수아세포종 세포 배양에서 레티노이드의 세포증식억제 효과
아주대학교 의과대학 신경외과학교실
윤수한·김진영·박승우·안영환·안영민·조기홍·조경기
= Abstract =
The Effect of Retinoids in Medulloblastoma Cell Culture
Soo Han Yoon, M.D., Jin Young Kim M.D., Seung Woo Park, M.D., Young Hwan Ahn, M.D., Young Min Ahn, M.D.,
Ki Hong Cho, M.D., Kyung Gi Cho, M.D.
Department of Neurosurgery, School of Medicine Ajou University Hospital, Suwon, Korea
he retinoic acid, one of the most popular agents for chemoprevention can inhibit the proliferation of many cancer cells including neuroblastoma and glioblastoma but there is increasing demand reaccessing its in vitro inhibitory effect on the tumor proliferation because of poor responsiveness from recent clinical trial for malignant brain tumor with retinoic acid. If was known to effect on tumor cells by diffferentiation and apoptosis so that its effect was expected greater in pediatric brain tumor than in adult brain tumor, but there is no report on the effect of retinoic acid in medulloblastoma cell proliferation except all-trans and 13-cis retinoic acid. Therefore, we compared the effects of all-trans, 13-cis, and 9-cis retinoic acid and N-(4-hydroxyphenyl) retinamide to inhibit proliferation of medulloblastoma tumor cells. Medulloblastoma cells were derived from primary culture of patient's specimen. We estimated the rate of growth inhibition of each tumor cells using MTT assay in the concentration from 10-12 M to 10-5 M of all-trans, 13-cis, and 9-cis retinoic acid and N-(4-hydroxyphenyl) retinamide. Medulloblastoma cells showed more than 30% growth inhibition by all-trans, 12% by 13-cis, 20% by 9-cis retinoic acid and 7% by N-(4- hydroxyphenyl) retinamide at 14 days culture on the concentration of 10-6M. In conclusion, significanty and dramatic effect by, especially, all-trans retinoic acid, moderate response by 13-cis retinoic acid and variable or poor response by 9-cis retinoic acid and N-(4-hydroxyphenyl) retinamide.
KEY WORDS：All-trans retinoic acid・13-cis retinoic acid・9-cis retinoic acid・N-(4-hydroxyphenyl) retinamide・
MTT assay・Chemoprevention.
서 론
암의 치료에 있어서 아직도 방사선 치료나 항암제 치료에 저항성인 경우나 다발성 전이가 있는 고등급의 치료뿐만 아 니라 방사선 치료와 항암제 치료를 끝낸후 재발 방지를 위 한 보조치료에도 도움이 될 수 있는 치료방법을 구하고자 많은 노력을 기울여 왔다. 근래에 세포배양에서 레티노익 산의 세포분화 촉진과 아포토시스 효과에 기초한 화학예방 요법의 개념이 제창된 이후로 여러 가지 암에서 암의 발생 및 재발방지를 위한 효과를 입증하고자 실험적 연구는 물론
이고 최근에는 임상적 연구까지 진행되고 있으나 혈액암에 서 예방효과가 있을 것으로 추정되는 이외에는 아직 뚜렸한 결과가 없다11)47)52).
레티노익 산은 all-trans, 13-cis, 9-cis 등의 이형체가 생체 대사에 따라 존재하며, 그외에 합성형태로는 4-hy- droxyphenylretinamide(HPR) 등이 있다. 종양증식억제제 로서 레티노익 산은 all-trans 이형체가 가장 많이 연구되 어 있으며1)3)25)37), 13-cis 이형체는 농도유지가 쉽고 간독 성이 적다는 장점34)54)으로 임상 연구가 계획시도되고 있으 며14)20)38), 최근에 도입된 9-cis 형태는 고용량 투여가 가 능하면서도24) 세포배양 실험에서 all-trans나 13-cis 이형
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체보다 종양세포 증식억제 효과가 뛰어나고28) 장기간 투여 해도 효과가 지속된다는 보고22)로 임상실험을 시작하는 단 계에 있으며12)21)53), HPR은 지금까지의 레티노익 산과는 다 른 종양증식억제 효과를 가지며9) 고용량 투여가 가능하여 일부 종양에서 임상실험중이다7)32)41).
