Effect of Ceramide on Cell Growth and Cell Cycle Related Proteins in U-937 Cells

약학회지 제41권 제 1 호 94^98(1997)

Yakhak Hoeji

U-937

세포주기 조절단백질에 대한 작용

이재훈 ■최관수 ■김미영* 중앙대학교약학대학 (Received December 23. 1996)

Effect of Ceramide on Cell Growth and Cell Cycle Related Proteins in U-937 Cells

Jae Hoon Lee, Kwan Soo Choi and Mie Young Kim*

''College of Pharmacy, Chung-Ang University, Seoul 156-756, Korea

Abstract—— Ceramide. a product of sphingomyelin hydrolysis, has been proposed as a lipid second mes­

senger mediating antiproliferative activation. In this study, we examined the role of the cell cycle-re­

lated proteins in the ceramide-mediated growth suppression. Treatment of U-937 cells with C r ceramide(N-acetylsphingosine) resulted in growth suppression in a time- and concentration de­

pendent manner. Ceramide induced concentration-dependent dephosphoiylation of retinoblastoma gene product (Rb). Rb remains hypophosphorylated in synchronized cells even after serum stimu­

lation in the presence of ceramide. Ceramide decreased the expression of cyclin Di and cyclin E levels.

These results suggest that antiproliferative effect of ceramide is associated with hypophosphorylation of Rb and decreased expression of cyclin D l and cyclin E.

Keywords □ ceramide. growth suppression, cell cycle. Rb. cyclin.

최 근 에 보 고 된 sphingom yelin cycle은 세 포 분 화 와 세 포 증 식 억 제 및apoptosis 유 발 의 조 절 에 관 여 하 는 새 로 운 signaling 과 정 으 로 주 목 받 고 있 다.오신* 1,25-dihy- droxyvitam in T N F-a. r-interferon크\ interleu- k in -r*^과 같 은 세 포 자 국 제 에 의 하 여 sphingom ye­

linase 가 활 성 화 되 어 세 포 막 sphingom yelin이 가 수 분 해 되 며 이 때 생 성 된 ceramide는 이 돌 세 포 자 국 제 의 세 포 기 능 조 절 외 m ediator로 작 용 한 다.

C e ram id e에 의 하 여 매 개 되 는 세 포 내 작 용 으 로 서 는 세 포 분 화 억 제, apoptosis, protein trafficking의 조 절 및 염 증 반 응 등 이 보 고 되 어 있 다 . ^ 특 허 세 포 증 식 억 제 작 용 은 m yeloid, lym phoid, fibroblast세 포 에 서 보 고 되 어 있 으 며 세 포 투 과 성 합 성 ceram ide는 HL-60 세

« 본 논문에 관한 문의는 이 저자에게로 ( 전화 ) 02-820-5607 ( 팩스) 02-816-7338

포 및 Molt-4 세 포 에 서 apoptosis를 유 발 하 는 것 으 로 알 려 져 있 다. 또 한 serum-deprivation^어, Ara-C으오\ F as activ atio n혜 의 하 여 세 포 증 식 억 제 및 apop- tosis가 일 어 나 며 세 포 내 ceram ide의 양 이 증 가 되 는 것 으 로 관 찰 되 므 로 ceram ide는 apoptosis과 정 에 관 여 하 는 공 통 된 m ediator라 고 추 정 되 고 있 다.

C e ram ide에 외 한 세 포 증 식 억 제 와 apoptosis 유 발 작 용 은 Molt-4 세 포 에 서 retino blastom a gene pro- du c t(R b ) 탈 인 산 화 에 외 한 세 포 주 기 억 제 가 관 여 함 이 알 려 졌 다.""' 그 러 나 다 른 세 포 에 서 세 포 증 식 억 제 기 전 및 R b 탈 인 산 화 와 다 른 세 포 주 기 조 절 인 자 들 과 의 관 계 에 대 해 서 는 알 려 진 바 없 다. 따 라 서 본 연 구 에 서 는 U- 937 세 포 에 서 ceram ide에 의 하 여 유 도 되 는 세 포 증 식 억 제 와 세 포 주 기 조 절 단 백 질 돌 간 의 관 계 에 대 하 여 연 구 하 여 ceram ide에 외 한 R b 탈 인 산 화 의 조 절 이 어 떻 게 이 루 어 지 는 지 밝 혀 내 고 자 하 였 다.

