Anti-diabetic Mechannism Study of Korean Red Ginseng by Transcriptomics

약학회 지 제 52 권 제 5 호 345~354 (2008) Yakhak Hoeji Vol. 52, No. 5

전 사 체 프 로 파 일 을 이 용 한 고 려 홍 삼 의 항 당 뇨 기 전 연 구

원해단

•

신은정

•

정성현

^

경희대학교 약학대학 약물학 임상약학교실

(Received M ay 1, 2008： Revised A ugust 14, 2008)

Anti-diabetic M echannism Study of Korean Red Ginseng by Transcriptom ics

Hai Dan Yuan, En Jung Shin and Sung Hyun Chung^

Pharmacobgy and Clinical Pharmacy Lab., College of Pharmacy, Kyung Hee University, Seoul 130-701, Korea

A b s tr a c t — T h is stu d y was designed to in vestigate th e a n ti-diabetic e ffe ct and m echanism o f K orean re d ginseng e x tra c t th ro u g h tra n scrip to m ics in C 57B L/K sJ db/db m ice. T h e db/db m ice w e re ran d o m ly divided in to six groups: diabetic co n tro l group (D C ), red ginseng e xtra ct lo w dose group (R G L, 100 m g/kg ), red ginseng e x tra c t high dose group (R G H , 200 m g/kg), m e tfo rm in group (M E T , 300 m g/kg), glip izid e group (GPZ, 15 m g /kg ) and pioglitazone group (PIO, 30 m g/kg ), and tre a te d w ith drugs once p e r day fo r 10 w eeks. A t th e end o f tre a tm e n t, w e m easured blood glucose, in su lin , h e m oglobin A le (H b A lc ), trig ly c e rid e (T G ), adiponectin, le p tin , n o n -e ste rifie d fa tty acid (N E F A ). R G L -tre a te d g ro u p lo w e re d th e blood g lu ­ cose and H b A lc le ve ls b y 19.6% and 11.4% com pared to those in diabetic co n tro l group. In addition, plasm a adiponectin and le p tin levels in R G L -tre a te d groups w e re increased b y 20% and 12%, respectively, com pared to those in diabetic co n tro l.

M orp h o log ica l analyses o f liver, pancreas and epidydim al adipose tissu e w e re done by h e m a to xylin -e o sin staining, and pan­

creatic isle t in su lin and glucagon levels w e re detected b y d o u ble -im m unofluorescence staining. R G L -tre a te d group revealed h ig h e r in s u lin co n ten ts and lo w e r glucagon co n ten ts com pared to diabetic co n tro l. To elucidate an a ctio n m echanism o f Korean red ginseng, D N A m icro a rra y analyses w e re p e rfo rm e d in liv e r and fat tissues, and w e s te rn b lo t and R T -P C R w e re conducted in liv e r fo r validation. A ccording to h ierarchical c lu s te rin g and p rin cip a l com ponent analysis o f gene expression Korean red ginseng trea te d groups w e re close to m e tfo rm in tre a te d group. In summ ary, K orean re d gin se ng lo w e re d th e blood glucose level th ro u g h p ro te ctin g d e stru ctio n o f is le t cells and s h iftin g glucose m eta b o lism fro m hepatic glucose p ro ­ d u ction to glucose u tiliz a tio n and im p ro vin g in s u lin s e n s itiv ity th ro u g h enhancing plasma a d iponectin and le p tin levels.

K e y w o r d s □ K orean red ginseng, C 5 7B L/K sJ db/db m ice, diabetes, D N A m icro a rra y

당뇨병

(diabetes mellitus)fi

：대사성질환으로서 고혈당을특정 으로하며 췌장에서 인슐린분비가부족하거나인슐린에대한감 수성이 떨어져 탄수화물 대사에 이상이 생기는 질환이다

.^

최근옴식의 서구화와더불어 비만환자가급증하면서 제2형당 뇨병이 급증하는추세는사회적인문제로대두되고었는데현 재한국의 경우도

2030

^{년에는전체 당뇨병 환자수가약}

722

^만 명으로늘어날것이라고추정한바있 다 현 재 임상에서 많이 사용하고 있는경구용 당뇨제제둘로는

a-glucosidase

^억제제

, sulfonylure^l '5^, biguanide^)

으

^ , peroxisome proliferator- activated receptor-y(PPAR-y)

효능제등이 있다

.®'®

하지만이런

논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-961-0373 (팩스) 02-957-0384 (E-mail) [email protected]

약물들을장기적으로사용 할때저혈당

,

체중증가및간득성 등부작용들이 있다고보고되어 었다

7■

모

®

한국을비롯한여러아시아의 나라들에서는민간요법으로여러 가지 약초들을당뇨병 및여러질병의 치료에 많어시용하쉬 왔 다

.

다양한연구에따르면

,

고려인삼은허약한체질

,

숙취

,

폐경

,

월경불순

,

^{초기 당뇨병}

,

^빈혈

,

^{간기능악화}

,

^{각중독성물질에 기} 인한중득

,

괴로

,

추위

,

스트레스

,

산후조리

,

체력쇠뢰 등에효능 이있옴이알려져있다

.

난■피고려홍삼은인삼뿌리

(Panax ginseng C.A. Meyer

)을찌서건조시킨 것으로서고혈압

,

동맥경화

,

항암

,

항당뇨작용이 있다고보고가되어있다

.^

^후

^®

^{하지만고려홍삼의} 항당뇨작용은명확히 밝혀지지 않고있다

.