뇌종양 분야에서는 과거에 교모세포종 세포배양에서 종양 세포 증식억제에 효과가 있었다고 한 보고도 있었고30), 실 제로 교모세포종 환자를 대상으로 최근에 ganglioglioma에 서 13-cis 이형체를 투여하여 성공한 증례보고20)도 있었지 만, 최근 연구에서는 효과가 다양하여 실제 적용이 매우 어 려울 것으로 추측된다는 보고도 있고17)57), all-trans 레티 노익 산을 사용한 임상연구에서도 그효과는 미미한 실정이 었다40). 레티노익 산의 작용이 종양세포의 분화를 촉진시키 고 종양에 의한 혈관신생을 억제하며, 종양세포의 아포토시 스를 촉진하여 증식억제 효과를 나타낸다면 당연히 성인종 양보다는 소아종양에서 효과가 기대되며, 따라서 뇌종양에 서는 무엇보다도 대표적인 소아종양인 수아세포종에서 그효 과가 확인되어야 할 것이나 현재까지 수아세포종에서 레티 노익 산의 효과를 측정한 연구는 수아세포종 세포의 체외배 양에서 13-cis retinoic acid에 의해서는 증식억제 효과가 없었다는 것36)과 반대로 all-trans 레티노익 산 10-6M에 서 10-7M 농도에서 세포증식을 억제할 수 있었다는 발표한 것26) 이외에 다른 결과는 없었고, 아직까지 뇌종양에서 최 근에 각광받기 시작한 9-cis와 4HPR 이형체를 연구한 보 고는 없었으며 수아세포종에서도 물론 없었다.
따라서 저자는 레티노익 산의 특성상 효과가 좋을 것으로 추측되는 수아세포종양 세포배양에서 all-trans, 13-cis, 9- cis, 그리고 4HPR 레티노익 산의 세포증식억제에 대한 효 과를 비교 확인하여 이결과를 동물실험과 임상실험에 적용 하고자 하였다.
연구 범위 및 방법
과거에 저자가 발표하였던 방법56)과 동일한 조건에서 다 만 all-trans, 13-cis, 9-cis, 그리고 4HPR 레티노익 산 을 사용하여 수아세포종에서 적용하였으며, 대략적으로 다 시 기술하면 다음과 같다. 수아세포종 세포를 4～5회 계대 배양하여 세포가 균일해지고 GFAP와 면역염색에 의해서 수아세포종임을 확인하고 나서 충분한 세포수가 확보될 때 까지 배양하면 배양세포를 대상으로 하여 all-trans, 13- cis, 9-cis, 그리고 4HPR 레티노익 산의 농도를 10 –6M 에서 10-11M까지 10-6, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 및 10-11M 등의 7단계로 나누고 각 단계별 세포성장억제(cell
growth inhibition) 정도를 MTT 검사에 의해 확인하고 그 결과를 비교 분석하였다. MTT 결과와 실제 세포수를 비교 하기 위해서 all-trans 레티노익 산의 경우에는 세포증식 억제 정도를 세포수도 세어서 직접 측정하였다. 모든 과정 은 3개의 군을 설정하여 평균값을 비교하였다.
1. MTT Assay
MTT는 노란색의 수용성의 tetrazolium 염색제로서 죽은 세포는 염색이 안되지만 생존해 있는 세포에 의해서는 비수 용성의 보라색 formazan 물질로 환원되기 때문에 색농도 측정에 의해서 간접적으로 생존해서 기능이 있는 세포수를 측정할 수 있는 방법으로 그 개요는 다음과 같다. 수아세포 종 세포를 플라스크에서 배양하고 단층배양된 세포를 try- psin처리에 의해서 세포를 모아서 원심분리(200g, 5분)하 여 10cc 배양액에 다시 섞고 수를 센다. 세포를 5×104 세 포/ml으로 희석하고 세포부유액을 9cm petri dish에 옮기 고 다열 pipet에 의해서 200ul를 제2번열부터 11열까지 각 well에 옮긴다. 37℃, 5% CO2하 배양기에서 1일간 배양한 후 여러농도의 각 레티노익 산과 함께 3일, 7일, 그리고 14 일간 추가 배양한 후 MTT(Sigma, USA) 50μl(2mg/ml) 를 각 well에 첨가하고, 37℃, 5% CO2하에서 4시간 더 배 양한다. 이때 대조군의 well에는 레티노익 산 대신 동량의 배양액을 사용하며, 레티노익 산은 빛에 불안정하므로 약물 추가과정은 낮은 조도의 어두운곳에서(60lux 이하) 진행한 다. 이 96 well plate에서 바닥에 있는 formazan결정이 제 거되지 않도록 주의하면서 digital multichannel pipette(Ti- tertek, Finland)를 사용하여 상층액을 제거한다. 이때 흡입 기가 well 바닥에 닿지 않도록 주의한다. 150μl의 dime- thyl sulfoxide(DMSO, Sigma, USA)를 각 well에 첨가하 고 진탕기(plate shaker)에서 formazan결정이 용해될 때까 지 36℃에서 10분간 진탕한 후 multi-well ELISA auto- matic spectrometer recorder(Berhinger ELISA Proce- ssor II, Germany)를 이용하여 570nm의 파장에서 판독한 실험군의 색소흡수율(absorbance, optical density)을 대조 군의 색소흡수율과 비교하여 다음의 공식으로 생존율을 구 한다.