94

세라마이드에 의한세포주기 조절단백질의 조절 95

본 연 구 에 서 ceramide에 의 한 Rb 단 백 질 의 탈 인 산 화 조 절 과 G1 세 포 주 기 조 절 에 관 여 하 는 cyclin 단 백 질 의 발 현 정 도 를 측 정 하 여 U-937 세 포 에 서 ceramide의

Rb 탈 인 산 화 작 용 을 확 인 하 였 으 며 이 는 cyclin 이 과

cyclin E 단 백 질 의 감 소 와 관 련 이 있 옴 을 제 시 하 였 다.

실험방법

시약

RPMI 1640과 fetal bovine serum은 Gibco (USA) 사 의 것 을 사 용 하 였 고 C2-ceramide, phenyl- m ethylsulfonylfluoride, aprotinin, leupeptin 은

Sigma 사 로 부 터 구 입 하 였 다. polyclonal rabbit an ­ tibody to human Rb. cyclin Di, cyclin E 및 goat anti-rabbit secondary antibody는 Santa Cruz Biotech (USA) 제 품 을 사 용 하 였 다.

세포배양

U-937 세 포 (American Type Culture Collection)

는 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)

을 가 한 RPMI 배 양 액 에 서 5% COz와 습 도 가 일 정 하 게 유 지 되 는 37°C 배 양 기 에 서 IX 10®~2xl(f cells/m/ 의 농 도 로 배 양 했 다. Ceramide를 가 할• 때 는 2% F B S를 가 한 RPMI 1640배 양 액 에 5 X 10® cells/m/의 농 도 로 세 포 를 심 었 다. Ceramide는 ethan d에 용 해 해 서 사 용 하 였 다. Cell viability는 trypan blue exclusion 방 법 으 로 측 정 하 였 다.

Cell lysate의제조

Ceramide로 처 리 한 세 포 를 원 심 분 리 하 여 분 리 하 고

2 x l ( f cells/m； lysis buffer (50 mM Tris HCI, pH 8.0, 150mM NaCl, \% nonidet P-40, Im M phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 |오g/m/ apro- tinin, 10 ng/m/ leupeptin) 롤 가 하 여 0°C, 30분 간 방 처 한 후 12000xg에 서 10분 간 원 심 분 리 하 여 lysate를 얻 는 다.

Western blotting

Lysate틀 Bradford 방 법 으 로 단 백 질 을 정 량 한 루

3X SD S sample buffer를 섞 은 후 9(TC에 서 4분 간 번 성 시킨 다. 50|ig의 단 백 질 을 loading 하 여 SDS- PAGE 한 다 옴 Gel을 Immobilon-NC transfer mem­

brane (Millipore Co, U S A) 에 transfer 시 킨 후 5%

skim milk (Difco lab, U SA) 을 가 한 T B S-T 용 액 에 서

blocking하 여 T B S -T 용 액 으 로 세 척 하 고 polyclonal primary antibody ( 1：2000) 를 가 하 여 1 시 간 상 온 에 서 배 양 한 다. membrane을 세 척 한 부 horseradish p e­

roxidase-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody ( 1 ：5000 dilution) 배 양 하 여 E C L (enhan­

ced chemiluminescence) assay system (Am er­

sham, England), 또 는 4-chloro-l-napht이 을 발 색 기 질 로 사 용 하 여 단 백 질 을 검 출 한 다.

결과 및 고찰

U-937 세 포 에 서 ceram ide의 세 포 증 식 억 제 작 용 을 보 기 위 하 여 세 포 를 20 ceramide를 가 하 여

trypan blue exclusion방 법 으 로 viability를 즉 정 하 였 을 때 ceramide 처 리 후 12시 간 후 세 포 증 식 이 억 제 되 면 서 48시 간 후 에 는 90% 이 상 억 제 되 었 다(Fig. 1A ).

