http://dx.doi.org/10.5369/JSST.2016.25.2.143 pISSN 1225-5475/eISSN 2093-7563
반사광 측정 모드에서 금과 은을 사용한 이층 금속 칩과 삼층 금속 칩의 특성 연구
김형진1 · 김창득2 · 손영수1,+
Characteristics of Gold and Silver Based Bi- and Tri-metallic SPR Chip in the Intensity Measurement Mode
Hyungjin Kim1, Chang-duk Kim2, and Young-Soo Sohn1,+
Abstract
Characteristics of the conventional gold (Au) surface plasmon resonance (SPR) chip, bi-metallic(Au/silver (Ag)) SPR chip, and tri- metallic(Au/Ag/Au) SPR chip were investigated and compared in the intensity measurement mode for the enhancement of SPR image sensor reactivity. Reflectance curves of the Au, bi- and tri-metallic SPR chips were acquired in phosphate-buffered saline (PBS) solution and were compared. The line width of the reflectance curve of the bi-metallic chip was the narrowest among the three different types of the chips. Also, the tangential slope of the bi-metallic chip was steeper than those of the other chips. Various concentrations of bovine serum albumin (BSA) were utilized in the SPR experiment. As a result, among the above three chips reflectance variation value of the bi-metallic chip was the largest.
Keywords: SPR image sensor, Intensity measurement mode, Bi- and tri-metallic SPR chip
1. 서 론
전세계적인 고령화로 인해 의약품 수요가 증가함에 따라 세 계 의약품 시장이 2020년 1조 3000억 달러에 다를 것으로 전망 되고 있다[1]. 현재 세계 의약품 시장을 차지하고 있는 기업의 대부분이 미국과 유럽에 편중되어 있다. 최근 정부에서도 신약 개발의 중요성을 인지하고 신약 개발에 대한 투자 정책을 내놓 고 있으며, 신약 개발을 위해 여러 기업이 연구 개발 중에 있다 [1,2]. 신약 개발의 대부분을 차지하는 바이오 의약품은 Antibody- Drug Conjugate (ADC), 단백질 융합, 단백질 재조합 등을 통해 이루어진다[3]. 이런 처리의 대부분을 지금까지는 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)와 같은 방법을 이용하였다[4,5].
하지만 이 방법으로 결과 값을 얻기 위해서는 형광이나 별도의
표식을 붙여야 하는 표지 방식으로 표지를 붙이기 위해서 여러 가지 전처리 과정이 필요하다. 이 방법은 실험 과정이 복잡할 뿐만 아니라 많은 시간과 소요 비용이 발생된다. 따라서 이런 표지 방식의 단점을 해소하기 위한 방법으로 비표지 방식이 사 용되며, 그 대표적인 방법이 surface plasmon resonance (SPR) image 센서이다[6-8]. SPR image 센서는 한번에 다량의 물질을 선택적으로 탐지해낼 수 있다[6-8]. 또한 실시간으로 탐지가 가 능하며 pg/ml까지 탐지해 낼 수 있는 고감도 센서이다[4-6]. 그 리고 SPR image 센서는 입사각을 조정할 필요가 없기 때문에 소형화에 유리한 장점이 있다. SPR 센서의 분석은 Fig. 1에서 보는 바와 같이 여러 채널을 구성하여 사용할 수 있다. Fig. 1 에서 SPR image의 크기는 가로 0.81 cm, 세로 1.01 cm로 1개의 spot 을 지름 280 μm로 할 경우 1000개의 spot으로 사용 가능 하다. 1개 채널 부분만큼의 spot은 대조군(reference)으로 사용 하고, 나머지 채널은 샘플 채널로 사용할 수 있어 외부 환경에 의한 신호 간섭을 대조군을 사용함으로써 제거할 수 있다.
