Streptomyces sp.

임상병리검사과학회지

제 31 권 제 2호

Streptomyces

생산하는 향 메치설련 내성균성 항생물질의 분리 ·정제 및 이;화학적 성질 조사

강북삼성병원 임상병리과 이범희·이광근

Purification and Some Physico-Chemical Properties of Anti -MRSA Antibiotic Produced by Streptomyces sp. AMLK -135

Lee, Bum Hee., Lee, Kwang Keun

Dept. 01 Clinical Pathology. Kangbuk Samsung Hospital, Seout Korea

This study was carried out to isolate and

puri젠

Staphνlococcus

Streptomνces

The results obtained were summarized as follows

1. The culture broth of Streptomνces sp. AMLK-135 possessed anti-MRSA activity against

Staphνlococcus

Staphνlococcus

2. By the separation and purification of anti-MRSA antibiotic from

Streptomνces

AMLK-135 using amberlite lRA-400 ion exchange column chromatography, butanol extraction, cellulose column chromatography, sephadex LH-20 gel permeation column chromatography and HPLC (mobile phase: 35% methanol), the antibiotic AM-1 was obtained as a single peak with excellent resolution.

3. The anti-MRSA antibiotic AM-1 possessed a oily property, soluble in MeOH and water and had a maximum UV absorption of 230 nm

4. The infrared spectrum of the antibiotic AM-1 showed absorption bands at 3500-3000 cm-¹ (hydroxyl, -OH), 2520 cm-¹ (amine, N-H) and 1451 cm-¹ (ß-lactone, C=O, C-O)

Key Words : Streptomyces sp. AMLK - 135, Anfibiofic AM-1

1 .

서 ^료르

Methicillin Resistant

않aphνlococcus

(이하 MRSA) 라 함은

16μg/m1) 이나

(으 4μg/m1) 에 내성인 균주를 뜻 하는 것으로서 (정，

methici1lin 이 임상에 사용된지 2 년 뒤인 1961 년에 영국에서 보고된 이후 1970년대 후반에는 미국에서 중요한 원내

lococcus aureus TK -7 84

균주

1985) 에 대한 항생물질을 생산하는 토양으로부 터 분리된 방선균 (앉reptomy∞s

이 생산하는 항메치실린 내성균성 항생물질의 분 리.정제 및 이화학적 성질을 조사 하였다.

II.

실험재료 및 방법

감염 원인균으로 그 분리 빈도가 증가되기 시작

생산균주의 선정 하였다

우리나라에서의

MRSA의 분리 현황을 보면 1970년대 임상검체 항생물질 methici1lin에 내성을 나타내는 병원 에서 분리된 Staph，νlocooαs aureus의

미 성세균 ，

-784를 억 만이 MRSA 이었으나， 1980년대에는 약 40% 에 제하는 항생물질을 생산하는 방선균， Streptomνces 서 50%정도로 보고 되다가 (홍 등，

정

AMLK-135를 공시균주로 사용하였으며， 본

등，

1990 년대 초반에는 60% 이상으로 증 균주는 건국대학교 축산대학 동물자원연구센터

가 되었다 (이 등，

김 등 (1993) 의 보고 생리활성물질 및 기능성식품 개발 연구실에서 분 에 의하면 1992 년도 후반기의 MRSA에 의한 감 리

동정되었다.

염이 전체 포도상구균 감염의 58%를 차지하고

있고， 원외감염이 27% 인 것에 비해 원내감염은

배양방법 및 생육곡선의 측정 80%나 되어 원내감염의 가장 중요한 원인균의

하나로 확인되었다. MRSA에 대한 치료제의 개 균주의 보존을 위한 계대배양시

발에 관한 연구는 새로운 항 메치실린내성균성

medium을 사용하여 사면배지 항생물질의 개발

를 만들어

배양기에서 2-3 일간 배양하였

Kimiko et al., 1990; Harold et al., 1989;

다. 전배양을 위한 배지는

medium을 사

Atsushi et al., 1988; Matsuo et al.,

1994) 과 용하여

flask에 100lml 씩 기존의 항생제들의 병용투여 등에 관한 연구 을 분주하고 사면배지에 성장해 있는 집락을

백금이 접종하여

rotaη

1994) 가 많이 이루어지고

Japan) 에서 2 일간 전배양을 있으나 현재까지 큰 효과를 가두고 있지 못하는 실시하였다. 대사산물을 얻기위한 본 배양배지는 실정이므로 MRSA에 선택적이고 강한 항균활성 항생물질 생산 기초배지인

medium을

을 가지는 새로운 항생물질의 개발이 시급한 문

j없

제라고 할 수 있다. 이미 선진국에서는 미생물공

Bioengineering) 에

liter를 조제하 학 기술을 이용하거나 유전자 조작을 통한 신물 고 전 배양액을

접종하여

질 탐색에 많은 자본과 기술을 투자하고 있다 liter

min으로 27t 에서 4 일간 배양하였다.

