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(1)

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(2)

2017年 2月碩士學位論文

신규 저가배지를 이용한 Chaetoceros 속 3종 미세조류의 최적 배양 및 상업적 이용

朝鮮大學校大學院

신재생에너지융합학과

金汶鍾

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신규 저가배지를 이용한 Chaetoceros 속 3종 미세조류의 최적 배양 및 상업적 이용

Optimum cultivation of three species of genus Chaetoceros using a novel low-cost culture medium and its industrial applications

2017 年 2月 24日

朝鮮大學校大學院

신재생에너지융합학과

金汶鍾

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신규 저가배지를 이용한 Chaetoceros 속 3종 미세조류의 최적 배양 및 상업적 이용

지 도 교 수 김 시 욱

이 논문을 공학석사학위 신청 논문으로 제출함

2016 年 10月

朝鮮大學校大學院

신재생에너지융합학과

金汶鍾

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金汶鍾의 工學碩士學位論文을 認准함

위원장 조선대학교 교수 이 성 행 (인) 위 원 조선대학교 교수 이 현 화 (인) 위 원 조선대학교 교수 김 시 욱 (인)

2016年 11月

朝鮮大學校大學院

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LIST OF TABLES

Table 1. 세대별 바이오매스의 경쟁력 분석 ··· 7

Table 2. f/2 배지의 조성 ···15

Table 3. Gas chromatography 분석조건 ···21

Table 4. 갯벌 추출액과 음식 추출액 성분조사 ··· 32

Table 5. 갯벌 추출액의 미량원소 성분조사 ···32

Table 6. Chaetoceros 지방산 조성비율 ···45

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LIST OF FIGURES

Fig. 1. Chaetoceros 종의 관찰 : (a) Chaetoceros sp.; (b) C. fragilis; (C) C.

gracilis ··· 14

Fig. 2. Triglyceride의 에스테르 교환반응···23

Fig. 3. 관형 광생물반응기 모식도···24

Fig. 4. 빛의 세기에 따른 Chaetoceros 생체량. :(a)Chaetoceoros sp.; (b)C.

fragilis; (C)C.gracilis ···26

Fig. 5. 질소 농도에 따른 Chaetoceros 생체량. :(a)Chaetoceoros sp.; (b)C.

fragilis; (C)C.gracilis ···28

Fig. 6. 인 농도에 따른 Chaetoceros 생체량. :(a)Chaetoceoros sp.; (b)C. fragilis; (C)C.gracilis ···30

Fig. 7. 갯벌 추출액 혼합비에 따른 Chaetoceros의 생체량. :(a)Chaetoceoros sp.; (b)C.fragilis; (C)C.gracilis ··· 34

Fig. 8. 최적 갯벌 추출액 혼합 배지에서의 Chaetoceros 속의 lipid 함량 및 생산량 비교···35

Fig. 9. 음식 추출액 혼합비에 따른 Chaetoceros의 생체량. :(a)Chaetoceoros sp.; (b)C.fragilis; (C)C.gracilis···37

Fig 10. 최적 음식 추출액 혼합 배지에서의 Chaetoceros 속의 lipid 함량 및 생산성 비교···38

(10)

Fig 11. 최적 음식 폐기물 추출액 혼합 배지에서의 Chaetoceros 속의 biomass 생산량 조사···40

Fig 12. 최적 음식 폐기물 추출액 혼합 배지에서의 Chaetoceros 속의 total lipid 함량 및 생산량 비교··· 41

Fig 13. 파쇄방법에 따른 총 지질 함량···43

Fig 14. 에스테르교환 반응 시 촉매에 따른 FAME의량 조사··· 47

Fig 15. H2SO4 조건별 최적화 FAME량 : (a)농도; (b)온도; (c)반응시간; (d)lipase·48

Fig 16. 10 L 광생물반응기에서의 Chaetoceros 3종의 생체량 비교··· 50

Fig 17. 10 L 광생물반응기에서의 Chaetoceros 3종의 total lipid 함량 비교··· 51

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ABSTRACT

Optimum cultivation of three species of genus Chaetoceros using a novel low-cost culture medium and its industrial applications

Kim Moon jong Advisor : Prof. Si Wouk Kim Department of Renewable Energy Convergence

Graduate School of Chosun University

Optimal mixotrophic cultivation conditions of Chaetoceros species to obtain enhanced biomass and lipid productivities were investigated. The low-cost medium for cultivation of Chaetoceros species, which could be used as a food for shell-fish, were prepared by mixing f/2 medium with mud or/and food waste extract. Compared with Chaetoceros strains cultivated in a f/2 medium (used as a control), the biomass and lipid productivities of those cultivated in a f/2 medium containing mud extract increased two-fold. The biomass productivity increased three-fold when the cells were cultivated in a f/2 medium containing food waste extract, whereas lipid productivity decreased significantly. Interestingly, the biomass and lipid productivities of Chaetoceros strains increased ten times when they were cultivated in a medium containing mud and food waste (although

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the mixture ratios are a little bit different depending on microalgal strains). It was found that mud extract contains high concentrations of microelements, humic and fulvic acids, whereas food waste contains high concentrations of nitrogen, phosphorous and organic compounds.

Fatty acid analysis was performed using gas chromatography to determine the possibility of lipid conversion to bio-diesel. After cell disruption, total lipid contents were determined and direct trans-esterification reaction was carried out. Concomitantly about 35% (w/w) lipid content was obtained after cell disruption by treatment with autoclave and microwave. In addition, the highest concentration of fatty acid methylester (FAME) was observed when 10%

(v/v) sulfuric acid was used as a catalyst at 100 ℃ for 120 minutes.

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제 1 장 서론

제 1 절 이론적 배경

조류 (Algae)는 크기에 따라 거대 (Macro) 혹은 미세 (Micro)조류로 분류 되며 단세 포 생물이다. 흔히 미세조류는 식물플랑크톤 이라고 하며, 빛과 대기 중의 이산화탄 소를 이용한 광합성 (Photosynthesis)을 통해 유기물을 합성하는 대표적인 광독립영 양생물 (Photoautotroph)이다. 미세조류는 육상 광합성식물에 비해 이산화탄소 고정 능이 매우 높아 대기 중 이산화탄소 농도의 핵심적인 조절자이며, 대기 중으로 막대 한 양의 산소를 뿜어내는 지구의 허파와 같은 역할을 병행한다. 또한 미세조류는 수 생태계의 최하위에 위치하는 1차 생산자로서 매우 핵심적인 위치에 있다.^[2]

미세조류는 현재 지구상에서 약 80만 종 이상이 분포된 것으로 보고되고 있어 종 다 양성이 매우 뛰어나며, 종에 따라 생리학적 특성, 생장주기와 탄수화물, 단백질, 지 질의 주요 영양소와 더불어 엽록소 (대표적으로 β-carotinoid), 비타민 (B1, B2, 및 B6), DHA (Docosahexaenoic acid)와 EPA (Eicosapentaenoic acid)의 다가 불포화지방 산 (Polyunsaturated fatty acid)인 omega-3, 및 다양한 무기염류 (K, Mg 그리고 Fe) 등 유용물질의 함량이 다양하여 식품 (건강보조), 미용, 의약, 동·식물 사료, 농업, 환경 및 대체에너지 등 다양한 분야에 적용선택성이 매우 넓다. 또한 최근 국내·외 에서 미세조류의 생물공학 실험기술 개발로 인해 미세조류를 이용한 효과적인 상업적 개발에 보다 쉽게 다가갈 수 있게 되었다.

