TNF-α αProduction of Nuclear Factor-α αB

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※ 통신저자: 김 영 율

대전광역시 중구 대흥동 520-2 가톨릭대학교 대전성모병원 정형외과

TEL: 042) 220-9530 FAX: 042) 221-0429 E-mail: [email protected] 접수일: 2010년 10월 1일, 게재확정일: 12월 2일

요추 추간판 세포에서 TNF-α 에 의해 자극된 Nuclear Factor-κ B의 생성과 Glucocorticoid 의 염증세포 억제의 기전

가톨릭대학교 의과대학 인천성모병원 정형외과¹⁾, 대전성모병원 정형외과²⁾

오인수¹⁾・박상은²⁾・손종민¹⁾・정준영²⁾・김영율²⁾

= Abstract =

Glucocorticoid Mechanism of Inhibition of the Inflammatory Cells in Lumbar Intervertebral Disc Cells Stimulated by

TNF-α αProduction of Nuclear Factor-α αB

In-Soo Oh, M.D.¹⁾, Sang-Eun Park, M.D.²⁾, Jong-Min Son, M.D.¹⁾, Jun-Young Chung, M.D.²⁾, Young-Yul Kim, M.D.²⁾

Department of Orthopedic surgery, Incheon St. Mary’s hospital¹⁾, Daejeon St. Mary’s hospital²⁾, College of Medicine, the Catholic University of Korea, Seoul, Korea

Purpose:To analyze the action mechanism of NF-κB, IκB-αand effect of the Dexamethasone (DEXA) in mediating this inflammation, after stimulating cultured herniated intervertebral disc cells with TNF-α.

Materials and Methods:After cultured human intervertebral disc cells passaged three times, they were divided into four groups: A control group (A), DEXA treatment group (B), TNF-αtreated group (C), TNF-α and DEXA were treated at the same time (D). IL-6 and IL-1βgene expression were measured with semi-quanti- tative RT-PCR. Western blot analysis was performed to measure protein expression of IκB-α in the above groups for 10 minutes, 1 hour, 2 hours. In addition, in order to explain the mechanism of NF-κB nuclear binding for each group, the nuclear amount of NF-κB binding in the nucleus is measured by EMSA .

Results:In RT-PCR, expression of IL-6 and IL-1βwas greatest in group C, followed by group D, group A.

IκB-αexpression of the group treated with DEXA was not detected in Western blot results within 10 minutes.

However, if stimulated by TNF-α, the DEXA was not inhibited of IκB-αconcentration. After 1 hour and 2 hours, IκB-αlevels were expressed by cells autonomously (autoregulatory induction). EMSA results expression levels in nuclear protein was maintained in accordance with protein expression.

Conclusions:Our study shows that DEXA inhibits the production of mediators such as inflammatory IL-6 and IL-1β, however, may not inhibit the transcription of NF-κB stimulated by TNF-α.

Key Words:Disc cell, NF-κB, IκB-α, IL-6, IL-1β, RT-PCR

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서 론

인간의 추간판은 관절 연골과 같은 제 2형 콜라 겐이 주성분을 이루고 있으며, 퇴행성 변화가 진 행되면서 섬유륜의 균열이 발생하고, 이후 수핵의 탈출이 진행되면서 기계적 압박으로 신경근이 눌 려 신경증상이 야기되는 것으로 알려져 있다. 그 러나 이러한 기계적인 압박의 원인 이외에도 수핵 에서 분비되는 여러 염증성 인자들에 의한 화학적 반응 또한 이러한 신경증상에 큰 역할을 하는 것 으로 알려져 있으며, 이중 추간판 수핵의 염증성 인자 유도와 동통 양측에 Pro-inflammatory cytokine인 TNF-α에 의해 자극된 추간판 세포 의 역할이 큰 것으로 생각되고 있다^5,14,15). 이는 실 제로 임상에서 기계적 압박이 심한 상태의 추간판 탈출증에 대해 전신적 혹은 국소적인 스테로이드 를 사용하는 배경이 되고 있다. 또한 추간판 내장 증의 경우에서도 염증을 억제하기 위하여 Dex- amethasone을 추간판 내로 주입하는 치료도 시 행되고 있다¹²⁾.