기계적 움직임이 없고 쐐기 빔을 사용하지 않는 일반적인 SPR image 센서는 공명각 변화를 측정하기 보다는 반사광 변화를 측 정하여 생분자 간의 상호작용에 대한 정보를 탐지한다. 반사광 측정 모드에서 동일한 굴절률 변화에 대해 최대의 반사광 변화 값을 얻기 위해서는 반사도 곡선에서 최대 기울기를 갖는 곳에 광원을 고정시키고 반사광을 측정하면 센서의 감도를 높일 수 다[6-8]. 최근 연구 결과에 의하면 반사광 변화를 측정하는 방 법은 일반 금(Au) 칩을 사용하기 보다는 Au와 은(Ag)을 함께
1대구가톨릭대학교 의공학과(Dept. of Biomedical Engineering, Catholic University of Daegu)
St. Dominic Hall, 13-13 Hayang-ro, Hayang-eup, Gyeongsan-si, Gyeongbuk 38430, Korea
2 경북대학교 물리학과 (Dept. of Physics, Kyungpook National Unversity) 80 Daehakro, Bukgu, Daegu, 41566, Korea
+Corresponding author: [email protected]
(Received : Feb. 15, 2016, Revised : Mar. 28, 2016, Accepted : Mar. 30, 2016)
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사용한 이층 금속 칩을 사용하는 것이 더 좋은 반응성을 나타 냄을 증명하였다[9,10]. Au 칩 제작 시 일반적으로 Au는 유리 와의 접착력이 좋지 않아 Au와 유리 사이에 접착력이 좋은 크 롬(Cr)을 사용하여 제작한다. 또한 최근에는 이층 금속 칩의 Ag 와 유리 사이에 Cr과 Au를 추가시켜 칩의 안정성을 증가시킨 연구가 보고된바 있다[8].
본 연구에서는 Au와 Ag를 사용한 이층 금속 칩과 안정성을 증가시키기 위해 Au를 추가한 삼층 금속 칩, 일반적으로 많이 사용하는 Au 칩을 사용하여 SPR 반사도 곡선의 최대 기울기와 선 폭(Full Width at Half Maximum (FWHM)), 반사광 폭을 비 교하였다. 각 칩에 대해서 bovine serum albumin (BSA) 농도의 변화에 따른 공명각 변화량과 최대 기울기 지점에서의 반사광 변화량을 분석하고, 이를 비교 하였다. 또한 이층 금속 칩과 삼 층 금속 칩의 실험 후 칩 표면을 비교하고, 오랜 시간(8 시간) 실험을 진행 할 경우 칩의 안정성을 비교 하였다.
2. 연구 방법
2.1 SPR 센서 시스템
본 연구에 사용된 SPR 센서 시스템은 Kretschman configuration 을 기반으로 하고 있다[11]. 파장 770 nm의 LED(Opnext Inc., Japan) 광원을 사용하였고, 표면 플라즈몬 공명 현상이 나타나기 위해서 는 표면 플라즈몬의 파수 벡터와 일치하는 빛의 표면 성분이 입 사되어야 하므로 광원을 p-편광 시켰다. p-편광된 쐐기 빔 형태 로 프리즘(BK-7, 원통형)을 통과하여 센서 칩에 도달 후 2D- CMOS(1,280 × 1,024 pixel, IDS Co., Germany) 에 입사된다. 빔 의 크기는 Fig. 1에서처럼 가로 0.81 cm, 세로 1.01 cm이며, 샘 플은 peristaltic pump를 이용하여 30 μl/min의 유속으로 주입하 고 탈기 장치를 이용하여 기포를 제거한 후 SPR 센서로 주입된다.
제작한 SPR 칩은 기판으로 프리즘과 동일 재료인 BK-7(12 mm × 12 mm × 0.3 mm) 유리를 사용하였으며, 60
oC 의 piranha 용액(H
2SO
4: H
2O
2= 2:1) 으로 1차 세척한 후 아세톤, 메탄
올, 초정수 용액 순서로 초음파 세척기를 이용하여 세척 후 금 속을 증착하였다. 금속은 e-beam evaporator를 이용하여 증착하였다.
실험은 SPR 칩을 센서 시스템에 장착하고, phosphate-buffered saline (PBS) 용액을 주입하여 반사도 곡선을 비교 하였다. PBS 용액을 주입한 후 평형 상태에 이르면 PBS 용액에 희석한 BSA 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 를 각각 500 μl씩 샘플 채널에 주입하였다. 실험은 3회 동일하게 반복 실험하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 SPR 반사도 곡선 특성 비교
Fig. 2 는 PBS 용액에 대한 Cr (2 nm) / Au (50 nm) 칩, Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩, Cr (2 nm) / Au (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩의 반사도 곡선을 나타내었다. Fig. 2 를 통해 공명각 지점의 반사광부터 곡선이 시작되는 최대 반사 광까지의 반사광 세로 폭은 Cr (2 nm) / Au (50 nm) 칩이 64.893%
로 제일 크다는 것을 확인 할 수 있다. 하지만 선 폭은 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이1.01°로 가장 작고, Cr (2 nm) / Au (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 1.06°, Cr (2 nm) / Au (50 nm) 칩이 1.60°로 가장 크다. 따라서, Ag가 첨가된 SPR 칩의 반사도 곡선 선 폭은 좁아진다는 것을 알 수 있다. 그 결 과 반사도 곡선의 접선의 최대 기울기는 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 79.97032%/°로 가장 크게 나타났다. 그 리고 Cr (2 nm) / Au (50 nm) 칩(60.36458%/°)과 Cr (2 nm) / Au (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩(60.77922%/°)은 비슷한 최 대 기울기를 나타내었다. 따라서 동일한 샘플의 변화에 대해 반 사도 곡선 접선의 최대 기울기 지점에 광을 고정시키고 반사광 의 변화를 측정하는 반사광 측정 모드에서는 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩을 사용하는 것이 다른 칩들에 비해 가장 큰 변화를 측정할 수 있을 것이다.