% 생존율＝ 실험군의 평균 흡수율-기준 흡수율 대조군의 평균 흡수율-기준 흡수율 ×100 2. Assay for Viability by Dye uptake
수아세포종 세포 105개를 24well culture flask에 각각 옮기고 2일간 10% 우혈청 DMEM(Dolbecco’s minimal es- sential media, Hazleton, USA)에 배양하였다. all-trans
레티노익 산을 10-5M에서 10-9M까지 5단계에서 RA을 추 가하고 다시 14일간 암소에서 배양하였다. 이때 RA는 빛에 불안정하므로 약물 추가과정은 낮은 조도의 어두운 곳에서 진행하였다. 세포 배양후 trypsin solution 으로 처리하여 부유 세포액을 만들고나서 원심분리에 의해서 세포밀도를 105/ml 이상이 되도록 하였다. 세포액 10ul와 trypan blue 10ul 를 혼합하고 전체 세포중에서 trypan blue에 의해서 청색로 염 색되지 않은 세포수를 hemocytometer를 이용하여 세었다.
% 생존율＝ 실험군의 생존 세포수 대조군의 생존 세포수 ×100
결 과
1. MTT Assay
1) All-trans 레티노익 산의 효과
수아세포종에서 all-trans 레티노익 산의 경우 4일 노출 의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 113.6±32.1%, 10-11M의 농도에서 116.2±11.9%, 10-10M의 농도에서 113.0±11.1%, 10-9M의 농도에서 91.8±14.1%, 10-8M 의 농도에서 98.6±14.4%, 10-7M의 농도에서 89.1±13.9%, 10-6M의 농도에서 99.5±10.4%, 그리고 10-5M의 농도에 서 84.8±9.8%으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있었 으며 14일 노출의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 96.2±24.1%, 10-11M의 농도에서 97.4±8.5%, 10-10M의 농도에서 88.4±10.9%, 10-9M의 농도에서 78.8±14.3%, 10-8M의 농도에서 70.2±11.0%, 10-7M의 농도에서 69.8
±8.9%, 10-6M의 농도에서 74.4±18.6%, 그리고 10-5M 의 농도에서 38.4±11.1%이었다(Fig. 1).
2) 13-cis 레티노익 산
수아세포종에서 13-cis 레티노익 산의 경우 4일 노출의
경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 102.2±10.5%, 10-11 M의 농도에서 94.0±12.4%, 10-10M의 농도에서 99.6±14.0%, 10-9M의 농도에서 83.5±3.8%, 10-8M의 농도에서 79.5
±5.9%, 10-7M의 농도에서 73.7±6.8%, 10-6M의 농도에 서 81.5±15.9%, 그리고 10-5M의 농도에서 76.7±17.5%
으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있었으며, 7일 노출 의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 95.8±24.5%, 10-11M의 농도에서 88.8±8.5%, 10-10M의 농도에서 91.7
±19.2%, 10-9M의 농도에서 80.7±10.7%, 10-8 M의 농도 에서 72.6±9.3%, 10-7M의 농도에서 78.0±16.8%, 10-6 M의 농도에서 85.0±18.0%, 그리고 10-5M의 농도에서 73.1±
12.9%으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있었으며, 14 일 노출의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 119.9±
29.0%, 10-11M의 농도에서 103.7±10.0%, 10-10M의 농도에 서 96.1±7.9%, 10-9M의 농도에서 87.2±4.9%, 10-8 M의 농 도에서 88.0±8.3%, 10-7M의 농도에서 84.2±4.2%, 10-6 M 의 농도에서 88.0±6.7%, 그리고 10-5 M의 농도에서 72.8
±7.4%이었다(Fig. 2).
