Histochemistry에 의 한 Muscle Study와 엄 상적 의 의

대 한임 상;영 리 샤회 지 : 제 16권 채 1 호 1984

Histochemistry에 의 한 Muscle Study와 엄 상적 의 의

서울大學病院 病理科

張淳喆·李載澤·金柱鎬·鄭關仁

:Muscle Study based on Histochemistry and Clinical Significance

Jang Soon-CheoI, Lee Jae-tack, Kim Joo-Ho, Chung Hak-In

Depar‘tment 01 Pathology. Seoul National University Hospital

=Ahstract=

For diagnosis of myopathy, identification of the muscular type, detection of storage product and structural change of the muscle tissue are of importance; enzyme histochemical, histochemical and electron microscopic method was applied on muscle specimen.

Four types of muscle fibers have been distinguished by histochemical method such as; type 1 type rr A, rr ^B, rr c.

Here, We have tried some of the histochemical stains for muscle fibers, baced on the methods described in “MUSCLE STUDY; A MODERN APPROACH" written by Dubowltz and Brooke,

I. 績 論

현재 까지 의 Muscle 의 조직 학적 검 사에 는 Muscle의 종단면파 횡단면에 일만 H&E 염색파 특수염색중 PT- AH, Van Gieson, Masson Trichrome, P AS 등이 주로 이 용되 고 있 A 나 1950 년대 이 후 histochemistry가 말 천을 하게 되 어 Duboltz와 Pearse를 비 롯한 여 러 학자 들에 의해 Muscle의 해부학적 소견중 white _fiber와 Red fiber가 histochemistry _{반응에 서 4가지 로 쿠분됨} 을 밝혀 내 였다. 그 type이 type 1, type II a, II b, II c 이며 이들중 type llc는 유아초생기에 갖고 있어 성장 하면서 없어진다.

일 반적 ~로， Histochemistry는 크게 두가지 로 분류할 수 있는데， 다음과 같다.

1. Immunohistochemisty…조직절련 위에 헝-원 • 항 체반응을 시킨 후 이 반응산물을 발색시켜 검사하는법

2. Enzymehistochemistry'" 조직 이 함유하고 ^{。 l~}_λ‘꺼:

어 떤 enzyme에 특정 기 질을 반응시 켜 그 반응된 종산 물을 검사하는 법

그런테 , muscle study는 근육에 함유된 여 러 효소를 검 출하는 것 이 묘로 여 기 서 는 enzymehistochemstry 방 법을 적용한다.

II. 檢훌方法

Enzymehistochemistry릎 시 챙 하기 위 한 일 반적 안 과 정응 다음과 같다.

1. 싣험 동물 또는 살험 장기 의 biopsy 2. 조직 의 trimming.

3. 효소의 활성 을 유지 하기 위 한 quick freezing (표 1 참고)

4. cryo cut에 서 frozen section 하여 slide 제 작

5. Wind dry 하여 조직 을 slide에 fix.

6. 원 하는 enzymehistochemisty stain.

7. Light microscopy(LM) 또는 Electron microscope

Techniques of freeze-substitution

Author(s) Quenching, oC Substituents Temperature, oC

Simpson(1941) Isopentane-liquid N2 Ethanol or rnethyl cellos01ve -40 to -78 Lison(1949) ‘As for freeze-drying’ Ethanol or Gendre f1uid -40 Russel et a1.(1949) Isopentane-liquid N2 Ethanol with rnetal salts -78 Blank et a1.(1951) ^I Propylene glycol -20 Propylene glycol -20

Persson(1952) Isopentane-liquid airjN2 EtOHMeOH 1 : 1 -31

Baud(1952) Isopentane-liquid Nz Acetic alcohol -40

Gourevitch(1953) Ethanol -65 Ethanol -20

,

Peyrot(1956) AcetonejC02 Rossrnann’s fluid -60 to -65

Hancox(l95-Sηid Isopentane-liquid Nz n-butanol -38

Feder and~Sidrnan (1958a) AcetonejC02 Osrnic-acetone -70

Feder and Sidman(1958b) Prqopuaidne N-is2opropane-1i- HgC12-Ethanol -70 Fernandez-Moran(1960) Liquid heliurn 11 I Acetone-Ethanol -80 to -130

4

Rebhun(1961) ^{- ‘ ,-} Freon 12-liquid N2 Osrnic-acetone -80

‘‘’뺏

Rebhun and Gagne(1962) Propane-liquid N2 Acetone-Ethanol -108 Bart1(1962) Isopentane-liquid N2 Etrh33ddaetnee g1ycol monomethac. -65 to -80 Van Harreveld et a1. ^I Silver rnirror -207 ¹ 2% Os04-Acetone -85

(1965)

-50 -77

Pease(1967) j Brass block -196 ⁱ Propylene glycol -40

Müller and Geyer(1970) Pentane-liquid N2 ^I Cr20‘ ^{Ethanol -79}

Halhuber et a1. (1971) I Pentane-liquid N2 ! PbAc2-Methanol -79

Neumann(1973) I Propane-liquid N2 ! OsOcHexane -80

표 1. 여 러 가지 Quick freeze methods.