TNF-α는 IL-6, IL-1β등의 물질을 매개하여 추간판 세포의 염증 반응에 관여하며, 환경적 신 호에 의하여 활성도를 조절할 수 있고, 유전자의 특정 부위에 결합하여 유전자의 전사율(trascrip- tion rate)을 변화시킬 수 있어 전사 인자에 미치 는 영향이 있을 것으로 판단되며 면역 및 염증 반 응에 있어서 전사인자 중 하나인 NF-κB가 특별 한 의미를 갖는다^3-5,8).

이에 본 저자들은 추간판 탈출증에서 탈출된 수 핵을 체취하여 이를 추간판 세포 배양을 시행하여 염증 반응에서 염증의 매개 물질인 TNF-α를 자 극 후, IL-6, IL-1β, 및 NF-κB의 억제 작용을 하는 IκB-α의 작용 기전과 스테로이드인 DEXA 가 이에 미치는 영향에 대하여 분석하여 이러한 기전이 관절 연골에서의 기전과 같은지를 분석하 려 한다.

연구 대상 및 방법 1. 검체 수집 및 보관

2010년 3월부터 2010년 10월까지 본원에서 추

간판 탈출증의 수술적 치료로 얻어진 검체중 수핵 5례를 대상으로 하였다. 수술 2개월 전 스테로이 드를 경구 또는 다른 용법으로 사용한 환자는 스 테로이드의 영향을 배재하기 위해서 본 대상에서 제외시켰다. 수술 중 얻어진 검체는 RNA의 파괴 를 막기 위해 신속하게 질소 냉동 용기에 넣어 - 80℃의 냉장고에 보관하였다.

2. 실험 방법

1) 추간판 세포 배양

추간판 세포를 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지에 심고, 37℃ 의 인큐베이터에 서 4mg/ml collagenase(Type; Sigma, ST.

Louis, MO)로 24시간 처리하여 세포를 분리해 내었다. 효소 분해 후에, 부유액은 70 ㎛ mesh 에 여과하여 걸러진 세포들을 DMEM media로 세척한 후 첫 번째 세포 배양을 시작하였다. 대략 150,000의 세포가 각 수핵에서 추출되었다. 분리 된 세포들은 DMEM에 10% fetal bovine serum(Gibco, Grand Island, NY, USA) 100 U/mL penicillin과 100 U/mL strepto- mycin을 섞어 5%의 CO2에 37℃온도에서 배양 하였다. 세포는 3번의 계대배양 하였다. 이중 일 부는 Human recombinant tumor necrosis factor-α (TNF-α; R&D systems, Inc.)와 Dexamethasone (DEX; Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하였다.

2) Determination of IL-6 and IL-1β gene expression by RT-PCR.

IL-6와 IL-1β의 mRNA 양을 정성적으로 분석 하기 위하여 Reverse transcription poly- merase chain reaction (RT-PCR)을 사용하였 고, 대조군 변경으로 β-actin primer를 이용하였 다. β-actin을 이용한 대조군 변경은 PCR 생성 물의 포화를 피하기 위해 RT-PCR을 25회 시행 하였다. 배양한 24 well plate 용기에 배양액을 제거한 후 1 ml TriZole^Ⓡ (Invitrogen^™, Life technologies Co., Groningen, Netherlands) 을 넣어 5분 동안 인큐베이션한 후 1.5 ml의 튜

오인수 등・요추 추간판 세포에서 TNF-α에 의해 자극된 Nuclear factor-κB의 생성과 Glucocorticoid 의 염증세포 억제의 기전