Fig. 1. The result of MTT assay of medulloblastoma cell culture with all-trans retinoic acid shows best response for growth inhibition, which was about 30% on 14th day below 10-5M.
Fig. 2. The result of MTT assay of medulloblastoma cell culture with 13-cis retinoic acid shows moderate response for growth inhibition, which was about 12% on 14th day below 10-6M.
Fig. 3. The result of MTT assay of medulloblastoma cell culture with 9-cis retinoic acid shows variable response for gr- owth inhibition, which was about 20% on 14th day below 10-6M. However, a significantly variable reverse proli- feration was showed in physiologic high concentration of 10-5M.
3) 9-cis 레티노익 산의 효과
수아세포종에서 9-cis 레티노익 산의 경우 4일 노출의 경 우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 91.2±18.2%, 10-11M 의 농도에서 88.7±18.3%, 10-10M의 농도에서 81.1±4.4%, 10-9M의 농도에서 78.7±7.6%, 10-8M의 농도에서 77.0
±14.8%, 10-7M의 농도에서 78.4±6.1%, 10-6M의 농도 에서 91.9±6.6%, 그리고 10-5M의 농도에서 91.6±6.4%
으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있었으며, 7일 노 출의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 98.1±32.9%, 10-11M의 농도에서 101.3±4.2%, 10-10M의 농도에서 98.5
±5.1%, 10-9M의 농도에서 99.1±14.6%, 10-8M의 농도 에서 87.7±4.9%, 10-7M의 농도에서 86.3±8.6%, 10-6 M의 농도에서 111.2±13.3%, 그리고 10-5M의 농도에서 121.9±25.0%으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있 었으며, 14일 노출의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에 서 98.1±25.8%, 10-11M의 농도에서 109.3±19.0%, 10-10 M의 농도에서 109.9±22.8%, 10-9M의 농도에서 90.9±
8.5%, 10-8M의 농도에서 83.1±4.9%, 10-7M의 농도에서 79.4±5.1%, 10-6M의 농도에서 101.8±11.9%, 그리고 10-5M의 농도에서 110.0±17.1%이었다(Fig. 3).
4) 4HPR 레티노익 산의 효과
수아세포종에서 13-cis 레티노익 산의 경우 4일 노출의 경 우 광흡도에 따른 10-12M의 농도에서 136.5±66.6%, 10-11 M의 농도에서 121.9±17.6%, 10-10M의 농도에서 110.9
±15.3%, 10-9M의 농도에서 103.8±17.0%, 10-8M의 농 도에서 120.1±11.1%, 10-7M의 농도에서 110.1±28.1%, 10-6M의 농도에서 74.0±17.9%, 그리고 10-5M의 농도에 서 34.0±19.8%으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있었으며, 7일 노출의 경우 광흡도에 따른 10-12M의 농도 에서 96.7±27.9%, 10-11M의 농도에서 94.2±9.1%, 10-10M 의 농도에서 90.8±6.3%, 10-9M의 농도에서 88.1±4.8%, 10-8M의 농도에서 83.8±4.4%, 10-7M의 농도에서 80.0
±6.9%, 10-6M의 농도에서 71.0±7.5%, 그리고 10-5M의 농도에서 54.2±6.8%으로 농도에 따른 광흡도의 감소를 볼 수 있었으며, 14일 노출의 경우 광흡도에 따른 10-12M 의 농도에서 103.2±30.2%, 10-11M의 농도에서 106.4±
9.0%, 10-10M의 농도에서 102.5±7.4%, 10-9M의 농도에 서 96.7±4.8%, 10-8M의 농도에서 90.2±6.4%, 10-7M의 농도에서 84.8±5.2%, 10-6M의 농도에서 92.9±23.8%, 그 리고 10-5M의 농도에서 85.4±24.1%이었다(Fig. 4).