관참

(1) Muscle Histochemistry 쉽 사펴→쉰

1. 근육이 갓고 았는 효소플 .5L흔꽉가 위단 도직 ε1 {깅uick freeze '닙 으로 Liquid 낀itrogen (l\2) ， isop긍ntane，

ice jar블 준바 란 ι

2. Cork p:ate 페 Tragacanth gnm오후 루걱 을- 지 지 할 embedding media릎 만들고 ‘+’자 션으로 칠개해

_，"，，-1-니

‘당 τ~;""'-t.

3. lvlusc1e biopsy플 텅 한디 •

4. 걱출한 조직표갚을 cork plate 위 ‘÷’자행 흠이1 넣고 그 주위플 tragacanth gum으로 지지해준다.

5. 둔바 던~ ice jar 의 온도인 -120⁰C섹 1 ，，-， 2 분간 천 천허 처으녁 급속 동결한다.

6. 등결절현기 (cryostat) 에서 8" ,10 microns르 박칠하 여 slide를 제 끽「한다.

7. 약 1 시간 분안 slide블 \vind dry 사킨다.

8. 원하는염색을한다.

(2) ATPase ^{염 색} (calicium.citro-phosphate ^법 )

Principle of Aipase Stain A TPase, pH9. 4, 37⁰ C

ATP →ADP 十 Terminal

phosphate

In incubation solution, the terminal phosphate im- mediately combines with ca1cium and makes Calciurn phosphate. This reaction products are insoluble in pH 9.4 alkaline solution. Therefore, its dεposite can be detected at the site of the enzyme ^activitγ.

Ca. phosphate+CoC12- -• Cobaltous phosphate (COJ(P04)2 Co. phosphate+ (NH4)2SX^• Cobaltous sulfide

Ammo. sulside insoluble, dark deposits (2) ATPase ^{염 색 의 반응원 리}

기칠안 ATP는 조직이 갖고 있는 ATPase에위해 pH 9.4, 37⁰C 조건에 서 ADP와 terrninal phosphate로 변 화되 고 , 다시 cobalt chloride로 만웅시 키 면 cobaltous

phosphate가 생 성 된다. 최 종적 으로 Arnmoniurn sulfide

와 만응시 키 면 cobaltous sulfide 가 생 기 게 되 는데 이 불

- 100-

철은 불용성의 dark brown color후 ATPase 효소활성 - 이 위 치 다는 풋과， 만응되 는 정 도에 짜라 strong, mo- derate, πeak 세가걱후 쿠분된다. 이 반응 전에 pH 4.

2, pH 4. 6, pH 9. 4 등우료 전처턱릎 하면 각각위 pH 011 사 mt:scIe fibεr가 반응을 달리하게 된다. 그 정도는 표 3과 갚우 디4 , 결국 muscle fil::er가 지 니 고 있 는 ATP ase 각 다 간상 야 ^! 렉 muscle fiber type 이 결정 된피 .

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三 3. 각 pff어l 하른 ATPase 각 황성 도

(ATPase c닐 걱 괴 정 >

CI' prefix 15 란깐 4⁰C prefix soLltion.

paraform aldehyde ... lg Scd. pyrophosphate ... 2g

sucros 긍 ••••••••••••••• J … ... 13g SPB buffer pH 7.4 ... 10ûml 양 4⁰C chilled D. W후 5 분삭 8회 washing.

@ pH 4. 2, pH 4. 6, O. 1M acetate buffer어1 10"'15

분 preincubation 실온

@ vVashing solution에 3분

washing solution (pH 9.4로 조청 ) O. IBM CaClz' ... 10ml O.lM sod. barbital ... 20ml Distilled water ... 70ml

@ A TPase incubation solution adjust pH 9.4 37⁰C Water bath에 15분

O. 1M Tris-maleate buffer ... 40ml calcium chloride ... 320mg citric acid ... 60mg A TP disodium salt ... 100mg Gelatin ... 800mg

@D.W에 2 분씌 3회 수세 (j) 2% cobalt chloride 용액에 3분

@D.W에 2분씩 3회 수세

핑 1 % sod. sulfide yellO\v 용액 에 l 분

〔필 D.W. 수제→갈수→투명→봉입

(3) NADH-Tetrazolium reductase 염 색

NADH-TR(Tetrazolium-reductase) NADH-TR. 37⁰C

NADH • NAD 十 H+

substrate

H++NBT(or MTT) tetrazolium compounds sa1t electron acceptor

-• insoluble formazan

As this formlzan becomes purple color, we can detect the locus of enzyme activity.