Fig. 1. SPR image area shone by incident beam. Fig. 2. Reflectance curves of the Au SPR chip and bi-metal(Ag/Au)
SPR chip and tri-metal(Au/Ag/Au) SPR chip.
3.2 공명각 변화량 및 반사광 변화량 비교
SPR 센서 시스템에 PBS 용액을 주입하여 평형을 이루게 되 면, PBS 용액에 용해된 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 의 BSA에 대한 반응을 측정하였다. 일반적으로 BSA는 소수성 인 Au와 잘 반응하며, 단백질 정량에 사용한다[12,13]. 1개의 채 널에는 PBS 용액만 주입하여 대조군으로 사용하였으며, 다른 1 개의 채널에는 BSA를 주입하였다. 샘플 채널 출력에서 대조군 채널 출력을 빼줌으로써 외부 환경에 의한 신호 변화를 제거 하 였다. PBS 용액을 기준으로 하여 BSA 농도에 따른 공명각 및 최대 기울기 지점 반사광 변화량을 3회 측정하였으며, 그 평균 값을 Table 1에 나타내었다. 공명각 변화량 3회 평균 값은 Fig.
3(a) 에서 보는 바와 같이 Cr (2 nm) / Au (50 nm)의 칩은 10 ng/
ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 에 대해 각각 0.00506°, 0.00784°, 0.01482°, 0.03723° 변하였다. 이는 동일한 BSA 농도에 대한 다 른 칩의 공명각 변화량과 비교하여 가장 큰 변화량을 나타내었 다. 최대 기울기 지점 반사광 변화량 3회 평균 값은 Fig. 3(b)에 서 보는 바와 같이 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm)의 칩 이 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml의 BSA농도에 대해 각각 1.195530%, 1.552617%, 2.183037%, 4.18827%로 다른 칩 의 최대 기울기 지점에서의 반사광 변화량과 비교하여 가장 큰 변화를 나타내었다.
3.3 이층 금속 칩과 삼층 금속 칩의 실험 후 칩 표면 비교
Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩과 Cr (2 nm) / Au (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩은 실험 시간 8시간 종료 후 장비에서 꺼내었으며, 각 3개의 칩을 이용하여 실험한 모습 모 두 Fig. 4에서 볼 수 있듯이 금속 칩 표면의 일부가 떨어져 나 간 모습을 나타내었다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 삼층 금속 칩 이 이층 금속 칩에 비해 금속이 덜 떨어진 모습을 나타내었다.
오랜 시간 장비에 장착하여 사용하기에 Cr (2 nm) / Au (2 nm) Table 1. Variation of SPR angle and reflectance according to BSA concentration
BSA concentration 10 ng/ml 100 ng/ml 1 µg/ml 10 µg/ml
Cr (2 nm) / Au (50 nm)
ΔSPR angle(º)
STDEVx3=0.00019987 0.005059 0.007836 0.014824 0.037234
ΔReflectance(%)
STDEVx3=0.02642970 0.378283 0.628867 1.1068 2.666127
Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm)
ΔSPR angle(º)
STDEVx3=0.00025949 0.003029 0.008071 0.01332 0.03258
ΔReflectance(%)
STDEVx3=0.02998617 1.195530 1.552617 2.183037 4.188270
Cr (2 nm) / Au (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm)
ΔSPR angle(º)
STDEVx3=0.00026065 0.002011 0.003736 0.006226 0.013893
ΔReflectance(%)
STDEVx3=0.01667381 0.365800 0.557853 0.897530 1.461630
Fig. 3(a). Comparison of SPR resonance angle variation of the Au SPR chip with bi-metallic(Ag/Au) SPR chip and tri-metal- lic(Au/Ag/Au) SPR chip.
Fig. 3(b). Comparison of reflectance variation of the bi-metallic(Ag/
Au) SPR chip with Au SPR chip and tri-metallic(Au/Ag/
Au) SPR chip.
/ Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 더 안정적이지만 두 칩 모두 재사용하기에는 어려운 모습을 나타내었다.
