약 학 획지 제 54 권 제 4 호 240^243 (2010)
Yakhak HoejiVol. 54, No. 4
불후■츰학
시판 기농성식품으로부터의 타다라필 유도체 부정 첨가물질의 분리 및 구조규명
백 두 종^
상명대학교 자연과학대학화학과
(Received March 31, 2010; Revised May 17, 2010; Accepted May 28, 2010)
Isolation and Identification of an Unauthorized Tadalafil Analogue in a Commercial Functional Food
D u- Jo n g B a e k 쌓
Department of Chemistry, College of Natural Sciences, Sangmyung University, Seoul 110-743, Korea
Abstract — High-performance liquid chromatography (HPLC) screening method revealed that a propolis product marketed as a functional food contained an undeclared substance similar to tadalafil, the active ingredient of the prescription drug Cia- lis® approved for the treatment of male erectile dysfunction. In order to identify the illegal additive, the propolis product was extracted with methylene chloride, and the extract was purified further using semipreparative HPLC. The chemical structure of the isolated substance was elucidated based on IR, LC/MS-ESI, and *H- and ^'t-NM R spectroscopy, which showed the characteristics similar to tadalafil. The only difference was the substitution of the methyl group at the pip- erazinedione ring of tadalafil to the amino group of the identified illegal additive.
Keywords □ functional food, HPLC screening, illegal additive, tadalafil
타다라뭔 (tadalafil)은 E li Lilly 사에 의해 개발되어 시관되고 있는발기부전치료제시알리스(Cialis)®의주성분으로서, 해면체
내에서 C-GMP의분해및 평활근수측을통해발기부전에 이르
게히는효 소인 phosphodiesterase-5(PDE-5)의억제제로작용한 다.^* 이약물은니트로글리세린(nitroglycerin), 질심:이소소 로비드
(isosorbide dinitrate) 등의 질산염 제제를복용하는고혈압환자
나당뇨병 환자에게는처방<> 1 금지되어 있는데이두가지 약물 을동시에투여하면급격한혈압강하틀유발할수있고^^ 따라서 타다타월을함유하는약물은의사의처방전없이는관매될수없다.
식품위생법의 규정에 의하면 기준 ■규격이 고시되지 아니한 화학적 합성품을식품첨가물로사용하거나이를함유한 식품을
판매의 목적^ 제조 ■유통하지 못하도록되어 있지만,2> 최근
기능성식품에 발기부전치료제성분을 첨가하여시관하는사궤가 보고되어 국민 건강을위협하고 있다. 따라서 부정식품의 섭취 에의한발기부견치료제의 오남용을방지하기 위해서 이러한부
형- 논문에 관한문의는저자에게로
(전화) 02-2287-5143 (팩스) 02-2287-0070 (E-mail) [email protected]
정첨가물질을검출할수었는 H P L C 동시분석법이 개발되었고^'
2 0 0 2년수입주류로부터 타다라필을검출한이래이첨가물질을
함유한여러건의부정식품을적발하였다. 그후부정식품제조/
수입업체에서는이러한검색시스템을회피하기위한목 적 로 타 다라월 화학구조의단순한번형을가한유사첨7^ 질을사용하 고자하는시도가있었는데이러한타다라필유시물질은그안전 성이아직입증되지않았기때문에이화학물질을함유한기능성 식품은인체에위해룰가할위험이훨씬더크다고할수있다. 실 제로최근에타다라필유시물질을함유한프로폴리스(밀랍) 부정
식품이 H P L C 검색시스템에의해적발되었는바, 신규부정첨가물
을규명하기위해분리정제후분광학적방법에 의해그머지물 질의화학구조틀결정하였으^ 그결과를여기에보고하고자한다.
실 험 방 법
시약 및 기기
머지물질의 추출분러에사용된모든용매는 Fisher Scientific
의 H P L C 급용매률사용하였다. H P L C 분석은 Waters 2690 및
996 photodiode array detector에의해 수행되었다. Thin-layer
240
타tt라밀 유도체의분리및구조규명 241
chrom atography(TLC)는 E . M erck silica gel 60 F-254 코팅유 리판(0.25 m m)을사용하였고자외선, 요오드, phosphomolybdic acid, anisaldehyde로 발색하여 관찰하였다. 융점은 Thomas-
H oover 모세관융점측정기로측정하였고보정하지 않았다. U V
스펙트럼은 Varian C A R Y 100 Spectrometer로측정하였다. IR
흡수스펙트럼은 K B r pellet을 사용하여 Perkin-Elm er F T IR
1750 Spectrometer로죽정하였으며 중요흡수대률 cnT높 표기
하였고그크기률다음과같이약자로표기하였다: S , strong; m, m edium ; w, weak. N M R 스펙트럼은 B ruker Avance 400 Spectrom eter(보 및 각각 400 M H z 및 100 M H z ) 에서
D M S C M g를용매로사용하식 측정하였으며, chemical shift는 5
척도로서 ppm으로표기하였고중첩피크는다옴과 같이 약자로
표기하였다: S , singlet; d, doublet; dd, doublet of doublets; t, triplet; q, quartet; m , multiplet; bs, broad singlet. Electrospray ionization m ass spectrum (ESI-M S) data는 V G M icrom ass Autospec에의해 얻었고, wz/z(base peak을 100으로 한상대적 크기)의 형태로표기하였다.
