein.
Ta ble 4. A ve ra ge, m ax im um , an d mi ni m um va lu es of a ll sam ples t ha t w er e an al yse d An al yt e N o. of sam ples N or m al r ef er en ce ran ge Fr esh sam ple (4 yr a go ) A fte r p rese rva tio n Tota l C V % Av er ag e M ax M in Av er ag e M ax M in C rea tin ine (m g/dL) 60 0.9–1.3 1.01 1.50 0.70 1.02 1.60 0.66 2.2–3.7 C R P (m g/dL) 60 0–0.5 0.79 12.45 0.04 0.82 12.07 0.03 5.0 R A f act or (IU/m L) 55 0–18 17.73 195.4 2.5 22.28 457.7 0.6 3.3–9.8 A ST (IU/L) 60 15–40 55.52 1,265 14 38.75 787 10 2.0–3.0 A LT (IU/L) 60 10–40 70.32 1,782 8 25.07 482 2 1.1–3.7 LD H (IU/L) 60 208–378 394.90 1,213 246 266.53 585 136 1.9–2.0 A LP (IU/L) 60 25–100 81.67 178 40 65.80 145 27 2.6–3.2 Phos pho ru s (m g/dL) 60 2.7–4.5 3.94 9.9 2.7 4.18 10.5 2.9 1.6–2.6 LD L cho les te ro l (m g/dL) 60 0–129 114.00 324 41 87.23 254 21 3.0–3.2 H D L cho les te ro l (m g/dL) 60 40–60 55.53 90 32 47.28 71 26 2.1–2.5 U ric acid (m g/dL) 60 3.5–7.2 5.40 10.6 2.4 5.53 10.9 2.4 1.1–3.2 C K (IU/L) 60 26–200 138.57 1,222 30 87.07 862 17 0.9–1.6 So diu m (m Eq/L) 60 136–145 143.02 149 138 149.52 156 146 0.7–0.8 Pot as siu m (m Eq/L) 60 3.5–5.3 4.14 5.6 2.5 4.51 5.9 2.9 0.8–1.4 A m yl ase ( U/L) 60 20–104 71.40 288 16 85.13 336 20 0.7–1.4 H Bs Ag* (R LU v al ue) 47 N eg at iv e cu t-off <2.0 174.09 1,000 N D 207.12 1,000 N D 2.9–9.4 H Bs A b* (R LU v al ue) 49 Posit iv e cu t-off >15.0 198.63 1,000 <3.1 223.73 1,000 <3.1 2.6–7.8 Fr ee T3 ( pg/m L) 24 2.3–4.2 3.62 7.28 1.51 3.94 7.83 1.61 2.76–4.05 Fr ee T4 (n g/dL) 29 0.89–1.76 1.35 3.11 0.52 1.53 3.56 0.5 3.44–4.58 TS H ( μIU/m L) 27 0.35–5.50 7.46 48.78 0.03 6.76 47.6 0.0 3.17–5.87 In su lin (m U/L) 23 3.0–28.0 7.64 23.27 2.29 7.60 21.84 2.07 6.3–7.5 C EA (n g/m L) 48 0–5.0 1.94 8.48 0.10 2.24 8.43 0.28 3.4–5.5 C A 125 ( U/m L) 32 0–30.2 28.76 241.3 4.7 29.09 267.6 4.0 4.3–5.2 A FP (n g/m L) 48 0–8.1 5.35 16.4 1.1 5.79 17.9 1.6 4.9–6.1 A bb re via tio ns : M ax , m axi m um ; M in, m in im um ; C R P, C -react iv e p rot ei n; R A , r heu m at oid ar th rit is; LD H, lact ic acid deh ydr og en ase ; A LP , a lka line phos ph at ase ; C K , c rea tin ine ki na se ; H Bs Ag , he pa tit is B vi ru s s urf ac e an tig en ; R LU , r el at iv e lig ht un it; N D , not det ect ed ; H Bs A b, he pa tit is B vi ru s s urf ac e an tib ody ; TS H, th yr oid s tim ul at in g ho rmo ne ; C EA , c ar ci no -e mb ryo nic a nt ig en ; C A 125, c anc er a nt ig en 125; A FP , a lp ha fet o- pr ot ei n. *H Bs Ag/A b w er e not an alyse d by usi ng st at ist ic al eq ua tio ns bu t w er e in st ead es tim at ed by usi ng disc or da nt da ta ba se d on the cu t-off rel at iv e lig ht un it (R LU ) va lue.