또 한 ceramide 5 M-M, 10 |xM, 20 l^iM을 가 하 고 24시 간 viability를 즉 정 한 결 과 ceramide가 농 도 의 존 적 으 로 세 포 증 식 을 억 제 하 였 다(Fig. IB). T ryp an b lu e로 염 색 된 세 포 는 15% 머 만 으 로 관 찰 되 어 ceram ide는 세 포 득 성 작 용 보 다 는 세 포 증 식 억 제 작 용 을 나 타 내 는 것 으 로 관 단 된 다.

Ceram ide가 세 포 의 G, 기 분 포 를 증 가 시 킨 다 는 보 고 가 있 으 므 로 세 포 주 기 관 련 단 백 질 외 발 현 에 머 치 는 영향 을 알 아 보 았 다. Retinoblastom a gene product인

Rb는 세 포 주 기 조 절 에 중 요 한 역 할 을 하 는 단 백 질 로 서

G i-» S 세 포 주 기 의 진 행 에 펄 요 하 다.*®"*Rb는 인 산 화 형 태 와 탈 인 산 화 형 태 로 존 재 하 는 데 탈 인 산 화 형 태 로 되 면 G r사S 세 포 주 기 진 행 의 억 제 를 일 으 키 며 tum or suppressor로 작 용 한 다. 또 한 여 러 antim itogenic agent는 Rb 단 백 질 의 탈 인 산 화 에 의 하 여 그 작 용 을 나 타 내 는 경 우 가 많 다. Fig 2에 서 나 타 난 바 와 같 이 U - 937 세 포 를 ceramide로 24시 간 처 리 한 후 cell lysate를 제 조 하 여 SD S-P A G E룰 실 시 하 여 b an d의

shift에 의 한 R b의 탈 인 산 화 정 도 를 측 정 하 였 다. 10 HM 농 도 에 서 탈 인 산 화 형 태 가 나 타 나 기 시 작 하 여 20

|iM. 40 nM에 서 농 도 의 존 적 으 로 탈 인 산 화 형 태 가 증 가 하 였 다.

세 포 배 양 시 sem m을 제 거 하 면 G r*번 세 포 주 기 진 행 의 억 제 가 유 발 되 는 데 이 는 serum 제 거 시 세 포 내

Vol. 41, No. 1, 1997

96 이재훈• 최관수• 김미영

Time (hr)

5 10

Cone. (배)

Fig. 1 — Time(A)- and concentration (B )-dependent growth inhibition by ceramide. U-937 cells were treated with ethanol vehicle or various conentrantion of Crceramide for 24 hr.

(—• —： control. —■—； Cfceramide)

hyper Rb

hypo Rb

control 5uM lO uM 20uM 40wM

Fig. 2 — Effect of ceramide on Rb dephosphorylation. U- 937 cells were treated with the indicated con­

centration of C2-ceramide for 24 hr. The status of Rb dephosphorylation was determined by Western blot analysis as described under

^Materials and Methods'.

ceramide의생성이 증가되기 때문인 것으로알려져 있 다/ » 따라서 본 실험에서 U-937 세포를 72시간 동안 serum deprivation상태로 유지하여 Gr~*S 세포주기 진행을억제시킨후 10% serum과ceramide (20 |iM) 를가하고 일정시간배양후Rb의탈인산화를측정하였 다. G i^ S 세포주기 진행을 억제시킨세포에서 ceram-

hyper Rb

hypo Rb

a h r ri ft

Fig. 3 — EfFet of ceramide on Rb dephosphorylation in synchronized U-937 cells. The cells were grown in RPMI 1640 plus 0.2% FBS for 72 hr and refed with 10% FBS. Crceramide (20 |iM) was sub­

sequently added and incubated for 24 hr. West­

ern blot using polyclonal anti-human Rb an­

tibody was carried out according to the method as described under '"Materials and Methods' (a Normal-growing cell, b. Ohr. c. 8 hr, d. 24hr aft­

er addition of Ca-ceramide. e. 24 hr after addition of ethanol vehicle.).

ide는 24시간 후에도 탈인산화 상태를 유지하였으나

10% serum만을 가한 경우에는 인산화상태로 되었다 (Fig. 3). 또한 Rb 단백질 발현외 감소현상이 나타나 ceramide는Rb 탈인산화작용과 함께Rb 단백질 생성 을 억제하는 작용을 가지는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 ceramide가 Molt-4 세포에서뿐만 아니라 U- 937 세포에서도 Gr^S 세포주기 진행을 억제하며 이는 Rb의탈언산화와발현의조절이 관련있음을의미한다.