따라서 본 연구는 항 메치실린 내성균성 항생물 생육곡선의 측정은 전 배양액 2%를

질 개발의 기초단계로서 MRSA의 일종인 Staph，νfermenter(B.

내의 생산배지

liter에 접종하여

으며， 중층 검정평판의 조제는 배지 20m1 를

250 rpm, 3.5 liter

airjmin으로 7 일간 배양하

dish에 부어 응고시켜 하층을 만들고， 진 면서 1 일 간격으로 배양액을 10m1 씩

탕 또는 정치배양한 검정균을 동일배지에 접종하

comical

시험관에취하여

여 4~5m1 를 하층배지위에 중층으로 만들었고，

원심분리하여 pH의 변화， 균체량 및 항균활성을 단충 검정평판은 균을 접종한 배지 약 5m1 를 측정하여 생산최적 배양기간을 조사하였다. 단충으로 하여 평판을 조제하여 사용하였다. 항 균활성의 측정은 배양액 상등액을 이용하여

3.

항균활성 측정 penicillin의 공정 검정 법 에 준한

에 따라 행하였으며

24-48시간 배 4 일간의 본 배양이 끝난 배양액을

양하여 평판에 나타난 저지원의 직경을 측정하여

rpm, 15 min

원심분리하여 상둥액과 균체를 분 그 항균활성을 나타내었다.

리해내어 미생물에 대한

항균활성 검정 을 실시하였다.

그람양성균 4균주

않ap때1000떠1s

그람음성균 2균주

(Escherichia coli AB 1157, Pseudomonas jluorescens IAM 1201),

효모 2균주

곰팡이 6균주 (매비cu1aria

Trichoph，νton mentagroph，νtes

Trichoph，νton

niz，강a

9νrpsea

IAM 12722)

및 녹조류 2 균주

A2dl)를 검 정 균으로 사 용하여 항균활성 검정을 실시하였으며 B.

subtilis는

배 지

앉aph

2균주는

배지

co1i는

배지

jluores∞ns는

배지

녹조류인 Chlorella는

배지

그리고

종류의 효모 및 곰팡이류 는 모두

배 지 (27

C)를 사용하였다. 검정평판은 균의 종류에 따라 중충 검정평판과 단층 검정평판을 조제하여 사용하였

4.

항생물질의 분리 및 정제

50 liter jar fermenter (27 t , 200 rpm,

3.5 liter air

jmin) 에서

배지를 이용하여

일간 배양한

liter의 배양액을 원심분리

(3,000 rpm, 15

min) 하여 균체와 상층액을 분 리하였다. 상충액은

및 다양한 조건의

high performance liquid

chromatography를 실시하여 각각의 단계마다 않ap~νlococcus

TK-784를 검 정 균으로 하는 상자

cm) 를 만들어

method를 이용해서 항균활성을 검정하여 활성분획을 확인하였다.

1) Amberlite lRA-400 ion exchange column chromatography

Streptomνces

의

상층 액을

49.5cm) 에 흡착시켰다. 흡착후 증류수로 충분히 세척하고，

0.5N acetic

acid로써 0.5m1jmin씩 용출시켜

fraction

collector로 분획하였다.

2) Butanol extraction

Ion exchange column

chromatography에 서 활성을 나타낸 용출액을 모아

evaporator에서 증류수를 첨가하면서 치환해준 후

이 되 게 증류수를 첨 가하여 pH를 3.0으로 조절하고

로 3회에 나누어 추출하였다.

3) Cellulose partition column chroma- tography

추출 후 활성물질을 모아

에서 감압건조시킨 후 소량의 물로 포화된

butanol

혼합용매

acid-94.9:5:0.1) 에 녹여 cellulose가 충진된

column (01.8 x

92cm) 에 주입시킨 다음 동일한 butan이 혼합용매로 용출시 켜

로써 0.3m1jmin씩 분획하였다.