기원전 중국과 고대 페니키아인들은 직물염색을 위해 조류를 이용하였으며, AD 532 년 이스탄불의 경우 규조류 (Diatom)를 이용하여 벽돌을 제작하였다.^[1] 그리고 미세 조류의 상업적 이용의 대표적인 첫 번째 사례로는 제2차 세계대전 시기에 독일은 규 조류를 대량생산하여 식물성 지방 및 바이오오일을 생산하였으며, 1960년대 이후 대 만, 일본 그리고 프랑스에서 Chlorella 및 Spirulina 등 건강보조식품으로서 상업적

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이용을 위한 대량배양을 실시하였다. 또한 최근 미세조류를 이용하여 식품 생산을 기 본으로 미용, 의약, 사료, 농업, 환경 그리고 대체에너지 등 다양한 분야에 적용되고 있으며 연구 및 개발이 활발히 이뤄지고 있다.

미세조류의 상업적으로 적용이 가능한 분야 중 식품 의약 그리고 미용 등의 분야가 대부분을 차지하고 있으며, 단백질과 omega-3 등의 유용 지방산 그리고 β -carotinoid와 같은 항산화제 및 다양한 생리활성물질 등을 풍부하게 함유한 Chlorella, Spirulina, Dunaliella 그리고 Chlamydomonas 등과 같은 미세조류를 대상 으로 국내·외에서 가장 활발히 이용되고 있다. 특히 위 대상 미세조류들은 대부분 대량배양이 쉽고 생산성이 높아 상업적으로 이용되는 대표적인 미세조류이다.

또한, 토양개량제 (Soil conditioner) 및 작물 비료로 이용되는 미세조류의 경우 황 화수소 (H2S), 메탄 (CH4) 및 유기·무기화합물 제거와 토양 내 질소고정에 효과적이 며 Chlamydomonas 및 Chlorella 등 현재 토양개량제 및 작물 비료로 많이 활용되고 있다.

대부분의 미세조류는 탄소원을 이산화탄소로 이용하여 생장하는 광독립영양생물이지 만, 일부 미세조류의 경우 수중에 용존 유기물을 탄소원으로 이용한 종속 (Heterotroph) 및 혼합영양 (Mixotroph)의 조건에서도 생장이 가능하며 광독립영양배 양조건보다 생장속도 및 생체분자의 생산량 증대가 동반된다. 따라서 종속 혹은 혼합 영양배양이 가능한 미세조류를 대상으로 생물학적 폐수처리 공정에 적용하여 폐수 내 영양염류 (질소 및 인), 유기물, 그리고 다양한 중금속 이온 등의 생물학적 처리가 가능하다. 또한 생물학적 폐수처리를 통해 배양된 미세조류를 바이오에너지와 같은 일부 분야에 재이용을 통해 복합적 효과의 기대가 가능하다.

국내에서 매년 조류 인플루엔자 (Avian influenza, AI) 확산으로 대다수의 가금류 사육장에 막대한 피해를 끼치고 있으며, 2016년에 발생한 조류 인플루엔자 확산으로 인해 전국 대부분의 양계장에서 사육된 양계의 폐사로 이어지고 있다. 하지만 가금류 사육 시 기존의 사료에 미세조류를 약 5~10% 가량 첨가하여 이용할 경우 가금류의 난

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활 발색이 향상되며, 가금류의 면역체계 개선으로 조류 인플루엔자 등 다양한 전염병 으로부터 건강한 가금류 사육이 가능하다. 또한 수상 및 육상에서 양식되는 치어·패 의 먹이생물로 미세조류가 이용이 가능하며, 치패의 경우 현재까지 적합한 사료개발 이 미진하여 국내 대부분 양식 어가에서는 대부분 수입한 건조된 분말사료 혹은 미세 조류를 생먹이로 공급하고 있다. 미세조류를 치패 먹이로 공급은 대부분 건조된 분말 로 이뤄지나, 건조 사료의 경우 생먹이에 비해 치패의 생장속도가 낮아 대부분의 어 가에서는 생먹이 공급의 필요성이 강조되고 있다. 하지만 생먹이의 구입가격이 매우 높고 어가에서 치패의 먹이생물에 해당하는 미세조류의 배양기술이 확보되지 못하고 있다.

앞서 언급한 내용과 같이 미세조류는 다양한 분야에서 이용되는 매우 중요한 생물자 원이다. 최근 제한적인 화석연료 매장량과 화석연료의 막대한 사용으로 인해 발생되 는 지구온난화 (Global warming)는 가장 중요한 범국제적 해결 과제이다. 이러한 국 제적 문제를 해결하기 위해 다양한 해결책들이 제안되고 있으며 특히 바이오에너지의 연구 및 개발의 필요성이 각광받고 있다. IEA (International Energy Agency)의 발표 에 의하면, 장기적으로 2040년까지 모든 에너지의 소비량은 지속적으로 증가할 것이 며, 전 세계적으로 사용되는 에너지의 대부분을 화석연료가 차지할 것으로 보고되고 있다. 반면, 1998년 미국에서 셰일가스 (Shale gas)의 개발과 2000년대 중반 셰일가 스의 새로운 시추기술이 개발되면서 현재 미국을 중심으로 캐나다, 중국, 아르헨티나 그리고 호주 등 많은 국가들이 셰일가스 보유국이 되었으며 매장량 또한 막대하다.

셰일가스는 기본의 화석연료에 비해 온실가스 배출량이 낮은 장점 (석유와 석탄에 비 해 각각 70 및 50% 수준)을 갖고 있으며, 셰일가스 등장으로 인한 사용가능한 에너지 매장량 증가와 더불어 셰일가스 개발 저지를 위한 사우디아라비아 등의 기존 산유국 중심으로 셰일가스 생산비용보다 낮은 원유가격 유지를 통해 실제 우리가 느끼게 되 는 에너지위기의식은 최근 들어 잦아들고 있다. 하지만, 셰일가스의 시추를 위해서는 막대한량의 수자원이 소모되며 시추 후 배출되는 요염 된 수자원의 처리 및 재이용이

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어렵다. 또한 기존의 화석연료 시추 보다 많은 시추공이 필요하여 심각한 토양 및 지 하수 오염을 초래하고, 셰일가스 시추 과정, 유통 및 소비과정에서 온실가스인 메탄 가스 (CH4)의 누출이 쉬워 대기오염 및 안전사고 위험도가 매우 높은 문제점을 갖고 있다. 따라서 2012년 IEA에서는 셰일가스의 성공적인 개발을 위해서는 환경문제 극복 을 주요 요인으로 보고 있다. 셰일가스 등장으로 에너지 (화석연료)고갈과 단기적인 고유가 문제해결로 인해 대체에너지원개발의 필요성이 비교적 가벼워진 것은 사실이 지만, 기존의 화석연료와 셰일가스의 개발 및 사용으로 인한 온실가스 배출을 포함한 지구환경파괴를 해결하기 위해 기존 에너지원의 대체에너지 개발에 끊임없는 연구와 투자가 필요하다.