추출 및 분리 정제
프로폴리스 부정식품 10 캡술(5 0 0 m g/캡술)의 내용물을 물
100 m/에녹이고 m ethanol 350 m/를 가한다음 초옴파진탕주 출후여과하였다. 여액에 1% 중탄산나트륨용액 5 m/를가하고
m ethylene chloride 250 m/로 3회추출한다옴 유기층을 무수
Na2S0 t로건조시키고감압농축하였다. 잔사률 m ethanol 15 ml 에 녹이고 m em brane filter로 여과? t 다옴 여액을 semipre- parative H P L C로 정제하였다. 정제용 컬럼으로는 laBondapak Cig co lu m n (7.8x 3 00 m m , 5 (xm)을 사용하였고 견개용매는
acetonitrile-water-trifluoroacetic acid(90 :1 0 : O . l ) # 5 m //m in
의속도로사용하였다. 얻어진분획을동결건조e M 무색결정의 순수 머지물질 2 0 m g을 얻었다: m p 27 2~ 2 78°C： U V (M ethanol) 285 nm ; IR (K B r) 3436(s), 2896(w), 1655(s), 1499 (w), 1415(w), 1320(w), 1240(m), 1038(w), 925(w), 739(w); 'H N M R(DM SO-dg) 5 3.00(1H, dd, /= 1 5 .4 , 11.9 H z, Cij-H ), 3.58C1H, dd, /= 1 5 .7 , 4.2 H z, C1 2-H), 3.97(1H, d, / = 17.1 Hz, C：j-H), 4.27(1H, d, 7 = 1 7 .2 H z, C3-H), 4.44(1H, dd, / = 1 1 .6 , 3.5 Hz, C i2a-H), 5.13(2H, s, N H2), 5.93(2H, s, C2 0-H), 6.10 ( IH . s, Ce-H), 6.78(1H, d, / = 8 . 0 H z, Cig-H), 6.82(1H, dd, / = 8.2, 1.4 Hz, C1 9-H), 6.88(1H, d , / = 1 . 2 H z , C1 5-H), 7.02(1H, t, / = 8 . 4 H z, Cio-H), 7,06(1H, t, / = 7 . 1 H z, Cg-H), 7.30(1H, d, / = 7 . 9 H z, Cg-H), 7.56(1H, d , / = 7 . 7 H z , C „- H ), 11.02(1H, bs, N7-H)： ^크C N M R C D M S O ^ g ) 8 23.5(Ci2), SS.SCCg), 55.4(Ci2a), 55.6(Cg), 100.9(C2o), 104.8(C„b), 106.9(Ci5), 108.3(Cig), 111.3 (Cg), I I8.K C1 1), 118.9(Cio), 119.3(Ci9), 121.2(Cg), 125.7(Cn3), 134.0(C6a), 136.2(Ci4), I3 7.K C7,), Ue.OCCi^), MT.OCCig),
164.6(C4), 166.3(Ci)： M ass m/z 39 1(M + 1, 100), 289(12), 269 (30), 262(21), 204(12), 169(6).
실험결과 및 고찰
Cjg reversed-phase colum n에의한 H P L C 분석법은식품의약 품안전청에서 기능성식품및건강보조제의 부정첨기물질을 검색 하기 위해 일반적으로사용하는방법이다.® 이방법으로프로폴 리스추출물을 검색한결과, 이전에보고되지 않았던 미지 화합 물이 검출되었고타다라필과유사한 머무름시간을보였다. 더욱 이 , 정제한이화합물의 U V 스펙트럼은 m e th ano l 용액에서
285 n m의값이 얻어졌고타다라필의 스펙트럼과동일하였다. 따
라서이머지물질은화학구조및물리적성질에서 타다라필과유 사하리라추정되었다.