표 4. NADH-TR 염 색 의 반응원라 이 염 색은 substrate 안 NADH 가 NADH-TR diapho- rase의 작용으로 37⁰C에 서 NAD와 H+로 분리 되 고 전 자수용체 인 NBT(Nitro Blue tetrazolium) 색 소와의 결 합~로 purple color 안 formazan이 되 어 효소의 활성 아 있는 곳에 발색된다.

(NADH-TR 염 색 과정 >

CD incubation solution에 37⁰C, 30 분간 incubate O. 2M Tris buffer pH 7.4 ... 10ml NBT ... 10mg NADH ... 8mg

용액의 pH를 7.4로 adjust.

@ 30% → 60%-~90% →60% →30% aceton 용액 에 단 계적으로 여분의 반응물을 추출해낸다.

@ 증류수로 잘 수처1 란다.

@ Glycerin jelly로 봉입한다.

Fig. 2. NADH-TR 염 색

Type 1 purpule

Type IIa intermediate purple Type IIb pale purple

(4) PHOSPHORYLASE

This enzyme catalyzes the synthesis of polysacch- aride ch3.i ns from glucose-1-phosphate.

Glucose-1-phosphate+polysaccharide primer

~

~

reversible

inorganic phosphate+ glucosyl (α-1 ， 4') primer The reaction color vary according to the length of chain stained by diluted Lugol’s iodine solution.

α-1， 4' glucosyl chain length color

41"'-'6 units ... no color

8^1"'-'12 units ... red

301"'-'35 units ... blue

표 5. Phosphorylase 염 색 의 반응원 라 이 효소는 세포질내에 위치하면서 생체내에서 glyco-

gen으로 부터 a-1, 4-g1ucose-1-phosphate로 분해 하거 나 가역적으로 glucosyl primer로 부터 inorganic pho-

sphate와 결 합하여 polysaccharide chain을 형 성 하는효 소언데 이 효소의 활성이 있는 곳에 활성의 캉도에 딱 라 polysaccharide chain의 걸 이 가 결 정 되 며 , 이 chain

이 lugol’s iodine 용액 파 반응하게 되 면 표 5에 나타냐 있는 units 의 차이어1 짜라 발색되게 펀다.

(phosphorylase 염 색 과청 >

CD incubation 용액 에 60분간 incubate 시 킨다. 37⁰C O. 2M Acetate buffer pH 5.6 ... 10ml Adenosine monophosphate(AMP) ... 10mg G 1 ucose-1-phosphate ... 50mg 0.2M sodium f1uoride ... 1. 25ml Glycogen ... ldrop.

Polyvinyl pyrrolidone(PVP) ... 0. 9g Distilled water ... 6. 25ml

용액 은 매 캠 사전 fresh하게 만들고 1M HCI . pH 5. 7에 adjust 시 컨다.

Fig. 3. phosphorylase 염 색

Type 1 : pale pinkish red Type II : blue.

- 102-

@ 증류수로 2rv3회 수세 한다.

@ Lugol’s iodine 액 을 사용전 1 : 10_으로 희 석 하먹 ,

조직켈련연의 가장자리가 노닿게 되도록 1분정도 엽색한다.

@ 증류수루 짧게 수세 한다.

@ Glycerin jelly로 경-입 한다.

이 반응은 빛이} 민감하묘로 염색후 즉시 사잔을 만 들어 두는 것이 좋다.

(5) Modified Gomori’ s Trichrome stain.

〈염색과정〉

<D Harris Hematoxy1in에 5분간 핵 염 색

<ID tap water에 2rv3분 수세

@ Modified Gomori’s solution에 10분 염 색

Chromotrope 2R ... …0.6g Fast green FCF ... ………0.3g Phoshotungstic acid ... 0. 6g G lacial acetic acid ... 1. Oml Distilled water ... …100ml

pH 3.4로 adjust

@ 0.2% acetic acid 30초

@ 탈수→투명→봉입

〈염색결파〉

muscle fibcr ... greenish blue nuclei ... red collagen ... lighter, cIealy green myelin of the nerve ... red intermyofibrilIar net\^\Tork ... dark red

Fig. 4. Modified Gomori’s trichrome _{염 색} 이 상으로 muscleo] 지 나 고 있는 몇 가지 의 histoche-

mistry 만응을 종합해 보면 표 6파 같마.

T、[l(' 1 _IIA 1m ll':

APTasc pH 9.4 。 @ @

•

rH 4.5

•

{꺼 4. :2 용 0 ^。

o

r‘ ADI -ì -TRδDH) 앓용 @ 。

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Muscle ~\F ’ ; sppcific fcaturc in histoch(ηnicai ~tudy.