현재 전 세계적으로 대체에너지개발을 위한 막대한 비용과 연구 인력의 투자가 이뤄 지고 있으며, 특히 생물자원 (바이오매스, biomass)을 이용한 바이오연료의 수요 및 필요성이 증가하고 있다. 바이오에너지를 생산하기 위한 생물자원은 크게 3가지로 구 분된다. 옥수수, 사탕수수, 그리고 대두 등과 같은 작물계 생물자원을 1세대 바이오 연료 (1^st generation biofuel)이라 하며, 목재와 가공 후 발생되는 부산물 등의 목 질계 생물자원을 2세대 바이오연료 (2^nd generation biofuel)로 분류한다. 1‧2세대 생 물자원은 대부분 바이오오일, 바이오에탄올 등을 생산하는데 이용된다. 그리고 담수 혹은 해수에 서식하는 조류를 이용한 생물자원을 3세대 바이오연료 (3^rd generation biofuel)로 분류한다. 1세대 바이오연료는 대부분 식용작물로 바이오에너지 이용으로 인한 식량자원 가격의 동반상승을 초래하여 world bank의 보고에 따르면, 2002~2008 년 사이 식용작물의 바이오에너지 이용으로 인해 약 70% 이상 식용작물의 가격상승을 초래하였으며, 2008년 발표된 한 논문에서는 “바이오연료 생산을 위한 경작지의 사 용은 숲과 초원을 파괴하여 지구 온난화를 악화시키는 행위와 같다“라는 결과를 보 고한 바 있다. 또한, 목질계 생물자원을 이용한 바이오연료 생산은 생물자원의 회수 기간이 매우 길고 (최소 약 8년), hemicellulose와 lignin 등으로 둘러싸여 바이오연 료로 전환하기 위한 다양한 처리공정에 따른 높은 비용과 낮은 회수율로 인해 실제

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바이오에너지자원으로 이용에 어려움이 있다. 따라서 바이오에너지 생산을 위한 1‧2 세대 바이오연료의 대안으로 3세대 바이오연료가 각광받고 있다. 특히, 미세조류는 비교적 다른 생물자원 보다 지질의 함량이 높아 (최대 50% 이상) 바이오디젤 생산에 용이하며, 미세조류로부터 생산된 바이오디젤은 차세대 수송용 연료로 주목받고 있 다. 미세조류가 바이오에너지 생산의 차세대 대안으로 주목받는 이유는, ① 식량자원 이 아니다. 몇몇 거대 및 미세조류는 식용 및 가공식품으로 이용되지만, 대부분의 미 세조류들은 비식용 자원이기 때문에 식용작물과 가격경쟁을 피할 수 있다. ② 배양이 쉽다. 대부분의 조류는 광합성 생물로, 이산화탄소, 물, 그리고 빛 에너지만을 이용 하여 생장이 기능하기 때문에 비교적 배양이 쉽다. ③ 이산화탄소의 고정률이 높다.

이전 연구결과를 통해 보고된 것처럼, 1‧2세대 바이오연료의 이산화탄소 고정률은 각 각 5~10과 4.6 ton/ha로 미세조류의 이산화탄소 고정률 (>36.7 ton/ha)이 약 6배 이 상 우수하다. ④ 생물자원의 회수기간이 매우 짧다. 1세대 바이오연료는 우리나라의 경우 연간 최대 2회 이상 회수가 어려우며, 목질계의 경우 앞에서 언급한 바와 같이 최소 8년의 시간이 요구된다. 하지만, 3세대 바이오연료는 계절 및 지역에 따른 차이 는 있으나 연간 최소 5회에서 최대 20회 이상 회수가 가능하고, 생물학적 개량과 배 양기술개발을 통해 보다 많은 생물자원의 회수가 가능하다. ⑤ 에너지 전환율이 높 다. 미세조류의 에너지 전환율은 약 45% 이상으로 1세대 바이오연료 (30~35%)와 2세 대 바이오연료 (20~25%)보다 10%이상 높은 전환율을 나타낸다. 또한 미세조류 배양 시 다양한 탄소원 (glucose, glycerol and acetic acid 등)첨가를 통해 바이오연료의 생산량 증대가 가능하고 다양한 생물학적 개량을 통해 바이오연료의 생산량 증대와 미세조류 내 다양한 생체분자 (탄수화물, 단백질, 그리고 지질 등)의 생산량 증대를 기대할 수 있다.

하지만, 현재 미세조류를 이용한 바이오디젤의 상용화를 위해서는 몇 가지 보안해야 할 부분들이 남아있다. 먼저, 미세조류의 바이오디젤 가격은 석유 (리터당 1.1 $)에 비해 리터당 최소 2.8~5.3 $로 매우 높은 수준으로, 앞으로 상용화를 위해서는 생산

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비용 저감 (< 톤당 약 300 $)이 필수적이다. 미세조류로부터 바이오디젤을 생산하기 위해서 일반적으로, 배양-회수-파쇄-추출-바이오디젤 전환 등의 복잡한 과정을 거치 게 된다. 미국의 한 대학 연구팀은 미세조류로부터 바이오디젤을 생산하기 위한 공정 별 단가비중을 각각 42, 22, 20 그리고 16%로 보고한 바 있다. 따라서 미세조류를 이 용한 바이오디젤 생산의 생산비용 저감을 위해 미세조류 각 공정의 간소화 및 비용 저감이 필수적이다.

또한, 폴리프로필렌 (Polypropylene), 폴리염화비닐 (Polyvinyl chloride, PVC) 등 복합재료에 충진제로 활용되며, 동위원소의 표지 화합물로서 이용되고 있다. 그리고 미세조류는 각 지역의 환경연구, 우주선 및 잠수함 등의 산소공급, 그리고 방사능 완 화 등의 다양한 분야에서 미세조류의 상업적 이용이 이뤄지고 있다.

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Table 1. 세대별 바이오매스의 경쟁력 분석^[9]

분 류

육상 Biomass 해양 Biomass 작물

(1세대)

목재 (2세대)

미세조류 (3세대)

Period 1~2 회/년 최소 8년 5~20 회/년

CO2 fixation (ton/ha) 5~10 4.6 36.7

공정 단순

복잡 (lignin제거)

단순

생장요소

햇빛, CO2, 물, 경작지, 및 비료

햇빛, CO2 및 물

에너지 전환율 (%) 30~35% 20~25% 45%

생산비용 ($/L) 0.2~0.3 0.4 ≒2.8

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제 2 절 연구동향

1. 국내 동향

미세조류에 대한 배양기술의 경우 대부분 바이오에너지 생산을 위한 연구가 대부분 이며, 국내∙외에서 다양한 연구를 통해서 미세조류로부터 고품질의 바이오에너지 (특히, 바이오디젤 등 수송 연료)생산을 위한 다양한 연구가 진행 중에 있다. 국내 에서도 미세조류 관련 연구는 1915년 국내 바다의 수산자원조사업의 일환으로 식물 플랑크톤 연구를 시작으로 1960년대 후반부터 미세조류의 생화학, 유전공학 그리고 생물공학적 연구가 확산되어 환경생명공학 등의 응용분야에 중요한 생물자원으로 활 용되기 시작하였다. 최근 들어 국내에서도 온실가스 배출 및 기후변화에 대한 대응 책으로 신재생에너지 보급 확대정책이 시행되면서 화석연료를 대체할 바이오에너지 산업이 정부의 정책을 통해 지속적으로 성장하고 있으며, 특히 전기와 수송용 연료 시장을 중심으로 시장이 활성화 되고 있다. 정부는 작년 기존 화석연료(경유)에 바 이오 연료를 일정 비율 혼합하도록 하는 ‘신재생에너지연료 혼합의무제도 (RFS, Renewable Fuel Standard)’시행을 통해 현재 2.5%에 머무르는 혼합률을 3.0%까지 끌어올리면서 지속적으로 바이오에너지 산업 육성 및 활성화를 시행하고 있다.