2. Assay for inhibition of cell growth(Fig. 5)
All-trans 레티노익 산에 노출된 수아세포종 세포는 대
조군에 비해 성장이 억제되어 세포수가 감소하였으며, 감소 정도는 레티노익 산의 농도에 비례하였다. 대조군에서 106
±12.12×104/1.9cm2의 세포수를 보였는데 비하여 10-9M 의 농도에서 64.3±6.03×104/1.9cm2, 10-8M의 농도에서 39.7±3.51×104/1.9cm2, 10-7M의 농도에서 27.6±3.70
×104/1.9cm2, 10-6M의 농도에서 18.7±2.50×104/1.9cm2, 그리고 10-5M의 농도에서 13.1±2.50×104/1.9cm2으로 농도에 따라서 세포수의 감소를 볼 수 있었으며, 대조군과 비교한 각각의 농도에서의 세포수의 비율은 60.7±9.3%, 37.4±8.9%, 26.0±13.4%, 17.6±13.4%, 그리고 12.4±
19.1%였다.
고 찰
레티노이드는 화학적으로 비타민 A와 관련된 자연 또는 합 성 물질들을 일컫으며, 이러한 물질들은 분화(differentiation), 배형성(embryogenesis), 그리고 면역 반응 등을 포함한 여 러 다른 생물학적 과정에서 중요한 작용을 하는 것으로 알려
Fig. 4. The result of MTT assay of medulloblastoma cell culture with N-(4-hydroxyphenyl)retinamide shows poor resp- onse for growth inhibition, which was about 16% on 14th day below 10-6M. However, a poor inhibition of growth about 7% in physiologic high concentration of 10-5M.
Fig. 5. The result of cell count of medulloblastoma cultured for 14 days with all-trans retinoic acid show dramatic effect in the inhibition of proliferation of medullobla- stoma cells.
져 있다29)49). 항암영역에서는 1925년에 Wolbach와 Howe55) 에 의해서 비타민 A 결핍증이 쥐에서 광범위한 상피세포의 이형성(metaplasia)가 발생하는 것을 관찰한 보고에서 부 터 시작되었다. 최근에 세포배양에서 all-trans 레티노익 산에 의해서 극적인 항암효과가 보고됨으로서 암환자에서 레티노이드의 치료 가능성에 대해서 관심이 집중되었으나47) 생체투여에서 높은 독성으로 임상적용에 어려움이 있었다48).
Retinoic acid는 여러 isomeric 형태가 있는데 생체에서 는 all-trans, 13-cis, 그리고 9-cis 이형체로 상호변환되 며 이들이 주된 생물학적 작용 성분으로 알려져 있다. 그러 나 이중에서 all-trans 레티노익 산보다 13-cis 이형체는 체내에서 반감기가 더 길고(1.3시간), 간 독성도 all-trans 이형체보다 적으며34)54), 9-cis 이형체는 150mg/m2/day 이상까지 고용량 투여가 가능하며24) t1/2도 1.6～1.9시간으 로 all-trans 레티노익 산보다 길고53), HL-60 세포주에서 all-trans 이형체의 지속적인 투여에 의해서 resistant해지 지만 9-cis 이형체에서는 지속적인 투여에도 효과에 차이 가 없다22)는 장점이 있다. 마지막으로 HPR은 레티노익 산 의 합성유도체로서 독성이 적으며, 유방암 등의 몇몇 특정 세포에서 항암효과가 탁월하다는 보고35) 등으로 네가지 상 기한 레티노이드에 대해서 가장 많은 연구가 진행되고 있다.