4) Sephadex LH-20 gel permeation column chromatography

Partition column

chromatography에 서 활 성을 나타낸 용출액을 모아

에서 감압건조시킨 후 소량의

methanol에 녹여

gel 이 충진된

92cm) 에 주입시킨 다음 동일한

methanol로 용출시 켜

collector로써 0.1m1jmin씩 분획 하였다.

5)

Hi양1 perform없lce

에서 분획한 활성물질을 감압하에서 완전히 건조 시킨 후 소량의 3 차 증류수에 녹인 후，

phase의

system을 다양화하여

controller)를 실행하였으 며，

HPLC 에서 설정된 조건을 이용하 여

HPLC를 실시 하여 순수한 활

성물질을 분취하였다.

(1)

제 1 차 조건

5%

acetonitrile의

230nm의

검출파장 및 5μM의 시 료주입량의 조건으로 HPLC를 실행하였다.

(2)

제 2 차 조건

70%

methanol의

230nm의

검출파장 및 10μM의 시 료주입량의 조건으로 HPLC를 실행하였다.

(3) 제 3차 조건

50%

methanol의

230nm의

검출파장 및 10μM의 시료주

입량의 조건으로 HPLC를 실행하였다.

(4)

제 4차 조건

35%

methanol의

230nm 의

검출파장 및 15μM의 시료주 입량의 조건으로 HPLC를 실행하였다.

(5) Preparative HPLC

35%

methanol의

230nm의

검출파장 및 50따의 시료주 입량의 조건으로

HPLC를 실행하여 순수 한 활성물질을 분취하였다.

5.

항생물질의 이화학적 성질조사

1) UV spectrum

측정

UV

spectrum은 시료농도를 mgjml 이 되도 록 methanol에 용해시켜

860) 를 사용하여

nm-200nm 에 서

하였다.

Table 1. Antimicrobial activity of Streptomyces sp. AMLK-135

Microorganisms Diameter of inhibition zone(mm) AMLK-135

Bacillus subtilis IAM 1069

Staphylococ띠s

Staph，νlococcus

Mνcobacterium

Pseudomonas jluorescence IAM 1201 Candida albicans IAM 4905

Cryptococcus neoformans ATCC 13690

매바cularia

ψmigatus

Trichophyton mentagrophytes ATCC 18749 Trichophyton rubrum ATCC 44766

Nannizzia otae IAM 12722 Chlorella regularis

Chlorella sp. A2dl

있 엉 잉

O

잉

R H O O O O O O

잉 M 강

2) IR spectrum

측정

IR

spectrum은 시료를 methanol에 녹인 후

free sample

methanol을 대조구로 이 용하여

m‘-IR)를 사용하여 측정하였다.

3) Me1ting point

측정

Me1ting

point측정은 비극성용매부터 극성용 매까지 단계별로 사용하여 때Jm1 의 시료농도로 각각의 용매에 대한 용해도를 측정하였다.

III.

실험결과 및 고찰

1.

생육곡선

py

배지에서

으로 배양하였을 때 배양시간에 따른

AMLK-135 의 생육 및 항생물질

생산성은

3 에서 보는 바와 같다. 균체의 증 식은 2~6 일째 최대치를 보였으며， pH는 4 일째 5.5까지 저하하다가 다시 상승하여

8.0까지 나타내었다.

한편， 항생물질의 활성은 배양 4 일째 (96시간) 에 최대치를 나타낸 후 급격히 저하되었다.

2.

항균활성

Streptomνces

AMLK-135 의 배양상층액 은

3 에서 보는바와 같이 진균에 대해서는 거의 활성을 갖지않는 반면 그람양성과 음성세균 및 녹조류에 대해서는 전반적으로 광범위한 항균 활성을 갖고있었다.

3.

항생물질의 분리 및 정제

Streptomνces

AMLK-135의 배 양액

(g) 잉흩그-(〕〉 :ωQ 성 P4Qm(i

5

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9

15

10

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7 5 6

3 4

Culture timddays)

Fig 1. Time course of Growth and antibiotics production by Streptomyces sp. AMLK-135

25

(EE)

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강생 ijiZ 를 }。 」잉성

80

o

70 50 60

40 20 30

10

Tube No.

Fig 2. Profile of cellulose partition column chromatography.

80 25

20

15

o

(EE)

일。

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써，。

Tube No.