최근 미세조류의 대량배양, 신규 광생물반응기 개발 및 바이오에너지 생산에 대한 연구는 2009년 신재생에너지 R&D지원으로 총 3,544억원 중 바이오에너지 분야 지원 액은 약 286억원으로 8.1%의 비중을 차지하한다. 국내 연구개발사업 중에서 ‘이산 화탄소 저감 및 처리기술개발사업’ (2002~2012년)의 ‘생물학적 전환에 의한 이산 화탄소 고부가 생물제품 기술 개발’이 의약 원료, 기능성 사료, 바이오디젤 생산 등을 목표로 지속적으로 추진되고 있다. 또한 최근에 미세조류로부터 생물연료 생산 에 대한 관심이 높아지면서 신재생에너지 기술개발사업 (2007~2010년), 전력산업연 구개발사업 (2007~2010년), 미래 해양기술개발사업 (2008~2010년) 등에서도 이와 관 련된 기초연구가 수행되고 있다. 근래에 지구온난화 및 에너지 위기에 적극 대처하

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기 위해서 국가에서는 "기후변화 대응 국가연구개발 중장기 마스터플랜 (2008년)"을 수립하여 투자 우선순위 및 R&D 포트폴리오를 설정하고 전략적으로 재원을 배분하고 자하는 국가종합기본계획을 수립하였다. 또한 새로운 국정 패러다임인 “저탄소 녹 색성장”을 견인할 범부처 차원의 녹색기술 연구개발 종합대책이 확정되었다 (2009.

1. 13). 최근, 2009년부터 2019년까지 정부기관에서 주관하는 연간 7억원의 지원으 로 “인하대학교 이철균 교수 연구진”을 중심으로 해양에서 바이오에너지 생산 기 술 개발을 진행 중이며, 해양바이오에너지 개발로 Green energy 자립국 실현을 비전 으로 2030년 까지 바이오에너지 수급량의 43.3%를 목표로 하고 있다. 또한, 2010년 연간 118억원의 지원으로 미세조류의 바이오매스 기반 탄소 순환형 경제체제구축을 목표로 카이스트를 중심으로 국내 여러 대학 및 연구소를 중심으로 활발히 연구를 수행중이다. 또한 고려대학교 심상준 교수 연구팀은 100 L 규모의 비닐백 형태의 광 생물반응기를 설치하고, 현재 운전과 실증을 마친 상태이다. 또한 지역난방공사 (판 교지사)사업장 내 1 ton 규모의 광생물반응기 플랜트 설비를 운용중이며, 여기서 생 산되는 미세조류를 이용하여 바이오에너지 및 다양한 고부가 유용물질 생산을 목전 에 두고 있다. 또한 인하대학교 이철균 교수 연구팀은 반투과막 해양 광생물반응기 개발을 통해 미국 우주공화국 NASA의 “OMEGA”프로젝트 보다 앞선 해양 광생물배양 장치에 대한 원천기술을 획득하였다. 그리고 한국생명공학연구원은 담수 미세조류의 대량배양을 위한 lab-scale의 콘형 광생물반응기 및 연못형 배양장치를 개발 및 운 용중이며, 성균관대학교의 경우 미세조류로부터 β-carotinoid 등과 같은 고부가 유 용물질 생산을 위한 100 L급 관형 광생물반응기를 운용 중에 있다.

미세조류를 먹이생물로서 이용하는 양식어업 별로 갑각류의 경우 흰다리새우, 패류 는 굴, 홍합, 바지락, 전복, 꼬막, 피조개 및 가리비가, 기타 수산동물로는 우렁쉥 이, 미더덕, 오만둥이가 대량으로 양식되고 있는 품종이다. 1976년에 참전복을 중심 으로 인공종묘생산이 시작되었으며, 2004년에는 연간 1,260 ton의 생산량을 나타내 었으며, 꼬막, 백합 및 가리비 등 다양한 패류를 중심으로 양식사업이 남해안 지역

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을 중심으로 집중되고 있으며, 치패의 먹이생물인 대상 미세조류 (부착성 규조류)의 배양, 부착 및 변태 특성 및 관리방법 등의 연구가 진행되고 있다. 정부 주관 2020 종자사업 육성대책으로 2009년부터 2020년까지 2,444억 원을 R&D 투자확대, 먹이생 물 관리체계 개편 등의 내용으로 투자계획을 발표한 바 있다. 최근지역 수산 양식 어가 및 양식업체에서는 치패·어의 생육을 증진하고 먹이생물로 이용하기 위하여 광합성 미생물을 사용하고 있으나 경험적인 사용이 대부분이며 체계화된 연구는 거 의 전무하다.

2. 국외 동향

미세조류의 상업적 이용에 대한 본격적인 연구는 1940년대 2차 세계대전 중 독일이 식물성 기름 생산을 위해 규조류를 대량배양 하는 것으로 처음 시작되었다. 일본의 경우 1965년 미세조류를 이용한 상업적 생산이 가능해 짐에 따라 Chlorella를 중심 으로 건강보조식품 생산을 위한 미세조류 배양 및 고부가가유효성분 생산연구가 시 작되었다. 국외 해양 미세조류 관련 특허동향을 살펴보면, 1990년 이전부터 꾸준하 게 연구가 이뤄졌으나, 많은 연구결과가 도출되지는 못했다. 하지만 2000년대 이후 고유가 및 기후 협약 채결 등의 기후변화로 인해 대체에너지 혹은 신재생에너지에 관한 관심이 증폭되면서 미세조류를 이용한 바이오에너지 생산에 대한 연구가 활발 해지면서 2001년 이후 미세조류 배양기술 및 바이오에너지 관련 연구는 급격히 활기 를 띄기 시작했다. 미국 NREL (National renewable energy laboratory)에서는 지질 의 함량이 높은 미세조류 종을 대량배양 하여 자동차 연료용 바이오디젤을 생산하는 기술을 개발하였으며 유전자 조작을 통해 다량의 지질을 축적하는 미세조류를 개발 해 옥외 실증배양설비를 제작하여 연구를 수행하고 있다. 실제로 미국은 대표적인 연구소인 로스 알라모스 국립 연구소 (Los Alamos National Laboratory, LANL)에서 는 100대 연구기술 가운데 하나로 조류 수확을 위한 초음파기술을 선정하여 차세대 바이오연료 및 바이오 제품 연합 (National Alliance for Advanced Niofuels and

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Bioroducts, NAABB)을 통해 연구를 진행하고 있다.^[11] 해당 기술은 1 시간당 100 L 의 조류 배양 속도로 운전될 수 있는 수확기기를 설계 및 개발하였으며, 2013년 현 장에 실증시설을 설치 및 시험 중이고, 미세조류의 고농도 대량배양이 가능할 것으 로 예상하고 있다. 또한 미 국방성에서는 조류의 저비용 고효율의 미세조류 배양공 정을 군용 항공유 생산을 위해 개발 중이며, 미 국방에너지 지원센터는 조류에서 생 산된 디젤에 대해 활용여부를 시험 중에 있다. 그리고 Continental airline과 일본 항공은 조류로부터 항공유를 생산하여 민항기에 적용하는 시험을 성공하기도 하였 다. 미세조류의 배양을 토한 바이오에너지 및 고부가 유효물질 생산에 대한 연구를 수행하고 있는 대표적인 벤처기업으로는 SOLIX, GreenFuel 및 Cyanotec 등이 있으 며, 해마다 새롭게 창업되고 있는 기업의 수가 증가하는 추세이다.

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제 3 절 연구목적

Chaetoceros는 현재 치패·어 양식에서 효과적인 먹이생물로 많이 사용되고 있는 종 이다. Rhodobacter sphaeroides와 같은 특정 광합성 세균을 먹이생물로 이용하여 항 생제 대체용 물질로 사용하고 있는데, 최근 들어 Chaetoceros를 이용하여 광합성세균 을 대체하고 있는 추세이다. 또한 Chaetoceros는 먹이생물 공급은 갑각류나 특히 가 리비 등에 Vitamin A와 B12을 공급하고 송어, 연어과 같은 어류의 살에 붉은색을 개 선하여 품질을 향상시키고, 생물학적 기능을 유도하는 먹이생물로 공급되고 있다. 더 나아가 최근에는 Biodiesel의 원료로 연구 중에 있다.^[12] 기존의 Biodiesel에 사용되 는 종들은 최대 60~70% (w/w)의 지질 함량을 가지고 있는 미세조류가 이용된다.