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브에 넣고 Chloroform (Sigma-Aldrich Co.) 을 넣어 4℃, 12,000 g에서 15분 동안 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 1.5 mL 튜브에 넣고 Isoprofanol (Sigma-Aldrich Co.)을 넣어 원심 분리한 후 RNA를 침전시켜, RNeasy Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 12시간 동안 DEXA와 TNF-α로 처리한 세포의 RNA양 을 측정하였다. AccuPower RTPReMix kit (BIONEER Int., Great Seneca Highway Rockville)를 이용하여 total RNA의 2 micro- gram은 역전사를 위한 complementary deoxyribonucleic acid (cDNA)를 합성하는데 사용하였다. 분리된 RNA를 5X first strand buffer (Invitrogen^™), dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP, GIBCO BRL. Co.), RNase 인히비터(Invitrogen^™), SuperScript^™

Ⅱ RNase H- 역전사 트랜스크립테이즈(Invit- rogen^™), 올리고 dT12-18 Primer (Invitrogen

™), DNAse, RNAse free 증류수(GIBCO BRL Co.)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

cDNA 반응은 전체 1사이클로 각각 역전사를 42

℃에서 15분, 변성은 99℃에서 5분 그리고 냉각 을 5℃에서 5분하였다. 이렇게 역전사 시킨 cDNA를 프라이머(GenoTech., Dajeon, Korea)를 사용하여 PCR을 하였다. 50μl 의 반 응 용량은 각각 20 pmole 의 정방향(forward) 과 역방향(reverse) primer를 함유하고 있으며, 이는 denaturation(95℃에서 30초간), anneal- ing (60℃에서 30초간), elongation (72℃에서 45초간)를 30 cycle을 시행하여 증폭하였다. 각 각의 PCR 후 증폭된 DNA를 PCR product당 10 μL ethidium bromide가 들어있는 1%

agarose (Sigma-Aldrich Co.)로 굳힌 겔에 얻 은 후 110 V에서 15분 동안 전기영동을 하였다.

DNA를 전개시킨 겔은 자외선 투과조사기(Spec- troline^Ⓡ, Spectronics Co., Lincolin, NY)위 에 위치시켜 digital camera로 UV illumina- tion하에 사진을 촬영하여 scanning 하였다(Bio 1D Version 99, Vilber Lourmat, France).

3) Western Blotting for IκB-α

항체는 IκB-α(Santa Cruz Biochnology,

Santacruz, CA)와 Anti β-actin (Sigma, St.

Louis, MO)을 사용하였다. 같은 양의 추간판 수 핵 세포(5×10⁵ cells per 100 mm culture dish)를 각각 아무 처리도 하지 않은 군과 DEX (1μM)를 2시간 처리한 군, TNF-α만 처리한 군 및 DEX와 TNF-α(10 ng/ml)로 자극한 군에 대 하여 10분, 1시간, 2시간 배양하였다. 배양세포 는 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척 후 RIPA-B buffer(0.5% Nonidet P-40, 20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 100 M Na3VO4, 1 mM dithiothre- itol, 50 μg/ml phenylmethysulfonyl fluo- ride)로 냉동 상태에서 30분간 용해시켰다. 용해 되지 않은 물질들은 4℃에서 20분간 12,000 rpm의 centrifigation으로 제거하였고, SDS- PAGE의 supernatant를 사용한 후 Western blot 분석을 시행하였다.

4) EMSA for intra-nucleus NF-κB

TNF-a에 의하여 자극된 추간판 세포가 각종 염증 매개체를 만들 경우, 그 신호전달의 기전이 세포질 내의 전사인자인 NFκB가 관여하는지를 보고자 EMSA를 시행하였다. Control 혹은 TNF-α를 처리한 세포를 수집한 후, 세포의 양과 동량의 buffer A(10 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 1 μ g/ml leupeptin, aprotinin, pH 7.9)에 녹인 다음, 10분간 얼음에 방치하였다. 27게이지 바늘 을 사용하여 세포를 용해시킨 후, buffer A로 씻어주었다. Buffer B(20 mM Hepes, 420 mM KCl, 1.5 mM M g Cl 2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 μ g/ml leupeptin, aprotinin, pH 7.9)를 첨가 하여 핵단백질을 정제하였다. 정제된 핵단백질에 buffer C(20 mM Hepes, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT,0.5 mM PMSF, 1 μg/ml leupeptin, aprotinin, pH 7 . 9 )를 첨가한 후, 14,000×g에서 4℃, 15분간 원심분리하였다. 핵 단백질은 분주하여 -8 0℃에 보관하였고, Brad- ford 방법으로 단백질을 정량하였다. EMSA는 Xu등의 방법에 따라 먼저 NFκ-B consensus oligonucleotide (5’-agttgaggggactttcccaggc-