이화합물의 화학구조는 IR , M S 및 N M R 분광학0)1 의해서다 옴과같이결정되었다. IR 스펙트럼은 am ino(3436 cnf>), am ide (1655 c m ■오), aromatic(1499, 1415 c m ■조) 및 e the r group(1240 c m**)의특징적인 흡수대를나타냈다. 이머지화합물에 1차아•민 이존재한다는점은 ninhydrin test에의해확인되었는데 물질분
리후 T L C plate에서 뚜렷한청같색 반점을보였다. 이미지물
질의 분자구조는 LC /M S -E S I 및 fragm entation patte rn에서 주 가로분석되었는데 [ M + H r가m/z 391에서 얻어졌고 fragm ent
는 269, 204, 169에서 얻어졌다(Fig. 1). 이질량 스펙트럼은타 다라될 ([ M + H ；r 390; fragm ent 268, 204, 169)과 유사하고, 미 지물질과 타다라필의 차이는 [M + H；r 의 391 대 390, 그리고
fragm ent 269 대 268으1 1 mass u n it 차이가 유일하였다. 이 1 m ass u n it 차이는 타다라필에 존재하는 methyKCHg-) group이 미지물질에서 a m in o (N H2-) groupLpJS. 치환되어서 유발된 결과 라고추정되었다.
이머지화합물의 및 ^^C-NMR 스펙트럼을 얻었고이화
합물의 구조와번호를 Fig. 2에나타내었다. ^H -N M R 스펙트럼 은다옴과같은특징적인 peak둘을보이고 있다: 5 5.13(2H, s), piperazinedione의 질소와 연결된 am ino g ro u p： 5 11.02(1H, bs), indole N H ; § 5.93(2H, s), 3,4-m ethylenedioxyphenyl ring
의 m ethylene; 5 6.10(1H, s), aromatic ring 및 질소와 연걸¥l C- 6 m e th in e： 3.97(1H, d, / = 17.1 H z) 및 4.27(1H , d, / - 1 7 .2 H z), piperazinedione rin g의 C-3 m ethylene; 6 3.00(1H , dd, /= 1 5 .4 , 11.9 H z) 및 3.58(1H, dd, / - 1 5 .7 , 4.2 H z), indole ring
옆의 C-12 m ethylene, 여기서 1 5 H z의 coupling constant는상 호간의 coupling이고 12 H z 및 4 H z는다옴의 6 4.44 peak과의
coupling이다; 6 4,44(1H, dd, /= 1 1 .6 , 3.5 H z), C-12a m ethine;
기타 5 6.7 8- 7.56 , aromatic proton. 스펙트럼은 21 개
의다옴과 같은 특정적인 peak들을 보이고 있다: 5 166.3 및
164.6, piperazinedione rin g의 C-1 및 C-4 am ide carbonyl
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242 백 두 중
Fig, 1 - The LC/MS-ESI and fragmentation spectra of the unknown tadalafil analogue. The fragment peak at
m/z
269 was assigned as indicated in the structure shown.o
,NH2
Fig. 2 - The chemical structure and numbering system of the identified tadalafil analogue, (67?, 1 2a^)-2-amino-6-benzo [l,3]dioxol-5-yl-2,3,6,7,12,12a-hexahydropyrazino[l',2':l,6]
pyrido[3,4-6Jindole-l,4-dione,
carbon; 5 53.3 및 55.4, pipcrazinedionc에서 carbonyl group과 질소로 연결되어 있는 C-3 및 C-12a carbon; 5 55.6, aromatic ring 및질소와연결된 C- 6 carbon; 6 23.5, indole ring 옆의 C- 12 carbon; 6 100.9, 3,4-methylenedioxyphenyl rin g의 C-20 carbon; 기타 5 104.8—147,0, 3,4-methylenedioxyphenyl 및
indole ring의 14 aromatic peak.
이러한권- 및 ^^C-NMR 스펙트럼을타다라필과비교하였는
데 , 미지물질의 am ino group [4 l- N M R의6 5.13(2H, s)]과타다 라될의 m ethyl group [또H - N M R의6 2.93(3H, s) 및조그C - N M R
의8 32.9]을제외하고는거의 유사하였다.
추출분리된화합물의화학구조를최종확인하기 위해이화합 물을문헌에따라합성 하 였 는 바 /이 합성화합물과추출분리 된화합물의스펙트럼이 완전히 일치하였다.
결 론
기능성식품으로시관되고있는프로폴리스(밀람) 제품에서이전
에고지되지않았던화합물이 H P L C 분석법에의해검색되었고,
이미지첨가물을 semipreparative H P L C에의해분리하였다. 이렇 게분리된화합물의화학구조를 u y IR , M S , N M R 분광학적분석 법에의해결정하였는데, 단순히타다라필의 methyl groupPl amino
group으로치환된타다라필유도체임이 밝혀졌다. 이화합물은기
공지된합성법에따라대량합성되어기능성식품및건 강 ^제 의 부정첨가물질을검색하기위한표준시료로사용되고있다.
감사의 말씀
본연구는식품의약품안전청 용역연구개발과제의 연구개발비
지원(04052식품위366)에의해수행되었으며 이에감사드럽니다,
참고문헌
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타 월 유도체의분러 및구5규명 243
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