Chaetoceros는 높은 성장률과 지질의 높은 농도 약 50% (w/w)이상을 함유하고 있 다.^[13]

국내 수산 양식업은 최근까지도 성황을 이루고 있으나, 치패·어 양식을 위한 먹이 생물 공급이 어려워 수산양식업체에서는 많은 한계를 느끼고 있다. 치패·어 양식에 이용되는 먹이생물로는 주로 규조류가 이용되며, 양식 치패·어의 종에 따른 미세조 류의 종 선택폭도 매우 다양하다. 하지만 현재 대부분의 국내 수산양식업체들은 기본 적인 미세조류에 대한 종 선정, 배양기술 그리고 배양공정 등의 기본적인 연구가 미 비하다. 최근에 먹이생물로서 미세조류를 대체할 수 있는 배합사료를 개발하고자 많 은 노력을 기울이고 있으나 아직 미세조류를 대체할 수 있는 배합사료의 개발은 이루 어지지 않고 있다. 살아있는 상태의 미세조류가 아닌 건조가공을 거쳐 유통기한이 획 기적으로 늘릴 수 있는 미세조류 및 그 가공법을 개발하기 위한 연구가 매우 활발하 지만, 아직 완벽한 개발이 이뤄지지 못해 살아 있는 미세조류를 일부 대체하여 사용 되는 건조분말이 시판되고 있기는 하다. 따라서 효과적인 치패·어 양식을 위해서는 미세조류의 원활한 공급 및 신선한 미세조류의 수급이 필요하다. 미세조류의 원활한 공급을 위해서는 높은 성장속도위한 배양기술이 필요하다. 미세조류는 기본적으로 에

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너지원과 탄소원을 빛과 이산화탄소를 각각 이용하여 살아가는 광독립영양생물이며 광독립영양배양 조건에서 미세조류를 배양할 경우 배양에 있어 추가비용은 요구되지 않으나 생장속도가 매우 낮아 생체량 (Biomass) 및 지질 등의 생산성이 매우 낮다.

하지만, 유기탄소원 일부를 첨가하게 되면 미세조류의 생장속도가 매우 빠르게 증가 한다. 미세조류를 생물자원으로 활용하고 치패·어 양식을 위해서는 미세조류의 원활 한 공급을 위해서는 고농도 배양이 필요하다. 이러한 고농도 배양을 위해서는 유기탄 소원을 첨가한 혼합영양배양 조건이 필요 하지만 기존의 배양방법과 비교하였을 때 유기탄소원을 첨가한 혼합영양배양 조건에서는 다양한 미량원소들과 영양염류를 첨가 해 주어야 되기 때문에 많은 비용이 발생하게 된다. 미세조류로부터 높은 생체량 및 유용물질의 생산 비용을 줄이기 위해서는 가장 많은 비용부분을 차지하고 있는 배양 공정의 비용절감 필수적이다. 또한 기존의 시약으로 배지 조제 시 미세조류의 안정적 인 배양을 기대할 수 있으나 배지 조제비용으로 인한 배양공정 비용 저감이 어렵다.

따라서 본 연구에서는 미세조류의 생장에 필수적인 영양염류 (질소, 인, 및 탄소원) 및 무기염류 (Mg, Na, Si 및 Fe등)의 공급을 위해 기존의 시약을 이용하지 않고 토양 및 음식물 추출액을 첨가하여 친환경 저가의 혼합영양배지를 조제하고, 동시에 높은 생체량 및 지질 생산성이 가능한 신규배지를 제조하고자 하였다. 또한 신규배지에서 Chaetoceros 3종을 배양하여 치패·어 먹이생산과 biodiesel 생산 가능성이 있는지에 대해 살펴보고자 하였다.

(26)

제 2 장 실험 재료 및 방법

제 1절 실험재료

1, 미세조류 및 배지 조성

실험에 사용한 미세조류 균주는 Chaetoceros sp. KMMCC1319, Chaetoceros fragilis KMMCC1122 그리고 Chaetoceros gracilis KMMCC674로 3종 모두 한국해양미세조류은행 에서 분양받아 본 연구에 사용되었다. Chaetoceros 3종 모두 f/2 배지를 사용하였 고, 조성은 Table 2와 같다.

(a) (b) (c)

Fig. 1.Chaetoceros 종의 관찰. (a) Chaetoceros sp. KMMCC1319;

(b) C. fragilis KMMCC1122; (c) C. gracilis KMMCC674

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Table 2. f/2 배지의 조성

(a) Trace elements (g/L) : Na2⋅EDTA 4.16; FeCl3⋅6H2O 3.15; CuSO4∙5H2O 0.01; ZnSO4∙7H2O 0.022; CoCl2⋅6H2O 0.01; MnCl2⋅4H2O 0.18; Na2MoO4∙2H2O 0.006

(b) Vitamin mixture (g/L) : Cyanocobalamin (Vitamin B12) 5 × 10^-3; Thiamine HCL (Vitamin B1) 1; Biotin 5 × 10^-3

Composition Content (g/L) NaNO₃

NaH₂PO₄⋅2H₂O

Trace elements (Chelated)^(a) Vitamin mixture^(b)

75 × 10^-3 5.65 × 10^-3

1 mL 0.1 mL

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제 2 절 실험방법

1. 종균 배양 조건

Chaetoceros 3종 미세조류의 종균 및 전 배양을 위해 1 L flask에 f/2 배지 500 mL 에 Chaetoceros 3종을 각각 접종한 후 85 μmol/m²/sec의 빛을 12:12 시간 (light : dark) 주기로 공급하고, 19℃ 온도에서 15 일간 배양하였다.

2.광학밀도 및 생체량 조사

Chaetoceros 3종의 광학밀도 (Optical density) 및 생체량 (건조중량)을 측정하기 위해 배양기간 동안 24 시간을 주기로 시료 1 mL를 채취하여 큐벳 (1×3 cm)에 넣고 uv-vis spectrophotometer (Du-800, Beckman counter, USA)을 이용하여 파장 680 nm 에서 f/2 배지를 대조군으로 하여 각각 3회 측정한 뒤 표준편차를 계산하여 광학밀 도 값으로 나타내었다. 그리고 최대 광학밀도에 도달했을 때 생체량 (건조중량, g/L)을 측정하기 위해 원심분리기 (Avanti J-E, Beckman counter, USA)를 이용하여 3,000 × g에서, 20 분 동안 고-액 분리 후, 상등액을 제거하고 pellet을 –80℃에서 3 시간 동결시킨 후 freeze dryer (CNL-51U, NIHON, Japan)를 이용하여 48 시간 동 안 동결건조 후 무게를 달아 각 미세조류의 생체량을 측정하였다.^[14]

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3. 배양조건 최적화

가. 빛의 세기에 따른 생체량 조사

대부분의 조류는 빛을 에너지원으로 하여 명반응에 의해 ATP와 NADPH를 합성하고 이를 생장동력으로 사용한다. 본 연구에서는 빛 세기에 따른 Chaetoceros의 생체량 을 알아보고, 최적 빛의 세기 조건을 조사하였다. 광원으로 형광등을 사용하였고 조도계를 이용하여 빛의 세기를 80, 90, 100 그리고 110 μmol/m²/s로 조절 후 12:12 시간 (light : dark)주기로 공급하고, 19℃에서 15 일간 배양하면서 24 시간 간격으로 생체량을 측정하였다.