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3’)에 [γ-3 2P ] d A T P를 표지하였다. 2 μg poly(dI-dC), 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 20 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5%

glycerol 그리고 0.0175 pmol 32P로 표지된 DNA probe를 포함한 EMSA 반응액에 핵단백 질을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 4% 폴리아크릴아마이드 겔에서 180 V 에서 2시 간 동안 전기영동하였다. 겔을 말린 후, 자가방사 법으로 밴드의 이동을 확인하였다. NFκB의 특정 띄를 확인 하기 위해, [γ-32P] dATP를 표지하 지 않은 NFκ-B consensus oligonucleotide와 AP-1 consensus oligonucleotide (5’-cgct- tgatgagtcagccggaa-’3)를 사용하여 competi- tion assay를 하였고, 토끼 항 사람 NF-κB p65 항체(Santa Cruz)와 토끼 항 사람 NF-κB p50 항체(Santa Cruz)를 사용하여 supershift assay를 하였다.

결 과 1. RT-PCR

DEXA의 세포질에서의 물질 생산과 유전자 표 현에 대하여 알아보기 위해서 본 연구에서는 아무 처리도 하지 않은 군을 control(A)군으로, DEXA(1 μM)만 처리한 군(B)과 TNF-α만 처리 한 군(C), DEXA와 TNF-α모두 처리한 군(D) 으로 나누어 각각에 12 시간 배양 후 IL-6와 IL- 1β에 대한 유전자 표현의 정도를 semi-quanti- tative RT-PCR을 이용해 분석하였다. 실험 결 과 C, D, A, B의 순서로 IL-6가 발현되었는데, IL-는 TNF-α의 자극이 가해진 상황에서 더 많이 발현했으며 이로써 배양된 추간판 세포에서 TNF-α의 자극이 IL-6의 증가와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다. IL-1β는 DEXA를 처리한 B, D군에서 발현이 저하되었는데, IL-1β의 발현 이 TNF-α의 자극여부와 관계없이 DEXA에 의 해 억제되는 것으로 보아 IL-1β에 의한 추간판 세 포의 염증반응은 DEXA에 의해 억제될 수 있음 을 보여주는 것이다(Fig. 1). 또한 TNF-α를 처 리한 군에서 IL-1β의 발현이 오히려 줄어든 것은 TNF-α의 자극이 IL-1β의 발현보다는 다른 기전

을 통해서 일어나는 것으로 판단되었다.

2. IκB-α의 Western blotting

세포에서 NF-κB 활성을 억제하는 IκB-α의 활 성도를 Western blot을 이용하여 조사하였다.

control 군(A)과 DEXA (1μM)를 처리한 군 (B), TNF-α만 처리한 군(C) 및 DEXA와 TNF-α (10 ng/ml)로 자극한 군(D)에 대하여 10분, 1시간, 2시간 배양한 결과 10분간 처리한 경우 B군에서 IκB-α는 발현량이 줄어들었고, C군 에서는 발현을 보였으나 D군에서는 발현의 변화 를 보이지 않았다. 이후 1시간, 2시간 의 IκB-α의 농도는 C군에서는 큰 변화는 없었으며, 오히려 B 군에서 IκB-α의 양이 증가했다. 이는 DEXA가 지속적인 영향을 주는것이 아니라 반응이 일어나 는 그 순간에 영향을 주고 시간이 지나면 효과가 떨어지는데 지속적으로 반응을 억제할 신호가 없 기 때문에 반응이 오히려 역으로 일어나는 것으로 생각되었다. D군에서는 10분에서의 반응보다 Iκ B-α가 감소했으며, 이는 TNF-α의 지속적인 염증 반응에 대해 DEXA가 반응하여 나타난 결과인 것으로 사료되었다. 2시간 처리시의 변화는 C군 의 1시간 후의 변화와 유사하였으며, B군 또한 1 시간 반응보다 양이 줄어들었다. D군에서 IκB-α

Fig. 1.RT-PCR amplification of IL-6 and IL-1βin Nucleus pulposus Cell. The densitometric band intensity of PCR products was depicted after nor- malization by B-actin.