Fig 3. Profile of Sephadex LH-20 gel permeation column chromatography

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Fig 4. HPLC chromatogram of antibiotic AM-l using 5% acetonitrile.

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Fig 5. HPLC chromatogram of antibiotic AM -1 using 70% methanol.

butanol (v

jv) 로 3 회 진탕 추출 감압농축시 킨 후

혼합

methanol 5:acetic acid

물로 치환하여 하였고 추출물은 용매

0.1) 에 소량으로 녹였다.

chroma- column

partition

liter를 원심분리

min) 하여 은 상충액 을

Sephadex LH-20 gel filtration column chromatography

및

chromatography의 순으로 정 제 과정 을 거 쳐 항 생물질 AM-l 을 얻었다.

어

℃二

1) Amberlite lRA-400 ion exchange column

4) Sephadex LH-20 gel filtration column chromatography

Cellulose column

chromatography에 서 활 활성분획을

LH-20 에 의해

chromatography

0.5 N acetic acid

용출결과 Staph，νlococcus

aureus

TK-784 에 대해

70-120 번까 지의 활성분획을 모아서 감압농축하면서

으로 조정하였다.

성을 나타낸 13-40 번까지의

methanol

에 녹여

gel

filtration을 실시 한 결과，

의 활성그룹을 얻어내었다

chromatography에 70-120번까지의 활성분획은

u m m e

낸 뺑 써빠

X

Pν

2) Butanol extraction Ion

서 활성을

3) Cellulose tography

추출물은

혼합용매 에 녹여

에 의 해 분배

chromatography를 실시

한 결과，

13-40의 활성그룹을 얻어내

었다

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Fig 6. HPLC chromatogram of antibiotic AM-l using 50% methanol.

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Fig 7. HPLC chromatogram of antibiotic AM-l using 35% methanol.

pεAK D e: T 드 CTION

4.000

~bs

2.0ee

흩= @‘률@빼

흩g ∞.@‘”

N

400 nm 300 350

250 0.0e0

20e

RT Fig 8. UV spectrum of antibiotic AM-1 in MeOH.

mobile

phase로 실험을 진행한 결과，

8 에 서 보는바와 같이

분대의 peak에 물질이 혼합되어 나타난 결과를 볼 수 있었다.

methanol의

실험결과는

9 에서 보는 바와같이

5)

Hi양1

에서 분획한 활성그룹

24~28) 을 감

압하에서 완전히 건조시킨 후 소량의 증류수에

녹여 HPLC를 실행하였다.

acetonitrile을

14.16분대의 peak와 다른 물질들이 혼합되어 을 조사하여 다음과 같은 최종 결과를 얻었다.

있어 목적물질 peak를 분리하기가 불가능하므로

phase의

양을 조절하였다.

50%

methanol의

실험결과는

10 에서 보는바와 같이

13.90분대의 peak와

17.83분대의 단일 peak를 분리하였

1.

메 치 실 린 내 성 균주 Staphνlococcus

TK-784를 억제하는 항생물질 생산균주

Strepto

mνces

AMLK-135는

배 지 를 이용하여 배양하였을 때， 배양 4 일째 항생물 고 각각의 peak를 분취하여

질 생산성이 가장 높았다.

에 대해 항균활성을 측정한 결과，

17.83분대

Streptomνces

AMLK-135의 배양상정액 의 peak가 목적물질임을 확인하였다. 각각의 은 진균에서 거의 활성을 가지지 않는 반면 peak들의 분리능을 높이기 위해

그람 양성과 음성세균 및 녹조류에 대해서는 methanol의

phase를 이용해서

전반적으로 광범위한 항균활성을 갖고 있었다.

를 실행한 결과

11 에서 보는 바와 같이

Streptomνces

AMLK-135로부터 생산되 22.09분대의 높은 분리능을 가진 단일

는 항 메치실린 내성균성 항생물질을

(AM-1) 를 분리하였으며， 그것의 이화학적 성질조

사를 위해 분취하였다 tography ，

4.

항생물질의 이화학적 성질

UV spectrum

측정 결과， 항생물질 AM-1 은

12 에 나타난 바와 같이 230nm 에서 최대흡 광도를 나타내었으며，

및 290nm 에서 각각

및 negative를 확인할 수 있 었다. 항생물질 AM-1 의

측정 결 과는 3500-3000cm-1 에서 hyro쩌r1 71 (-OH)

2520cm-

에서 amine 기 (N-H) 및 1451cm-

에서 더

등의 관능기를 가지고 있다고 추정 되었다.