나. 질소 및 인 농도에 따른 생체량 조사

미세조류는 질소, 인, 이산화탄소 그리고 빛 에너지를 이용하여 이산화탄소를 흡

수하고 산소를 생성한다. 이때 탄소, 질소 및 인의 비율은 미세조류의 대량증식을 위한 중요한 영향인자이다. 질소의 경우 1, 2, 4 그리고 5 mM 그리고 인 농도는 0.02, 0.04, 0.08 그리고 0.10 mM으로 각각 농도로 조절하여 각 조건에 대하여 가 미세조류의 생체량을 조사하여 질소 및 인의 최적화실험을 진행하였다.

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4. 신규 배지 제조 및 비교

가. 갯벌 및 음식물 추출액의 성분 분석

갯벌과 음식물 추출액을 이용한 혼합영양배지 조제를 위해 갯벌과 음식물 폐기물 의 유기물농도, 음식물 폐기물의 질소·인 그리고 갯벌 내 존재하는 다양한 미량원 소들의 농도를 측정하였다. 유기물 농도 측정을 위해 TOC 및 COD방법을 이용하였으 며, 미량원소 분석은 ICP-MS를 이용하였다. 또한 음식물 폐기물의 질소 및 인 농도 분석은 T-N (총 질소), NH4-N (암모니아성 질소), NO3-N (질산성 질소) 그리고 T-P (총 인)의 항목을 수질오염공정시험법에 준하여 수행하였다. ^[15]

또한 ICP-MS (ELAN DRC Ⅱ, Perkinelmer, USA) 및 TOC (TOC-VCPH, Shimadzu, Japen) 분석은 조선대학교 공동실험실습관에 의뢰하여 수행하였다.

1) T-N (Total nitrogen, 총 질소)

음식물 폐기물 50 mL를 분해병에 넣고 10 mL의 alkali-K2SO4를 첨가 후 교반한 다. 잘 혼합된 분해병을 고압습윤멸균기에서 121℃에서 30분간 가열/분해하여 분 석시료로 이용한다. 전처리된 시료를 0.45 um의 유리섬유 여지 (GF/C)를 이용하여 여과하고 시료 25 mL를 정확히 취한다. 시료 25 mL에 HCl (1+16, v/v)을 5 mL 첨 가하여 pH를 약 2까지 조정한 후, Uv-vis spectrophotometer로 220 nm에서 시료용 액의 흡광도 (Absorbance)를 측정 후 농도 (mg/L)로 산출하였다.

2) NH4-N (Ammonium nitrate, 암모니아성 질소)

시료 10 mL에 Phenol-sodium Nitroferricyanide 용액 5 mL과 NaOCl 용액을 각각 첨가한 후, 상온에서 1시간 방치하였다. 방치 후 uv-vis spectrophotometer에서 630 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(31)

3) NO3-N (Nitrogen nitrate, 질산성 질소)

시료를 10 mL 취해 NaCl 용액 (30%, w/v) 2 mL과 H2SO4 (4+1, v/v) 10 mL를 순서 대로 첨가 후, 충분한 교반 후 수냉한다. 교반 및 수냉 후, C29H33N3O7S 용액 0.5 mL를 넣고 교반 후 20 분 동안 가열한다. 가열된 시료를 충분히 수냉하여 uv-vis spectrophotometer로 410 nm에서 NO3-N (mg/L)를 측정하였다.

4) T-P (Total phosphorus, 총인)

음식물 폐기물의 T-P분석은 아스코르빈산 환원법을 이용하여 수행하였다. 시료 50 mL을 분해병에 취한 후 10 mL의 K2S2O8 용액 (4%, w/v)을 첨가하여 고압습윤멸 균기에서 121℃에서 30 분간 가열/분해 후 시료를 상온에서 방냉하였다. 방냉 후 시료의 상등액 25 mL을 취해 2 mL의 ammonium molybdate-ascorbic acid 혼액을 첨 가하고 20~40℃에서 15 분간 열을 가한 후 uv-vis spectrophotometer로 880 nm에 서 흡광도를 측정 하였다.

5) COD (Chemical oxygen demand, 화학적 산소 요구량)

COD는 중크롬산칼륨법으로 처리하여, HACH사의 DR/4000u Spectrophotometer로 측 정하였다.^[16]

나. 갯벌 추출액을 첨가한 f/2 배지에서 생체량 조사

본 실험에 사용 된 갯벌은 전라남도 무안군에 위치한 홀통 해수욕장에서 채취 하 였다. 채취한 갯벌은 60 mesh 체를 이용하여 걸러낸 후 48 시간 동안 햇볕에 건조 하였다. 건조 된 갯벌 100 g과 600 mL의 증류수를 혼합 후 0.45 μm의 glass microfiber filters (Whatman, United kingdom)를 이용하여 여과한 후 사용 하였 다. 전처리 후 f/2 배지와 갯벌 추출액을 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 그리고 5:5 (f/2 : 갯벌 추출액, v/v)의 비율로 각각 혼합하여 Chaetoceros 3종의 생체량 및 지질에

(32)

대한 생산량 (생산성)을 각각 조사하였다.

다. 음식물 추출액을 첨가한 f/2 배지에서 생체량 조사

음식물 추축액의 높은 영양염류를 기존 배지 (f/2)에 공급하여 Chaetoceros의 종 속 및 혼합영양배양 조건을 통해 높은 생장속도 및 지질 등의 생체분자 축적량을 유도하고자 하였다. 음식물 추출액 조제를 위한 폐 음식물은 조선이공대학 학생식 당에서 배출되는 음식물을 사용하였다. 음식물 추출액은 1,000 x g, 15 분의 조건 으로 고-액 분리한 뒤 고체만 모아 고압습윤멸균 (121℃, 15 분)을 실시하였다. 고 압습윤멸균 처리 된 시료를 건조시켜 100 g의 음식물과 600 mL 증류수와 혼합하여 24 시간동안 정체시킨 뒤 0.45 μm의 GF/C를 이용하여 여과 된 음식물 추출액을 사 용하였다. f/2 배지와 음식 추출액 혼합 비율은 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 그리고 5:5 (f/2:음식물 추출액, v/v) 비율로 혼합하여 Chaetoceros 3종의 생체량 및 지질에 대한 생산량 (생산성)을 각각 조사하였다.

라. 갯벌과 음식물 추출액을 이용한 최종 혼합배지 제조

영양염류, 미량원소 및 유기물이 함유한 갯벌 및 음식물 추출액을 f/2 배지에 각 각 첨가하여 Chaetoceros 3종의 생체량 및 지질의 생산량에 대한 영향을 이전 실험 을 통해 조사하였다. 본 연구에서는 갯벌과 음식물 추출액을 일정 비율로 혼합한 혼합배지를 제조하고 대상 Chaetoceros에 미치는 영향을 조사하였다. 갯벌과 음식 물 추출액을 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 그리고 5:5 (갯벌:음식물 추출액, v/v)의 비율로 각각 혼합한 뒤 f/2 배지와 5:5 (v/v)로 혼합하여 배지를 조제하였다. 갯벌 및 음 식물 추출액 혼합비율에 따라 Chaetoceros 3종의 가장 높은 생체량과 지질의 생산 량의 혼합비율을 최적 혼합배지로 결정하였다.

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5. 파쇄방법 최적화 및 지질 추출

가. Chaetoceros 3종의 파쇄방법 최적화

Chaetoceros 3종의 효과적인 지질추출 (Lipid extraction)을 위해 물리적인 방법 을 이용하여 최적 파쇄방법 (Disruption)을 조사하였다. 본 연구에서는 autoclave, sonication, bead-beater, microwave 그리고 french press로 총 5 가지 물리적 파 쇄방법을 이용하였다. 배양 된 Chaetoceros 3종의 시료 10 mL을 5가지 파쇄방법에 따라 각각 파쇄 하여 Bligh and Dyer method^[17]에 따라 각 지질 함량 (%, w/w)을 조사 하였다. 5가지 파쇄방법의 실험조건은 Table 와 같다.