462bp

565bp

300bp IL-1β

β-actin

untreat TNF-a(10 ng/ml) Dexamethasone+TNF-αDexamethasone (1 um)

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가 사라진 것으로 보아 서로 상호작용으로 DEXA의 효과가 지속적으로 이루어진 것으로 생 각되었다(Fig. 2). 단지 단백질의 차이가 TNF-α 를 처리한 군에서도 확연하게 증가하지 않은 것은 TNF-α의 자극은 초기 10분, 1시간, 2시간의 시 간을 초과하여 반응하는 것으로 사료되었으며, 이 는 추가적인 시간의 연장을 통하여 단백질의 발현 정도가 확연히 나타나는 시간에 대한 접근이 필요 할 것으로 사료되었다.

3. EMSA 를 통한 세포질 내부의 반응

EMSA 를 통하여 전사인자의 DNA 결합 정도 를 나타낸 실험에서 10분 처리시 B군에서 NF- kB가 발현되지 않았고 C군에서 NF-κB가 나타났 으며 D군에서도 NF-κB가 존재하였다. 1시간 처 리 시 B군에서 NF-κB가 발현되지 않았고 C군에 서 약간 NF-κB가 정량적으로 감소하였으며, D 군에서는 10분 처리시와 같은 경향으로 나타났 다. 2시간 후의 반응에서는 B군에서 NF-κB가 발현되지 않았고, C군에서 NF-κB가 나타났으며 D군에서 지속적인 DEXA와 TNF-α로 오히려 NF-κB가 줄어든 효과가 나타난 것으로 보이며 이는 western blot 결과와 차이를 보였는데, western blot에서는 초기에 TNF-α를 처리한 군 에서는 단백 변화가 미비하였으나, EMSA에서는 DNA결합정도는 TNF-α의 자극이 있는 군에서 모두 높은 발현을 보였으며, 이러한 결과를 보인 것은 NF-κB의 결합 정도가 다른 기전에 대한 추 가적인 실험이 필요할 것으로 사료되었다.

DEXA만 처리한 군에서는 NF-κB가 발현되지 않았으며, TNF-α자극 후 DEXA를 처리한 군에 서는 NF-κB가 발현되었다. 이는 DEXA가 NF- κB의 핵내 이동은 저지하지 못하며, 단지 염색체

전좌와 전사의 방해인자로만 작용함을 간접적으로 알 수 있었다(Fig. 3).

고 찰

요추부의 추간판 탈출증은 현재 가장 빈번하는 질환중의 하나이나, 그러나 현재까지도 추간판이 탈출 되었을때 이에 대한 통증 및 염증에 대한 정 확한 정립이 이루어지지 않은 상태이다. 과거 기 계적 압박이 추간판 탈출에 의한 하지 방사통의 원인으로만 생각되던 것에서 현재 탈출된 추간판 세포가 주위 신경세포의 염증 반응을 유발하여 이 로 인한 하지 방사통이 원인이라는 가정 하에 많 은 실험들이 다양한 각도에서 진행되어왔다^5,15,16). 축삭과 수초에 대한 직접적 영향이나 염증 반응, 혹은 면역 반응에 의한 영향, 혈관에 대한 영향등 이 제시되면서 이에 대한 많은 실험들이 진행되어 왔고, 기계적 압박 또한 동물 실험에서 영향을 미 치는 것으로 알려졌다^6,9). 임상적으로 추간판 탈출 증의 치료 방법의 하나로 추간공내 스테로이드 주 입으로 요추부 동통 및 하지 방사통을 감소시키는 Fig. 2. Western blot of Nucleus pulposus Cell.