연구에서는 AST는 안정적이지만 ALT는 유의하게 감소된 다는 보고가 있기도 하였다[8]. 본 연구에서는 AST, ALT 두 항목 모두 낮아지는 경향을 보여 회귀분석에서 낮은 기 울기를 보이며, 참고치를 기준으로 낮아지는 결과도 35%
(21/60)와 55% (33/60)에 달했다(Tables 3, 4). 본 연구에 서 LDH, ALP, cholesterol, CK, TSH는 유의하게 감소하 였으며, phosphorus, UA, sodium, potassium, amylase, free T3, free T4, CEA, AFP는 유의하게 증가하였다. 기 존 연구결과와 비교하면 갑상선 호르몬에 대해 약 5년 정 도 보관된 검체에서 free T3, free T4, TSH가 모두 감소 한 결과를 보였던 기존 연구결과와 차이를 보였으며, 25년 간 보관된 검체에서 UA와 빌리루빈 수치는 유의하게 감소 하였고, potassium 수치는 유의하게 증가하였다는 보고가 있어 UA의 경우 기존 연구와 차이를 보였고, potassium 의 경우는 기존 연구와 동일한 결과를 보였다[7,10]. 장기
간 보관된 검체에 대해 25년간 보관된 검체에서 ALT, CK, insulin C-peptide, ferritin이 유의하게 감소하였으며, transferrin은 유의하게 증가하였다는 연구결과가 보고된 바 있으며 본 연구에서 insulin의 경우 유의한 감소는 아니 지만 1검체에서 정상보다 낮아지는 결과를 보인 검체가 있 어 기존 결과와 크게 다르다고 보기 힘들었다[8]. 국내에서 는 5년 정도 장기간 보관된 검체에서 혈청 총 단백과 Cr은 안정되지만, blood urea nitrogen값이 보관 전 측정한 값 보다 유의하게 높았다는 보고가 있기도 하지만 본 연구에 서 Cr은 상관관계가 좋지 않아(R
2=0.0744) 안정되지 않은 것으로 평가되었다[9]. HBs Ag의 경우 RLU값의 변화이므 로 결과값의 차이에 대한 결론을 내리기는 힘들지만, 변화 를 보인 모든 결과값에서 RLU값의 증가를 보인만큼 과거와 현재 시약 간의 민감도에 차이가 있을 가능성을 배제하기 힘들다(Table 5). 음성으로 판단되었던 검체가 약양성 결과 (2.0＜RLU＜10)를 보인 경우에 대해서는 위양성이나 약양 성 여부의 감별을 위해 환자의 임상결과에 대한 추적관찰이 필요하겠으나 검체은행 검체의 특성상 환자의 임상정보를 확인할 수 없다는 한계가 있었다.
본 연구결과를 토대로 볼 때 4년 이상 장기간 보관된 검체의 경우, AST, ALT, LDH, ALP, amylase 등의 효 Fig. 3. Percent differences for the analytes that were preser-
ved for 4 years. The graph shows the average, maximum, and minimum values. The hepatitis B virus surface antigen (HBs Ag) and hepatitis B virus surface antibody (HBs Ab) levels are not shown. Abbreviations: CRP, C-reactive protein;
RA, rheumatoid arthritis; LDH, lactic acid dehydrogenase;
ALP, alkaline phosphatase; CK, creatinine kinase; TSH, thyroid stimulating hormone; CEA, carcino-embryonic antigen; CA 125, cancer antigen 125; AFP, alpha feto- protein.
Table 5. RLU values for the HBs Ag that showed significant discrepancies
Type of discrepancy Fresh sample
(4 yr ago) Preserved sample Discrepancy based on cut-off
for positivity* (low→
weakly positive)
<2 2.37
<2 2.69
<2 2.97
<2 6.42
<2 7.65 RLU value changed more
than 9.4% based on the coefficient of variation
†366.89 695.64
776.46 1,000 457.08 1,000 581.66 1,000
*Positive cut-off of relative light unit (RLU) >2.0.
†Coefficient of variation of hepatitis B virus surface antigen (HBs Ag):
2.9–9.4%.
소검사나 sodium, potassium과 같은 전해질검사는 처 음 보관 당시 결과값과 차이가 있을 수 있었다. 본 연구에 서는 연구 상관성이나 불일치 결과 건수를 토대로 볼 때 chemiluminescent immunoassay (CLIA) 검사방법을 이 용하는 검사항목에서 상대적으로 불일치 결과가 더 적은 경 향을 보였다(Table 3, Fig. 3). CLIA방법으로 측정하는 항 목에서 상대적으로 안정된 결과를 보이기는 하지만, CEA, AFP와 같이 일부 항목에서는 CLIA방법으로 측정함에도 불 구하고 유의한 차이를 보이며 높아지는 결과를 나타내었다.