Table 3. Gas chromatography 분석조건

Disruption methods Conditions

Autoclave at 121℃, for 15 min Sonication at 40 kHz, for 20 min

Bead-beater 0.1 mm of bead diameter, at 2,800, for 10 min

Microwave at 10 kHz, for 15 min French press at 2,000 psi, for 2 times

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나. Chaetoceros 3종의 지질 추출

Chaetoceros 3종의 지질 추출 방법은 Bligh and Dyer method^[15]를 이용하였다. 건 조된 시료 3종의 Chaetoceros 1 g에 chloroform:methanol (1:2, v/v)을 3 mL 첨가 한 후 20 분 동안 충분히 혼합하였다. 혼합 후 1 mL의 chloroform과 1.8 mL의 증류 수를 넣어주고 다시 혼합한 후 원심분리기를 이용하여 5,000 x g에서 15 분간 원심 분리 하여 하부의 chloroform 층을 회수하여 rotary evaporator (r-205, Buchi, Germany)에서 50 mbar, 70℃ 조건으로 10 분간 증류시키고 방냉 후 건조된 미세조 류 1 g 당 총 지질 함량 (%, w/w)을 조사하였다.

6. Gas chromatography를 이용한 Chaetoceros의 지방산 분석

Chaetoceros 3종의 지질 내 존재하는 지방산 (Fatty acid)의 정성 및 정량 분석은 Gas chromatography를 이용하여 수행하였다. Chaetoceros로부터 추출한 지질을 Metcalfe와 Schmitz의 방법^[18]을 통해 분석하였다. 추출된 지질에 2% (w/v) NaOH-methanol 용액 1.5 mL를 가하여 80℃에서 1 시간 동안 반응 시킨 뒤 상온에서 방냉 하고, 다시 14% (w/v) BF3-methanol용액 2 mL를 가하여 80℃에서 1 시간 동안 가온하고 methylation 후 상온에서 방냉 하였다. 방냉 후 Isooctane (2,2,4-Trimethyl pentane, sigma) 1 mL로 추출한 지방산의 회수율을 높이기 위해 NaCl용액 5 mL를 첨가하여 상부의 isooctane 층을 취하고 sodium sulfate로 탈수 후 GC 분석 시료로 하였다. 지방산 분석에 사용한 GC-2010 plus (Shimadzu, Japan)에 Rt-2560 capillary column (100 m x 0.25 mm x 0.20 μm, restek)을 부착하여 분석 하였다. Detector는 FID (Frame ionized detector)를 이용하였고, injector와 detector의 온도는 260℃로 동일하게 설정하였다. Carrier gas로는 helium을 사용하 였다

(35)

7. 에스테르교환반응

Chaetoceros로부터 추출한 지질을 에스테르교환반응 (Transesterification)을 통해 crude biodiesel (Fatty acid methyl ester)로 전환하기 위해 Fig. 2와 같이 촉매 (산과 염기), 촉매의 농도, 반응온도 및 시간에 대하여 최적화를 실시하였다. 또한, 산과 염기 중 최적 촉매와 지질분해 효소인 lipase의 에스테르교환반응에 대한 효율 을 조사하였다.

건조된 지질 1g에 30 mg의 촉매를 사용하였다. 본 연구에서 사용된 촉매는 10%

(v/v) H2SO4와 HCl의 산 촉매 그리고 NaOH 및 KOH를 염기 촉매로 각각 사용하였다.

또한 최적 촉매의 농도 (1, 2, 5, 10, 15 그리고 20 % (v/v)), 반응온도 (70, 80, 90, 100, 110 그리고 120℃), 그리고 반응시간 (60, 80, 100, 120, 150 그리고 200 분) 별 최적화를 각각 실시하였다. 또한 각 조건별 FAME의 농도는 GC를 이용하여 분 석하였다.

Fig. 2. Triglyceride의 에스테르 교환반응.^[19]

(36)

8. 관형-광생물반응기를 이용한 Chaetoceros의 대량배양

미세조류의 대량배양 비용 절감을 위해서는 배양효율이 높은 광생물응기 개발이 필 수적이다.

본 연구에서는 Chaetoceros의 대량배양을 위해 본 연구실에서 직접 제작한 pyrex glass재질의 관형 광생물반응기 (Tubular-photobioreactor)는 지름 15 cm, 길이 70 cm로써 총 부피는 12 L이며 10 L까지 배지를 채워 사용하였다. 제작한 관형-광생물 반응기는 기체의 원활한 공급을 위해 거치대에 총 4개의 반응기를 가로로 각각 배치 하였으며, 공기는 Air pump (LA-100, Nitto kohki, Japan)에서 pre-filter (0.45

㎛)를 통해 반응기로 주입하였다. 또한 반응기 바닥에 폴리염화비닐 재질의 기포분 산기 (Air distributor)를 설치하여 다공질 합성수지로 구성된 기포발생판에서 생성 된 미세기포가 전체 배지에 골고루 분포 되도록 하였다.

Fig. 3. 관형-광생물반응기 모식도.

(37)

제 3 장 결과 및 고찰

제 1 절

Chaetoceros

의 생체량 및 최적 배양 조건 확인

1. 빛의 세기에 따른 생체량 측정

Chaetoceros의 f/2 배지에서 80, 90, 100 그리고 110 μmol/m²/s의 빛의 세기 별 생체량을 조사한 결과, Chaetoceros 3종 모두 90 μmol/m²/s에서 최대 생체량이 각 각 측정되었다. 최적 빛의 세기인 90 μmol/m²/s에서 Chaetoceors sp. KMMCC1319는 1.46 g/L, C. fragilis KMMCC1122는 0.94 g/L 그리고 C. gracilis KMMCC674의 경우 0.88 g/L의 생체량을 각각 얻을 수 있었다.

(38)

(a)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

80 uM/m2/s 90 uM/m2/s 100 uM/m2/s 110 uM/m2/s

(b)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

(c)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

Fig. 4. 빛의 세기에 따른 Chaetoceros의 생체량. (a) Chaetoceros sp. KMMCC1319;

(b) C. fragilis KMMCC1122; (c) C. gracilis KMMCC674.

(39)

2. 질소 농도에 따른 생체량 측정

f/2 배지 내 NaNO3가 Chaetoceros의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 질소 농 도를 1, 2, 4 그리고 5 mM로 조절하고 생체량을 측정하였다. Chaetoceros 3종의 최적 질소농도는 Chaetoceors sp. KMMCC1319는 4 mM에서 1.46 g/L, C. fragilis KMMCC1122 는 2 mM에서 0.97 g/L, C. gracilis KMMCC674는 2 mM에서 0.89 g/L로 나타났다.

Chaetoceors sp. KMMCC1319는 질소 농도 2 mM과 4 mM 거의 유사하여 추후 실험은 2 mM 로 진행하였다.

(40)

(a)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

1mM 2mM 4mM 5mM

(b)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

1mM 2mM 4mM 5mM

(c)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

1mM 2mM 4mM 5mM

Fig. 5. 질소 농도에 따른 Chaetoceros 생체량. (a) Chaetoceros sp. KMMCC1319; (b) C. fragilis KMMCC1122; (c) C. gracilis KMMCC674.