IV.

결 ^료르

본 연구는 항메치실린 내성균성 항생물질의 분 리 및 정제를 위해 수행되었으며， 특히

TK-784 에 강한 항균활성을 가 지는 Streptomνces

AMLK-135를 생산균주 로 선정하여 이 균주가 생산하는 항메치실린 내 성균성 항생물질의 분리

정제 및 이화학적 성질

partition column chromatography, sepha- dex LH -20 gel permeation column chroma- tography

및 HPLC를 실시하여 분리

정제 한 결과， 항생물질 AM-1 이

의

phase를 이용한

분취실험 에서

22.09분대의 우수한 분리능을 가진 단일 peak로 분리 되 었다.

4.

항생물질 AM-1 의 이화학적 특성은

spectrum상 oily한 성상을 나타내고 있으며 MeOH 와

등의 극성용매에 용해도를 나타내 었다.

분석 결과， 항 메 치실린 내성균성 항생물질 AM-1 은 230nm 에 서 최대홉광도를 나타내었으며， 288nm및

nm에서 각각

및 negative를 확인할 수 있었다.

5. IR spectrum

분석결과， 항생물질 AM-1 은

-1 에서 hydroxy171 (-OH)

cm-1 에서 amine 기 (N-H) 및 1451cm-

에서 더

C-이등의 관능기를 가지고

있다고 추정되었다.

참고부힘

‘=-^L..:

1.

정 윤섭

내 성 Staph，ν10coccus aureus의 미생물학적 특성과 분리 현황. 제 1 회 국제병원 감염관리 섬포지움 발표논문집

2. Peacock J E, Marsik F J, Wenzel W P:

Methicillin-resistant

앉ap매10∞ccus

3.

홍석일， 권태후， 박창선: 서울대학교에서 분 리된 각종 병원균의 항생제 감수성 경향에 대한 겸색과 최근 4년간 분리 균주의 감수성 검사에 대한 통계적 고찰. 대한임상병리학회 지

4.

정윤섭， 유경주， 김현옥 Methici1lin 내성 않aph，ν1ococcus aureus의

tam 에 대한 감수성. 대한미생물학회지

391-6, 1988.

5.

이경원， 정윤섭， 권호현: 임상검체에서 분리 된 세균의 항생제 감수성. 대한화학요법학회 지

6.

김미나， 정재심， 김봉철: 원내감염과 원외감 염에서 분리된 원인균의 항균제 감수성 비 교. 감염

7. Yasuhiro M, Yuji W, Hiroshi S, Kazuo H, Kyoichiro K, Shuichi T and Yoshimi M Excellent activity of FK037, a novel parrental broad-spectrum cepalodporin, against methicillin-resistant

Staph，ν10c­

coccui. ^J Antibiot 46: 99 -119, 1993.

8. Kimiko U, Muneo H, Masuhiro Y, Katsuyuki N, Yasuo F, Keiko T, Masa- toshi K: In vitro activity of WC10627 a new cabapenem antibiotics with high stability to dehydro peptidase. Antimicrob

Agents Chemother 34: 794-1000, 1990.

9. Harold C, Andrea N: In vitri activty and

더 -lact없nase

10. Atsushi T, Ryoichi 0, Takashi Y, Horuo Y, Shichi K: In vitro and in vivo antibacterial activites of MEI1207 a new

or외

1988.

11. Matsuo K, Uete T: Clinical

laborotoη

aproch to evalute administration does of arbekasin.

φn

1052, 1994.

12. Simpson W J, Hammond J R M, Miller R B: Avoparch and vancomycin useful antibiotics for the isolation of

breweη

lactic acid. Bacteria J App1 Bacterio1 64: 299 -309, 1988.

13. Ishii T, Takayama Y, Takase Y, Orikasa Y: Antibacteriological activites of arbekacin and vancomycin against Strain of Methicillin-resistant

Stap매loc­

coccus aureus.

φn

14. Yamaguchi S, Sibata M, Takeo H: In vetro combined effect of c1indamycin and imipenem against of Methicillin- resistant

Staphνlococcus

15. Ubkata k, N Yamashita and M Konno Occurence of ß -lactam inducible Pen- icillin-binding protein in Methici1lin- restistant

Stap매10cocαi.