종양증식억제의 기전으로 EGF receptor의 activity 감소58), 또는 레티노이드의 핵수용체에 의한 신호 전달 등이 추측되 고 있다. 레티노이드의 핵수용체는 retinoic acid receptor (RAR)과 retinoid X receptor(RXR)이 알려져 있는데, RAR 은 ligand-dependent transcriptional regulator로서 RXR 과 heterodimer를 이룸으로서 작용하므로, RXR은 ligand- independent auxillary factor로 작용할 것으로 추측하고 있 다50)59). 그런데, all-trans 레티노익 산은 RAR과 결합하지 만31) 9-cis 레티노익 산은 RAR뿐만 아니라 RXR과도 결 합하며47), 13-cis 이형체는 모두 결합하지 않는다6). 따라 서 핵수용체에 의한 레티노익 산의 효과는 직접적이라기 보 다는 간접적인 결과로 추측되고 있다. 최근에 RARb가 발현 이 없어지면 발암과 관련이 있다고 보고되었으며19), 암환자 에서 RARb 발현이 감소된 경우에 예후가 나쁘고, 반대로 RARβ가 발현된다는 사실은 좋은 예후인자로 알려져 있다13), 그런데, RXR 특정 결합 agonist 인 LG153에 의해서도 RARb 발현이 유도되므로 RARb 발현은 RXR도 관여할 것으로 추 측되고 있다28). 또한 세포주에 따라서 다른 이형체에 의해 서 synergy를 보이는 경우도 있지만22) synsergy를 보이지 않는 경우도27) 있어 세포주마다 작용기전이 다를 것으로 추 정되었다. RARb 외에 RARa16)44)와 g에 대한 연구도 있지 만4)15) 아직 역할이 확실하지 않다. HPR은 레티노익 산와
다르게 분화없이 아포토시스만을 보일 수 있다는 보고9)와, HPR을 breast cancer cell에 투여할 경우 여러 가지 분화 표지(class 1 HLA, laminin, β1 integrin chain) 발현을 증 가시키며, 종양 증식과 관련된 인자들의(p185/HER2 on- coprotein, EGFR, Mr 67,000 laminin receptor) 발현을 감소시킨다고 보고39)가 종양세포의 증식억제 기전에 의미가 있는 지도 아직 확실하지 않다.
체외실험에서 레티노익 산의 효과는 신경종양 세포중에서 는 neuroblastoma 세포주에서 처음 시도되었고, 그 결과 all-trans 레티노익 산뿐만 아니라 13-cis 레티노익 산에 의해서도 증식억제가 가능하였으며, 10-6뿐만 아니라 10-9 M의 저농도에서까지 증식이 억제됨은 잘 알려져 있다2)46). 그러나 rat의 C6 교종 세포주에서는 레티노익 산에 의해서 10-5M 이상의 고농도에서만 증식이 억제되었다는 보고도 있지만5)18) Yung 등58)에 의하면 rat의 C6 교종세포주에서 보다 인간의 교종세포주에서는 레티노익 산에 대하여 예민 하여 10-7-10-6의 비교적 적정 농도에서도 증식을 억제할 수 있었다고 하여 현재 임상적 시도가 이루어지고 있다8)20)40)45)
. 9-cis 이형체는 HL-60세포주에서 분화를 유도하는데 있 어서 all-trans 이형체보다 효과적이었으며33), 어떤 세포주 에서는 all-trans이형체에 거의 비슷한 증식억제효과를 보 였다고43) 하였지만 Lovat등28)이 neuroblastoma 세포주에 서 10-8M이하의 저농도에서는 9-cis보다 all-trans나 13- cis 레티노익 산을 처리할때 neurite 길이가 더 길어지며, 10-6M이상의 고농도에서는 9-cis가 더 효과적이라고 보고 하였다.
HPR에 대해서는 HL60R 세포주에서 all-trans 레티노 익 산 10-6M농도에서 증식억제가 없었던 반면에 HPR은 10-6 M 농도에서 25%이하로 증식이 억제되므로 HPR이 all- trans 레티노익 산보다 효과적이라고 발표되었고9), 또한 난 소암의배양에서 cisplatin의 투여농도를 0.1uM로 할 때 약 50% 세포생존율을 보이는데 0.5uM HPR을 동시 투여함으 로서 cisplatin의 투여량을 0.02uM로 낯추어도 같은 생존 율을 나타내므로 HPR을 동시투여하는 것이 cisplatin의 효 과를 향상시킬 것으로 추정한 보고51)도 있으며, neurobla- stoma 세포주 배양에서는 10-6M 농도의 HPR을 투여한 경우에 all-trans 레티노익 산를 투여한 경우보다 세포증식 이 6개 세포주중 2개 세포주에서 10배이상 감소하였으며, 2개세포주에서는 2배정도 감소하였고, 나머지 2개세포주에 서는 비슷한 수치를 보였다는 보고도 있다42).