@ δ‘~-l)! !).~ c떠깅 ul……lt따따t““erm('( _{。\、 cak}

표 6. 여 러 가지 histochemisty 염 색 법 에 의 한 muscle

fiber의 identification table.

(6) 전자현미 경 적 관찰

Fig. 5-1. SkeletaI muscIe의 cross section 배 율 × 3,300

EM 사진은 통성 EM 과정을 거쳐 제작된 것인데 muscIe의 세 부쿠조를 잘 보여 주고 있 어 histochemistry 염색파 비교해 불 째 좋은 참고가 된다.

A: A band Z : Z line H : H band 1 : 1 band M : M band T : T-tubule

또한 해부학적 소견과 생화학적 소견， 조직화학적 소견， 생 리 학적 소견， 천자현미 경 관찰을 종합해 보면 Musc1e의 Type 1 fiber와 Type II fiber의 특성 을 표

7 같이 종합할 수 있다.

- 103-

Fig. 5-2. Skeletal muscle ^늬 cross section 배 율 x13,

000

Fig. 6-1. Skeletal musc1e의 longitudinal section 배 율 x3， 300

ill. 結論 및 考察(임상적 의의와 폼例)

Muscle study에 대 한 histochemistry는 musc1eo] 아 주 다량의 enzyme을 가지고 있다는 추측속에 관심과 연구의 목표가 되 어 왔으며 그 목척 은 myopathy릎 진 단하기 위해서 나 musc1e fiber type을 동정하기 위해서 이다. 근육생검에 대한 조직화학척 방법의 가치는 3가 치 변에서 중요한 이유가 있다.

Fig. 6-2. Skeletal muscle 의 longitudinal section 배 율 x13， 000

||

L

Anatomic ¹¹ color ^! red characteristics 11 site [ deep

j diameter : sma 11 Biochemical ^I1 oxidativeenzyme! ^high

characteristics ¹¹ myoglobin ^! high jj giycolysis enzy j low

i me

Histochemical |j NADH-TR ; high characteristics ^1I P AS 10w

1 A TPase pH9. 4 ⁱ low j Oil red 0 ¹ high Physiological ¹¹ retraction time tonic characteristics ¹¹ neurotrans timeì tonic Em observation 11 mitochondria 1 many

11 z꾀e width ^I wide

l 때ite

1 surface

1 large

f iow

low I high

! 1。、?

high

, high

i 1。、γ

l

l

표 7. Muscle fiber Type 1 과 Type II 의 특성 증명하여 어먼 질병이 진행중인가 얄 수 있다.

2. McArdle’s disease 혜 에 phosphory lase ^효소결합

처 럼 특정 효소의 결 여 와， Glycogen storage disease ^째 에 muscle내 에 glycogen의 다량 축적 처 럼 어 떤 특정 산 물의 파다나 결핍증을 알 수 있다.

3. Mi tochondria 분포의 비 정 상에 서 보이 는 “^Moth.

eaten" fiber의 경우 일반염색으로는 감벨이 안되는 효 소결핍공을 알 수 있다.

다음의 증례는 57세의 남자로 팔을 툴지 못하는 근 무력증을 호소로 신경외파에 입원한 환자의 biceps 1. 여 러 가지 의 효소반응을 통해 muscle fiber type을 muscle biopsy야 다. Fig. 7-1 H&E 염 색 에 서 화살표

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가 지 시 하는 것 이 muscle fiber type I!:_로 청 상안 fiber는 둥그런 형 상 을 이 루나 이 fiber는 atrophy를 후 여 주고 샀다.

Fig. 7-2 펴 서 지 시 된 화갈표는 type 1 fiber 안데 NADH-TR 염 색 에 서 염 색 이 고르게 되 지 않고 “rimm- ed vacuole" 을 형성하고 있다. 이 환자는 최종 muscIe fiber type 1 atrophy myopathy록 진 단되 었 다.

Fig. 7-1. H&E 염 색 8microns frozen section isopent- ane/Liquid Nitrogen -120⁰ C에 서 Queek

freεze. fore arm biceps musc1e

Fig. 7-2. NADH-TR 염 색

(Reference)

1. Wil1iam & Wiskins : The Striated Ml1scle, p. 5 rv7, 31 rv35, 159rv 161, 1975.

2. Gil1is, ].l\1. and Pages: loca1ization of ATPase activity in striated muscle and probable sources of artifacts ]. CelI. Science 2 : 113rv 117, 1967.

3. Brooke l\1.H. and Kaiser K.K. : Some comments on the histochemical characterization of l\luscle adenosine triphosphatεse. J. Histochemi. Cytoc- hemi. 17: 431rv2, 1969.

4. Dubowltz and Brooke: l\1ajor problems in Neur-

이 ogy p.21^{r v}33, 1978.

5. Pearse: Histochemistry theoretical and applied.

1980.

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