G i- * S 세포주기 진행을 억제하는기전으로서 p21 발

현의 중가와 세포주기 관련 cydin 단백질 발현의

down regulation이 관여한다.*^^*무* p53-null cell인 U-937 세포에서는 세포분화 흑은 증식 억제 과정에서 p53-비의존성 기전에 의하여 p21 발현이 유발되며 이 때유발된 p21 은 cydin dependent kinase (CDK) 저 해제로작용하여 Rb 인산화를억제한다. 또한cyclin은 C D K 와complex를 이루며 Rb 단백질의 인산화를 촉 진하는 것으로 알려져 있으며 특히 cyclin Di은수종의 암세포에서 과다 발현되어 있는경우가있다.*" 본실험 에서는U-937 세포에서 ceramide에의한p21 외발현 이 전혀 나타나지 않았기 때문에 (data not shown) cyclin 단백질 발현의 변화를보았다.

본 실험에서는 Rb 인산화■탈인산화 조절에 관여하

는 G l 세포주기 관련 cyclin 단백질인 cyd in D ,과 cyclin E 의 발현정도를 w estern blotting에 외하여 측정하였다. Fig. 4에서 나타난 바와 같이 ceramide 는 농도 의존적으로 Di 및E cyclin 단백질 발현을 감

Pharm. Soc. Korea

세라마이드에 외한 세포주기 조절단백질의 조절 97

(a)

— r ~ Hr

________

control 5uM 10uM 2CHiM

구비외 지원으로수행되었으며 이에감사드럽니다.

control 5uM lO^M 20uM

Fig. 4 — Effect of ceramide on the expression of cyclin Di (A) and cyclin E (B). U-^37 cells were treated with various concentration of C2-ceramide for 24 hr and were analyzed for the expression of cyc­

lin Dl and cyclin E by Western blot analysis as described under "Materials and Methods".

소시켰다. 특히cyclin D i에대한효과가크게 나타나 20mm에의하여 거외단백질 발현이 되지않았다. 이

는 U937 세포에서 R b의 탈인산화는 p21 에 외한

C D K 저해와는무관하며 C D K를활성화시키는cyc- lin D l이나cyclin E 단백질의 감 소 인 하 여 나타남 을제시하고있다.

Cyclin D i과 cyclin E는 각각 C D K 4와 C D K 2와 com plex를 이루어 C D K에 의한 R b의 인산화를 촉진 한다.^^ ^®"^^^ 본연구외 결과 ceram ide는 U-937 세포 에서 R b 탈인산화 유발 및 R b 단백질 발현을 저해하였 으며 이는 cyclin D i과 cyclin E 단백 질 발현 저하와 관 련이 있는 것으로 관단된다.

R b의탈인산화는seru m factor외 제거나ceram-

ide 처리에의한 경우뿐만아니라항암제에 외한세포

주기 진행의 억제 시에도 나타난다.*®^ 또한 Ara-C.

v in cristine 등외 항암제는세포내^{ceram ide} 생성을 촉진하는작용이 있다고알려져 있으므로^어ceram ide 는이들항암제작용의m e d ia to r일가능성이 있다. 따

라서ceram ide의R b 랄인산화작용기전을연구함으로

써항암제의작용기전을밝힐수있을것으로관단된다.

감사의 말씀

본연구는 1995년도중앙대학교 연구지원처 학술연

Vol. 41 No. I 1997

문 헌

1) O k a za k i, T.. Bell, R . an d H a n n u n . Y. A. ： Sphingom yelin turnover induced by v itam in D.^

in HL-60 cell J. Biol. Chem. 264, 19076-19086 (1989).

2) O k azak i. T., Bielaw ska. A .. Bell. R. M . a n d H a n n u n . Y . A .. ： Role of ceram ide as a lipid m ed iato r o f lot. 25 -dihy drox yvitam in Da-in- duced HL-60 cell differentiation. /. BioL Chem.