10 min DEXA

TNF-α IκB-α

A B C D B C D B C D

1 hr 2 hrs

Fig. 3. Reactions within the cytoplasm through EMSA.

TNF- increased the nuclear translocation of NF- κB, and DEXA suppressed the nuclear translocation of NF-κB.

TNF-α

NF-κB

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방법이 있으나, 이에 대한 정확한 기전은 아직 밝 혀진 바가 없고, 임상적으로 또는 경험적으로 이 에 대한 치료를 시행하고 있는 것이 현실이다. 이 에 대한 이론적 배경으로 제시된 것은 McLain 등¹²⁾은 기계적 압박과 함께, 후관절(facet joint), 후방종인대(Posterior longitudinal ligament), 추간판등의 다양한 곳에서 여러 염증 인자를 내어 이들이 신경 세포에 자극을 주어 방사통이 일어난 다고 하였으며 이중 추간판 내의 퇴행성 염증 세 포에 관해 TNF-α와 IL-1의 역할을 강조했으며, MMP의 역할에 대하여 언급하였다^11,12). 이 중 현 재 염증반응을 매개하는 기전에 대한 연구가 다양 한 각도에서 이루어지고 있는데, 염증 전구 세포 질 분해 효소(proimflammatory cytokines) 중 에서 TNF-α나 IL-6, IL-1β등은 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 또한 국소적 환경하 에서 탈출된 수핵은 신경 가지 주위에 다양한 변 화를 일으키는 것으로 알려져 있다^6,16).

TNF-α는 근본적으로 항종양 억제 역할을 하는 특성을 지닌 성장 중개물로 이는 면역 조절기능 이외에 염증 반응에 관여한다. IL-1은 prototyp- ic multifunctional cytokine이다. 이는 IL-1α, IL-1β, IL-1Ra의 3가지의 군(family)을 가지고 있다. IL-1은 거의 모든 세포의 형태에 관여를 하 며, 종종 다른 세포분비물이나 small mediator molecule에 관여하며, 이는 또한 임상적으로 골 수의 회복과 암치료에 있어서도 IL-1이 쓰일 정 도로 다양한 기능을 가지고 있다. 이는 실험상에 서 TNF-α에 의한 자극은 염증전구세포질 분해 효소들의 국소적 환경과 동일한 것으로 알려져 있 으며, 추후의 연구에서는 TNF-α는 추간판 세포 에서 유리되며, 이 TNF-α를 억제하는 것이 수핵 의 탈출에 의한 신경다발의 기능 회복에 도움이 된다는 견해가 있다^10,13,18). 또한 현재 TNF-α억 제제에 대한 임상적 연구도 시행되고 있으며, 실 제로 임상에 사용하여 우수한 결과를 보고하기도 하고 있다¹³⁾. Nuclear factor-kappa B(NF-κ B)는 염증성 반응과 면역 반응시 유전자 조절단 계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으 며, NF-κB는 이방형(dimeric complex)를 형성 하고 있고 이는 세포질(cytosol)내에서는 IκB라는 억제 단백과 결합하여 비활성화 상태로 존재하는

것으로 알려져 있다. IκB는 IκB-α,IκB-β, IκB-ε 까지 여러 가지의 아형이 알려져 있다^17,19). NF-κ B는 자극이 없는 상태에서는 세포질 내에 억제 인자인 IκB단백질과 결합하여 복합체의 형태로 존재하나, 세포질 분해효소, 바이러스, 산화제 등 의 자극에 의해 IκB가 인산화(phosphorylation) 작용을 통해 분해되면 NF-κB-IκB복합체가 해리 되고, NF-κB가 활성화 되면서 핵내로 이동하여 염증성 유전자의 발현을 증가시키게 된다^17,19). 본 실험에서는 추간판의 퇴행성 변화를 관절의 연골 세포의 퇴행성 변화와 같은 맥락으로 전제하고 이 실험을 진행하게 되었다.