일부에서는 통계적으로 안정적인 결과를 보인 항목이라 하 더라도 insulin과 같이 불일치 결과를 보이기도 했다. 본 연 구조건에서는 통계적으로는 CRP, CA 125, HBs Ab의 세 항목만이 장기간 보관 후에도 안정된 것으로 판단되었으나 CRP의 경우 17.85%의 높은 % 변화를 보였다. 그러나 본 연구에 포함된 검체 수에는 한계가 있으므로 세 가지 항목 을 안정된 표지자로 선정하기 위해서는 추가 연구가 요구된 다. 또한 본 연구에서는 4년째 시점에서 1회의 검사밖에 시 행할 수 없었기 때문에 나타나는 차이가 시약의 lot에 의한 차이인지 냉동, 해동의 영향에 의한 것인지 혹은 보관기간 에 의한 차이만을 나타내는지 확신하기는 힘들다.
자원의 품질은 연구의 성공을 위한 필수요건이다. 이러한 연구용 인체자원을 공급하는 검체은행은 단순히 인체자원 을 보관하는 데 그치는 것이 아니라 분석 전 변이요인에 대 한 문서화가 완전히 이루어진 잘 보존된 인체자원을 분양해 야 한다. 현실적으로 인체자원의 품질에 영향을 미치는 너 무나 많은 변이요건들과 가이드라인 등에서 요구하는 검체 의 종류, 요건, 수량 등에 모두 맞춰 검체를 확보하는 일이 쉽지 않고, 대표적인 안정성 표지자의 확립 또한 어렵다. 다 만 National Cancer Institute를 비롯한 국제적 협력들이 다각적으로 이뤄지고 있고, 최근 국내에서도 체외진단검사 용 시약이 의료기기법으로 통합되어 제도적 정비가 강화되 고 있으며, 식품의약품안전청의 가이드라인 등을 통해 체외 진단제품의 임상 평가에 대한 새로운 기준들이 마련되고 있 다. 따라서 임상검사실의 잔여 검체를 이용한 검체은행 네 트워크를 이용하고, 본 연구의 결과에서 알 수 있었던 것과 같이 잔여 검체의 분석 전 오류를 최소화시키는 노력이 동 반된다면 머지않아 현실적인 실용 가능한 정도관리물질과 방법이 제시될 것으로 기대된다.
이러한 여러 변수에 의한 차이를 줄이기 위해 stan- dard preanalytical code (SPREC)가 고안되었는데, 본 연구에 해당하는 SPREC는 sample type (SER), type of container (SST), pre-centrifugation (B),
centrifugation (A), second centrifugation (N), post- centrifugation (A), storage (A)에 해당하므로, 본 연구에 사용된 검체가 보관 검체로서는 적합한 상태임을 알 수 있 었다[13]. 그러나 잔여 검체는 본 연구에서와 같이 분석 전 오류를 최소화하기 위한 노력이 동반되었음에도 불구하고 장기간 보관 후 검사결과는 상이할 수 있었다.
본 연구결과에서 나타난 차이로 미뤄 볼 때, 분석 전 변수 를 최소화하기 위한 일정한 프로토콜을 정하고 이를 준수하 도록 하였음에도 잔여 검체를 사용하다 보면 검사가 진행되 는 시간 등을 고려할 때 프로토콜이 준수되지 못한 경우도 있을 수 있었을 것으로 보인다. 또한 연구용 검체뿐 아니라 외부 정도관리방법으로 사용되는 검사실 간 비교평가 역시 고려되어야 할 것으로 생각된다. 동일한 검사법과 장비, 시 약을 사용하는 검사실 간의 결과 차이가 분석 전 오류로 인 한 분석물질의 안정성 문제로 인한 것인지 실제 검사실 간 의 차이가 나타난 것인지에 대한 세심한 주의가 필요할 것 이다.
이처럼 장기간 보관 후 검체를 측정하는 경우 결과값이 완전히 달라질 수도 있는 만큼 장기간 보관 검체에 대한 추 가 연구가 절실한 실정하다. 장기간 보관 후에도 결과값 반 영이 가능한 항목을 정립하고 장기간 안정성 유지가 가능한 보관방법을 추천하기 위한 선행 연구가 필요할 것이다. 본 연구결과를 종합할 때 장기간 보관 검체로 연구를 시행하는 경우 다수의 항목에서 결과값에 차이를 보인 만큼 일반화학 검사항목에 대해서는 장기간 보관된 혈액검체를 이용하는 것을 추천하기 힘든 것으로 평가되었다. 또한 안정성을 유 지한 일부 항목에 대해서도 장기간 보관 후 검체에 대한 검 사에는 세심한 주의가 필요할 것으로 판단되었다.
감사의 글
이 논문은 2011년도 대한임상검사정도관리협회 연구비 지원에 의해 수행되었다.
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