(41)

3. 인 농도에 따른 생체량 측정

Chaetoceros의 최적 인 농도를 알아보기 위해서 인농도를 각 0.02, 0.04, 0.08 그리 고 0.10 mM로 조절하고 각각의 생체량을 측정하였다. Chaetoceros sp. KMMCC1319는 0.04 mM에서 1.46 g/L, C. fragilis KMMCC1122는 0.08 mM에서 0.97 g/L, C. gracilis KMMCC674는 0.08 mM에서 0.90 g/L로 각각 조사되었다. C. gracilis KMMCC674에서 최적 인 농도인 0.08 mM과 0.04 mM의 생체량은 거의 유사하여 3종 모두 인 농도를 0.04 mM 으로 조정하여 추후 실험을 진행 하였다.

(42)

(a)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

0.02 mM 0.04 mM 0.08 mM 0.10 mM

(b)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

0.02 mM 0.04 mM 0.08 mM 0.10 mM

(c)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2

1.5 0.02 mM

0.04 mM 0.08 mM 0.10 mM

Fig. 6. 인 농도에 따른 Chaetoceros의 생체량. (a) Chaetoceros sp. KMMCC1319; (b) C. fragilis KMMCC1122; (c) C. gracilis KMMCC674.

(43)

제 2절 갯벌 추출액과 음식 추출액의 성분 조사

갯벌과 음식 추출액의 혼합배지 조제를 위해 갯벌과 음식 추출액 내 존재하는 영양 염류 (질소, 인 그리고 유기물 등)와 미량원소의 성분을 조사 하였다. 갯벌 추출액의 성분으로는 T-N은 98.5 mg/L, NH4-N 11.4, NO3-N 60.7 mg/L, T-P 22.0 mg/L, TOC 308.1 mg/L, COD 55.4 mg/L, Zn 95.8 mg/kg, Fe 1741.9 mg/kg, K 2744.6 mg/kg, Ca 948.1 mg/kg, Mg 2626.4 mg/kg, Mn 305.7 mg/kg, Si 97.8 mg/kg, Na 41.6 mg/kg, Cu 16.5 mg/로, 음식 추출물 성분으로 T-N은 278.4 mg/L, NH4-N 124.8, NO3-N 77.1 mg/L, T-P 57.9 mg/L, TOC 508.2 mg/L, COD 308.1 mg/L로 나타났다.

특히 갯벌 추출액 성분 중 Fe, K 그리고 Mg 등 조류생장에 필요한 미량원소들이 기 존에 사용하던 f/2 배지에 비하여 더 높은 양을 함유하고 있고, 음식물 추출액 성분 중 T-N, NH_4-N,T-P의 농도가 기존의 f/2 배지와 비교 하였을 때 더 높은 영양염류 함유하고 있다. 따라서 f/2 배지에 갯벌과 음식 추출액 첨가에 따른 Chaetoceros 생체량 증가가 기대된다. 또한, 갯벌 추출액 내에 다양한 미량원소의 농도가 충분 하여 Chaetoceros의 생체량 및 지질 생산량에도 긍정적인 효과가 예상된다.

(44)

Table 4. 갯벌 추출액과 음식 추출액의 성분

Table 5. 갯벌 추출액의 미량원소 분석

pH T-N

(mg/L)

NH4-N (mg/L)

NO3-N (mg/L)

T-P (mg/L)

TOC (mg/L)

COD (mg/L) Food

Waste 4.7 278.4 124.8 77.1 57.9 508.2 308.1 Mud - 98.5 11.4 60.7 22.0 308.1 55.4

Zn

(mg/kg)

Fe

(mg/kg)

K

(mg/kg)

Ca

(mg/kg)

Mg

(mg/kg)

Mn

(mg/kg)

Si

(mg/kg)

Na

(mg/kg)

Cu

(mg/kg)

Mud 95.8 1741.9 2744.6 948.1 2626.4 305.7 97.8 41.6 16.5

(45)

제 3절 신규배지 제조

1. f/2와 갯벌추출액의 혼합비율에 따른 생체량 및 지질의 생산량 조사 갯벌 추출액을 이용하여 기존의 f/2 배지에 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 그리고 5:5 (f/2 : 갯벌추출액, v/v)의 비율로 갯벌 추출액을 첨가해주었다. 배양조건은 기존의 최적화된 배양조건인 90 μmol/m²/sec의 빛의 세기와 19℃ 배양 조건에서 15 일 동안 배양하였 다. Chaetoceros 3종 모두 f/2 배지와 갯벌을 6:4 (v/v)의 비율로 혼합했을 때 가장 높은 생체량이 나타났으며 Chaetoceors sp. KMMCC1319는 2.70 g/L, C. fragilis KMMCC1122는 1.23 g/L, C. gracilis KMMCC674는 1.19 g/L로 각각 조사되었다. 또한 갯 벌 추출액 혼합비율에 따른 Chaetoceros 3종의 총 지질 함량 (w/w)을 조사한 결과, Chaetoceros sp. KMMCC1319는 29.0%, C. fragilis KMMCC1122는 32.6% 그리고 C. gracilis KMMCC674의 경우 34.0% (w/w)로 각각 조사되었다. 지질 생산량의 경우 Chaetoceros sp. KMMCC1319는 0.78 g/L, C. fragilis KMMCC1122는 0.40 g/L, C. gracilis KMMCC674는 0.41 g/L로 조사되었고, 지질의 생산성은 Chaetoceros sp.

KMMCC1319는 0.05 g/L/d, C. fragilis KMMCC1122는 0.03 g/L/d, C. gracilis KMMCC674 는 0.03 g/L/d로 조사되었다.

기존의 Chaetoceros종과 비교 하였을 때 생체량은 약 2배이상, 지질 함량은 5~8%

(w/w), 지질 생산량 약 2배, 지질생산성은 2.5~3배로 기존 Chaetoceros보다 높은 결과 값이 나타났다.

(46)

(a)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

3.0 Control (f/2) 9:1 (f/2:mud extract, v/v) 8:2 7:3 6:4 5:5

(b)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Control (f/2) 9:1 (f/2:mud extract, v/v) 8:2

7:3 6:4 5:5

(c)

Time (day)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biomass (g/L)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

3.0 Control (f/2) 9:1 (f/2:mud extract, v/v) 8:2

7:3 6:4 5:5

Fig. 7. 갯벌 추출액 혼합비에 따른 Chaetoceros의 생체량. (a) Chaetoceros sp.

KMMCC1319; (b) C. fragilis KMMCC1122; (c) C. gracilis KMMCC674.

저작자표시

신규 저가배지를 이용한 Chaetoceros 속 3종 미세조류의 최적 배양 및 상업적 이용

朝鮮大學校 大學院

신재생에너지융합학과

金 汶 鍾

신규 저가배지를 이용한 Chaetoceros 속 3종 미세조류의 최적 배양 및 상업적 이용

朝鮮大學校 大學院

신재생에너지융합학과

金 汶 鍾

신규 저가배지를 이용한 Chaetoceros 속 3종 미세조류의 최적 배양 및 상업적 이용

지 도 교 수 김 시 욱

이 논문을 공학석사학위 신청 논문으로 제출함

朝鮮大學校 大學院

신재생에너지융합학과

金 汶 鍾

金汶鍾의 工學碩士學位論文을 認准함

위원장 조선대학교 교수 이 성 행 (인) 위 원 조선대학교 교수 이 현 화 (인) 위 원 조선대학교 교수 김 시 욱 (인)

朝鮮大學校 大學院

TABLE OF CONTENTS

LIST OF TABLES

LIST OF FIGURES

ABSTRACT

제 1 장 서론

제 2 장 실험 재료 및 방법

제 3 장 결과 및 고찰

Chaetoceros

朝鮮大學校大學院

金汶鍾

朝鮮大學校大學院

金汶鍾

朝鮮大學校大學院

金汶鍾

朝鮮大學校大學院