본 실험에서 IL-6는 TNF-α의 자극에 대하여 증가하며, DEXA에 의해 억제되나 초기 TNF-α 의 자극이 안 가해진 농도까지는 억제는 일어나지 않았으며, IL-1b는 DEX의 투여에 의해 모두 발 현이 감소되어 DEX는 IL-1b에 의한 억제 효과 는 큰 것으로 생각되었다. 또한 본 실험에서 단백 질 정량을 위해 시행된 Western blotting결과상 에서 IκBα의 발현이 초기 10분에서 DEXA를 사 용한 군에서는 억제되었고, 이미 TNF-α에 의해 자극된 추간판 세포에서는 그 억제효과가 나타나 지 않은것으로 보아 TNF-α에 의해 초기에 자극 되어진 추간판 세포 경우 DEXA의 억제 작용은 적은 것으로 판단되었다.

Zabel과 Baeuerle²⁰⁾는 NF-κB를 억제하는 인 자인 IκBα유전자에 대해 처음 기술한 이후, 구조 나 억제 작용 기전에 대한 여러 연구 결과가 발표 되고 있다. IκBα는 자신의 promotor region에 κ B를 인식하는 배열을 가지고 있어 NF-κB에 의 해 IκBα의 합성이 유도되고 합성된 IκBα는 활성 화된 NF-κB를 결합함으로써 염증에 관여하는 유 전자 발현의 활성화를 종결한다. 이는 초기 탈출 된 추간판 세포에 TNF-α가 포함되어 있으나 이 를 많은 양으로 자극할 경우 DEXA에 의한 억제 의 효과도 감소하는 것으로 판단할 수 있었다. 또 한 IκBα에 의한 NF-κB의 억제 작용은 추간판 세 포에서의 염증 반응에 초기 영향 이외에는 특정한 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

본 실험의 제한적인 요소는 탈출된 추간판 세포 를 가능한한 빨리 -80℃의 냉각으로 보존하였으 나 역시 in vitro의 실험으로 이것이 일반적인 in

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vitro상의 내용과 일치한다고는 할 수 없다. 그러 나 이러한 면역 반응의 중요 물질인 NF-κB의 발 현이 탈출된 추간판에서 발현이 될 것으로 예상할 경우 IκB-α의 발현이 스테로이드 약물에 의해 억 제 기전이 초기 10분에서만 가능하였다는 것은 다른 기전을 통하여 스테로이드가 주위 세포의 염 증 반응을 제거함을 간접적으로 알 수 있었다. 본 실험에서는 IκB-α 유전자의 발현을 Western blotting을 통하여 알아보았으나 결과에서와 같이 스테로이드는 초기 10분에서만 IκB-α를 억제시키 는 작용을 하였을 뿐 이후 1시간, 2시간 이후에서 는 다시 IκB-α를 발현시키는 것을 알수 있었다.

이는 세포질 외의 NF-κB의 autoregulation 작 용으로 인한 IκB-α의 발현으로 생각되며, 이에 대하여는 EMSA와 같은 다른 실험 방법을 통하 여 추가적으로 이에 대해 규명해야 할 것으로 사 료된다.

결 론

DEXA는 염증성 IL-6와 IL-1β와 같은 매개물 질의 생산을 억제하나, TNF-α에 의해 자극된 NF-κB의 핵내 이동을 억제하지는 못하는 것으로 사료되며, IkB-α의 발현에 있어서 초기 자극에서 는 억제를 보이나 자가인산화에 의해 그 기능은 소실이 되어 장기적인 단백질의 발현을 억제하지 는 못하는 것으로 사료되었다. 이로써 DEXA는 추간판 세포 자체의 억제기전을 통하기보다 그 주 위의 염증성 인자 동원에 작용을 하여 임상적인 증상 호전을 보이는 것으로 사료된다.

REFERENCES

1) Arend WP, Dayer JM: Inhibition of the produc- tion and effects of interleukin-1 and tumor necrosis factor α in rheumatoid arthritis. Arthritis- Rheum. 38:151-60, 1995.