3.4 이층 금속 칩의 Au와 Ag의 비율 변화
Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 금속 비율의 칩과 Cr (2 nm) / Ag (25 nm) / Au (25 nm) 금속 비율 칩의 PBS 용액에 대 한 SPR 반사도 곡선을 나타낸 결과 Fig. 5(a)에서 보듯이 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 Cr (2 nm) / Ag (25 nm) / Au (25 nm) 칩보다 반사광 세로 폭은 15.828%만큼 줄었지만 선 폭은 0.80°만큼 줄어듦으로써 최대 기울기를 Cr (2 nm) / Ag (25 nm) / Au (25 nm) (74.469%/°)보다 5.50132%/°증가 시켰 다. 최대 기울기 지점 반사광 변화량을 굴절률에 따라 비교한 결과 Fig. 5(b)에서 보듯이 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 더 큰 반사광 변화량을 나타내었다. 이는 Ag의 비율이 증 가함에 따라 선 폭이 줄어들어 반사도 곡선에서 접선의 최대 기 울기가 증가하였기 때문으로 판단된다.
4. 결 론
본 연구에서는 SPR image 센서의 감도를 향상시키는 방법으 로 최대 기울기 지점 반사광 변화량의 반응성이 큰 칩을 제작 하기 위해 일반 Au 칩과 Au와 Ag를 동시에 사용한 이층 금속 칩, 이층 금속 칩의 안정성을 증대시키기 위해 Au 2 nm를 Cr 과 Ag 사이에 추가한 삼층 금속 칩을 비교 하였다. 일반 Au 칩 과 이층 금속 칩, 삼층 금속 칩의 특성 비교를 위해 PBS 용액 에서 SPR 반사도 곡선을 얻고, 최대 기울기를 비교하였다. 비 교 결과 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩 (79.97032%/°) 의 최대 기울기가 가장 컸다. 또한 농도 별 BSA 실험 결과 공 명각 변화량은 Au 칩이 가장 컸지만, 최대 기울기 지점 반사광 변화량은 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 가장 크 게 나타났다. 이층 금속 칩과 삼층 금속 칩의 접착성 비교 결과 삼층 금속 칩이 더 좋긴 하였지만 일부 금속이 떨어져 재사용 은 불가한 것으로 판단되었다. 이층 금속 칩에서 Au와 Ag의 비 율을 다르게 한 칩 비교에서 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩이 Cr (2 nm) / Ag (25 nm) / Au (25 nm) 칩 보다 최대 기울기도 크고, 굴절률 변화에 따른 최대 기울기 지점 반사광 변화량도 더 큰 결과를 나타내었다. SPR image 센서에서 샘플 의 변화를 탐지해내는 최대 기울기 지점 반사광 변화량을 Au와 Ag의 혼합 칩을 사용하고, Au에 비해 Ag의 비율이 높은 Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm) 칩을 사용하는 것이 유리함을 확인하였다. Ag의 반사도 곡선은 Au의 반사도 곡선에 비해 선 폭이 좁게 나타나는데 이는 Ag의 유전 상수 허수 부분이 큰 값 을 가지기 때문이다. 이러한 특성을 가진 Ag를 SPR 칩에 첨가 하면 선 폭이 좁은 반사도 곡선을 얻게 되어 기울기가 가파른 Fig. 4. Surface images of (a) tri-metallic [Cr (2 nm) / Au (2 nm) / Ag
(40 nm) / Au (10 nm)] SPR chip, (b) bi-metallic [Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm)] SPR chip after experiment(8 hours).
Fig. 5(a). Reflectance curves of the Cr (2 nm) / Ag (25 nm) / Au (25 nm) chip and Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm).
Fig. 5(b). Comparison of reflectance variation of Cr (2 nm) / Ag (25
nm) /Au (25 nm) with Cr (2 nm) / Ag (40 nm) / Au (10 nm).
접선의 기울기를 얻게 된다. 반사광 측정 모드에서는 반사도 곡 선의 접선 기울기가 가장 가파른 입사각에 광원을 고정하고 반 사광을 측정하므로, 접선의 기울기가 가파르면 가파를수록 동일 한 굴절률의 변화에 대해 큰 반사광 변화를 유도한다. 따라서 SPR 칩의 제조에 있어 반사도 곡선의 선 폭을 좁게 할 수 있는 재료(예, Ag)의 함량 비율을 높이고 반사광 측정 모드로 측정하 면 상대적으로 높은 감도로 생분자를 측정할 수 있을 것이다.
감사의 글
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (NRF- 2013R1A1A2010028).
REFERENCES