265 15823-15831 (1990).

3) K im . M. Y., Linardic. C.. Obeid, L. an d H a n ­ n u n , Y. A. ： Identification of sphingom yelin t u r ­ nover as an effector m echanism for the action of tum or necrosis factoi^a a n d y-interferon. /.

Biol Chem. 266, 484-489 (1991).

4) Ballou. L. R., Chao. C. P.. M aureen, C.. Hole- ness, M. A.. Barker. S. C. a n d Raghow, R. ： Interleukin-l- m ediated P G E2 production an d sphingom yelin m etabolism . /. Biol Chem. 267.

20044-20050 (1992).

5) Dressier. K. A., Mathias, S. and Kolesnick. R. N.

'■

H a n n u n . Y. A. ： The sphingom yelin cycle and the second messenger function of ceramide. /.

Biol. Chem. 269 3125-3128 (1994).

H an n u n . Y. A. and Obeid. L. M . ： Ceram ide ： a n in tra c e llu la r sig nal for apoptosis. Trends Biochem. Sci. 20, 73-77 (1995).

8) Obeid, L. M .. Linardic. C. M .. Karolak. L. A.

an d H an n u n . Y. A. ： Program m ed cell death by ceramide. Science. 259. 1769-1771 (1993).

9) Jarvis. D. W .. Kolesnick. R. N .. F om ari, F. A..

Traylor. R. S.. Gewritz, D. A. an d G rant. S. ： In d u ctio n of apoptotic D N A degradation an d cell death by activation of the sphingom yelin pathw ay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91. 73-77 (1994).

10) Jayadev, S.. Liu. B., Bielawska, A. E .. Lee. J.

Y.. Nazaire, F.. Pushkareua. M . Y .. Obeid. L.

M . an d H a n n u n . Y. A. ： Role for ceramide in 6)

7)

98 이재훈■최관수• 김미영

cell cycle arrest, h Biol. Chem. 270. 2047-2052 (1995).

11) Strum . J. C.. S m a ll G. W ., Pauig, S. B. and Daniel. L. W. ： 1-p-D-Arabinofuranosylcytosine stim ulates Ceramide and Diglyderide formation in HL-60 cells. L Biol. Chem. 269, 15493*15497 (1994).

12) Tepper, C. G.. Jayadev, S.. Liu. B.. Bielawska.

A.. Wolff. R.. Yonehara, S., H an n u n , Y. A. and S eldin. M . F. ■ Role for ceram ide as an e n ­ dogenous mediator of Fas-induced cytotoxicity.

Proc. Natl Acad. Sci. USA. 92. 8443-8447 (1995).

13) Dbaibo. G. S.. Pushkareva, M. Y.. Jayadev, S., Schwarz. J. K.. Horowitz. J. M .. Obeid. L. M.

an d H an nun , Y. A. ： Retino blastoma gene pro­

duct as a downstream target for a ceramide- de­

pendent pathw ay of growth arrest. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 92. 1347-1351 (1995).

14) W einberg, R. A. ： The retinoblastom a protein

and cell cycle control. Cell 81, 323-330 (1995).

15) Xiang. Y., Hannon. G. J.. Casso, H. G. D.. Ko­

bayashi, R. and Beach, D. - p21 is a universal in- hibitor of cyclin kinase. Nature 366, 701-704 (1993).

16) Morgan. D. O. • Principles of C D K regulation.

Nature 374. 131-134 (1995).

17) H unter. T.. and Pines. J . ： Cyclins and cancer II ： Cyclin D and C D K inhibitors come of age.

Cell 79, 573-582 (1994).

18) Dou, Q. P.. An. B.. and Will, P. L. ： Induction of a retinoblastoma phosphatase activity by a n ­ ticancer drugs accompanies p53-independent Gi arrest and apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

92. 901^9023 (1995).

19) Zhang. J .. Alter. N., Reed, J . C., Bomer. C.

- and Obeid, L. M. ： Bcl-2 interrupts the ceram­

ide-mediated pathw ay of cell death. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 93. 5325-5328 (1996).

/.

Pharm. Soc. Korea