2) Arenzana SF, Thompson J, Rodriguez MS, Bachelerie F, Thomas D, Hay RT: Inducible nuclear expression of newly synthesized IκBα negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities of NF-κB. Mol Cell Biol, 15:

2689-96, 1995.

3) Arenzana-Seisdedos F, Thompson J, Rodriguez MS, Bachelerie F, Thomas D, Hay RT:Inducible nuclear expression of newly synthesized I kappa B alpha negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities of NF-kappa B. Mol Cell Biol. 15:2689-96, 1995.

4) Beg AA, Baldwin AS Jr: Activation of multiple NF-kappa B/Rel DNA-binding complexes by tumor necrosis factor. Oncogene. 9:1487-92, 1994.

5) Cavanaugh JM: Neural mechanisms of lumbar pain. Spine. 20:1804-9, 1995.

6) Creange A, Barlovatz-Meimon G, Gherardi RK: Cytokines and peripheral nerve disorders.

Eur Cytokine Netw. 8:145-51, 1997.

7) Eaeuerle RA, Baltimore D: NF-κB: ten years after. Cell. 87:13-20, 1996.

8) Grimm S, Baeuerle PA: The inducible transcrip- tion factor NF-kappa B: structure-function rela- tionship of its protein subunits. Biochem J.

290:297-308, 1993.

9) Hartung HP, Jung S, Stoll G, Zielasek J, Schmidt B, Archelos JJ, Toyka KV:Inflamma- tory mediators in demyelinating disorders of the CNS and PNS. J Neuroimmunol. 40:197-210, 1992.

10) Jee BK, Surendran S, Park KM et al.: Role of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-8, and dexamethasone in the focal adhesion kinase expression by human nucleus pulposus cells.

Spine. 32:30-5, 2007.

11) MacNaul KL, Chartrain N, Lark M, Tocci MJ, Hutchinson NI:Discoordinate expression of stromelysin, collagease, and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in rheumatoid human syn- ovial fibroblast. Synergistic effects of interleukin-a and tumor necrosis factor-alpha on stromelysin expression. J Biol Chem. 265:

17238-45, 1990.

12) McLain RF, Kapural L, Mekhail NA: Epidural steroid therapy for back and leg pain: mecha-

(8)

nisms of action and efficacy. Spine J. 5:191-201, 2005.

13) Murata Y, Onda A, Rydevik B, Takahashi K, Olmarker K:Distribution and appearance of tumor necrosis factor-alpha in the dorsal root ganglion exposed to experimental disc herniation in rats. Spine. 29:2235-41, 2004.

14) Olmarker K, Larsson K: Tumor necrosis factor alpha and nucleus-pulposus-induced nerve root injury. Spine. 23:2538-44, 1998.

15) Olmarker K, Storkson R, Berge OG: Pathogen- esis of sciatic pain: a study of spontaneous behavior in rats exposed to experimental disc herniation. Spine. 27:112-7, 2002.

16) Onda A, Yabuki S, Iwabuchi M, Anzai H, Olmarker K, Kikuchi S:Lumbar sympathecto- my increases blood flow in a dog model of chronic cauda equina compression. J Spinal Dis- ord Tech. 17:522-5, 2004.

17) Thompson JE, Phillips RJ, Erdjument-Bro- mage H, Tempst P, Ghosh S:I kappa B-beta regulates the persistent response in a biphasic activation of NF-kappa B. Cell. 80:573-582, 1995.

18) Weiler C, Nerlich AG, Bachmeier BE, Boos N:

Expression and distribution of tumor necrosis factor alpha in human lumbar intervertebral discs: a study in surgical specimen and autopsy controls. Spine. 30:44-53, 2005.

19) Whiteside ST, Epinat JC, Rice NR, Israel A: I kappa B epsilon, a novel member of the I kappa B family, controls RelA and cRel NF-kappa B activity. EMBO J. 16:1413-26, 1997.

20) Zabel U, Henkel T, Silva MS, Baeuerle PA:

Nuclear uptake control of NF-kappa B by MAD- 3, an I kappa B protein present in the nucleus.

EMBO J. 12:201-11, 1993.