Neuroblastoma 이외의 뇌종양에서 각 레티노이드의 효 과에 대한 비교 연구는 윤 등57)이 교모세포종에서는 all- trans 레티노익 산과 13-cis 이형체에 의한 종양증식억제
효과가 세포주에 따라서 커다란 차이를 보여 일률적으로 효 과판정을 할 수 없었다는 보고가 있었다. 수아세포종에서 레티노이드의 효과에 대해서는 Mork 등36)이 수아세포종 체외실험에서 1uM 농도의 13-cis 레티노익 산에 의해서 증식억제가 되지 않았으며, 6일간 노출하여도 신경세포표지 (neuronal cell marker)의 발현정도나 교종 표지물질(glial maker)의 발현정도에 차이가 없었다고 발표한 보고와 Li- eberman 등26)이 수아세포종 세포주 D-283에서 all-trans 레티노익 산 10-6M에서 10-7M 농도에서 세포증식을 억제 할 수 있었다고 보고한 것이 전부로서 수아세포종에서 각 레티노이드의 효과에 대해서 비교한 연구는 전혀 없었다.
수아세포종에서 레티노이드의 종양세포 증식억제 효과에 대 한 본연구 결과는 약물 노출 시간과 약물 농도에 따라 많은 차이를 보였는데 임상적 치료에 적용하기 위해서 결국 임상 적으로 가능한 농도 즉, 10-6M에서 장시간의 약물노출에 대한 결과가 중요할 것으로 추측되었으며, 10-6M 이하농도 에서 all-trans 레티노익 산에서 약 40%의 증식억제를 볼 수 있었으며, 실제로 10-9M에서도 비교군에 비교하여 세포 증식 억제효과가 뚜렸하였다(Fig. 6).
세포수를 직접 세었을 때에 10-6M 농도에서 약 83%, 그리고 10-5M에서 88%가 억제됨을 고려한다면 MTT에 의한 증식억제정도가 세포 수 자체에 1：1 비례관계에 있 지는 않는 것으로 사료되었다. 결국 이러한 네가지의 레티 노이드의 수아세포종에서 종양세포 증식억제 효과에 있어서 all-trans 레티노익 산이 가장 효과가 좋았고, 그외에 13- cis 이형체, HPR의 순이었으며, 9-cis 이형체는 수아세포 종에서는 종양증식억제 효과가 없었으며 오히려 증식이 촉 진된 결과를 보였는데 최근에 Esquenet 등10)에 의하면 레 티노익 산에 의해서 증식촉진의 결과를 얻을 수도 있다고 하여 본 연구결과와 일면 일치하는 것으로 사료된다. All- trans 이형체보다 13-cis와 9-cis 이형체는 임상적으로 혈중농도를 2～4배 높일 수 있다는 가정을 하여도 변함이 없이 all-trans 이형체에서 가장 효과가 좋았다(p<0.01).
또한 all-trans 이형체의 경우 MTT에 의한 증식억제측정 에서 10-5M부터 10-8M까지 농도에서 약 30%의 증식 감 소를 세포배양 4일부터 7일까지 모두에서 볼 수 있었으나 4일보다는 14일에 효과가 증가하였으며(p<0.01), 세포수 를 직접 센 경우에는 10-9M 이하 농도에서도 50%이상 증
Fig. 6. Meduloblastoma cells cultured for 14days with all-trans retinoic acid of the concentration from 10-8M to 10-4M and control group. 10-5M concentration group of all-trans retinoic acid shows dramatic inhibition upto 90% in the proli- ferated cell number compared to control group.
식이 억제될 수 있다는 사실은 소량의 지속적인 all-trans 레티노익 산 투여가 수아세포종에서 종양증식 억제효과가 있을 수 있다는 의미로 해석할 수 있기 때문에 임상적 적용 에 중요할 것으로 추측된다. 임상적 적용을 위해서는 여러 수아세포종 세포주에서 이러한 사실이 다시 확인되어야 하 며 동물 실험에 의한 체내실험이 필요할 것이다.
•논문접수일：1998년 4월 6일
•심사완료일：1998년 4월 27일
•책임저자：윤 수 한
442-749 경기도 수원시 팔달구 원천동 산 5번지 아주대학교 의과대학 신경외과학교실
전화：0331) 219-5664, 전송：0331) 219-6658
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