^{따라서본연구에서} 는 고려홍삼 물추출물과 기존의 당뇨치료제들인

metformin, glipizide, pioglitazone# db

미우스에투여한후간에서의유전자 발현잉상을비교분석하여고려홍삼의항당뇨기전을살펴보았다

.

345

346 원해단 ■ 신은경 • 정성현

실험재료 및 방법

실험재료

고려홍삼물추출물은

KT&G(Seoul, Korea

)에서 공급받아사 용하였다

.

고려홍삼물추출물 1 0

g

을

■

²

/

물에 희석하식동결건 조하였다

.

십험 동물 및약물루여

C57BL/KSJ db/db 5

주령의 마우스를 한국오리엔트사로부터 구입굶}쉬 2주동안 실험설환경에 적응시킨후실험에 하였 다

.

실험군은

Diabetic control(DC);

고려홍삼액스

100 mg/kg

투 여군

(RGL);

고려홍삼엑스

200 mg/kg

투여군

(RGH); metformin 300 mg/kg

투여군

(MET); glipizide 15 mg/kg

투여군

(GPZ);

pioglitazone 30 mg/kg

투여군

(PIO

)으로나누며 각약물은경구 로 1 0주간투여하였다

.

경구 당부하 시험

실험동물을

12

시

?]:

절식한다옴

1.5 g/kg

의

glucose

를경구투 여한후

(

뿐

, sag-, eog-, 90

분그리고 1 2 0분대에안와정맥으로 부터 혈액을채취하였다

.^ ^ ^ 5,000 rpm

에서

5

분간원심분러하여 얻어진 혈장을 이용하여 혈중포도당농도를

glucose oxidase method

^{로측정하였다}

.

혈액 지표분석

혈액지표분석을위한혈액 채취는 1 2시

?t

절식후실시하였 다

.

^{안와정맥을 통해 얻어진전혈을}

5,000 rpm

^에서

5

^분간원심 분리한후혈청을분석에사용하였다

.

혈중포도당능도는

glucose oxidase method(Trinder method

)을사용하여 족정하였으며 흡 광도 죽정은

UV Spectrophotometcr(U-3210, HITACHITM, Japan

)을사용하였다

.

혈중인슐린농도는마우스

insulin ELISA kit(Shibayagi, Japan

)을 구입하여

ELISA reader(Labsystems, Finland

)로 죽정하였다

.

당화혈색소는

Hemoglobin Ale kit (BioSystem SA, Spain)

을

:

이용하여 죽정하였고 혈중중성지방

(triglyceride, TG

)은영동제약에서

kit

를구입하여 죽정하였다

.

혈중

adiponectin

은 마우스

adiponectin ELISA kit(Adipogen, Korea

)을구입하여 죽정하였으며 혈중

leptin

은마우스

leptin ELISA kit(LINCO research, USA

)을구입하여 측정하였다

.

혈 중유러지방산

(non-esterified fatty acid, NEFA)■

은

" kit

(에이켄화 학

(

주

), Japan

)을구입하식 측정하였다

.

조직의 형태학적 관찰

쥐에서 적출한 간

,

부고환지방

,

췌장조직울 1 0

% neutral buffered formalirri

：사용하여고정하였다

.

이루탈수및포매 과

정을거쳐 파라핀볼럭을 제작하고두께

5|om

의관상절편으로

제작한후

xylene

으로파라핀을 제거시키고

100%, 95%, 90%, 80%, 70%

^알

S

^{올로친수화시켰다}

.

^{염색방법_녔 는}

hematoxylin

과

eosin

염색으로 탈수파정을거쳐

Canada balsam

으로 봉입 하고광학현미경

(Olympus, Japan)^

^{관찰하였다}

.

면역형광염색 방법으로추II장 islet 에서 insulin 과 glucagon의 관찰

두께

5i

께 관상 절편을

xylene

으로 파라핀을 제거시키고

, 100%, 95%, 90%, 80%, 70%

알코올로 친수화 시켰다

. PBS

로 씻은 후0

.

¹

% tripsin

으로 단백질 구조를 회복시키고

primary antibody

인

goat anti-insulin(Santa Cruz, USA

)을

1: 75

로 희석 하여 붙이고 이어서

secondary antibody

인

donkey anti-goat IgG-FITC(Santa Cruz, USA

)을

1:200

으로 희석하여 붙였으며 같은 조직에 두 번째

primary antibody

^인

rabbit anti-mouse (Santa Cruz, USA

)를 붙이고 두 번째

secondary antibody

인

goat anti-rabbit IgG-TRITC(Santa Cruz, USA

^{)을 붙인후 형광} 현미경

(Olympus, Japan

)으로관찰하였다

.

R N A 분리

조직에서

total RNA

는

guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chroloform

분리방법을이용하였다.오어물층에있는

total RNA

는이소프로핀율을이용하쉬침전시켜분러한

RNA

는

260 nm

와

280nm

의파장에서 흡광도를측정하쉬 정량하였다

. Mouse

로 부터 추출한

total RNA

의상태를 확인하는방법으로

pH 8.0

의

RNase-free watei

에서

OD260/280

비율이

1.8

이상

, 28S rRNA

와

18S rRNA

비율기

1.6

이싱쉴경우가장최적의

RNjW-

관단하였다

.

M icroarray analysis

Agilent 60-mer oligo Microarray protoc

이에 따라

cy3

또는

cy5

가결함된

aminoallyl-UTP

로준버된

RNA

룰증폭 시킨 뒤

oligo micaroarray(Mouse 44 K

)와

60X

에서

16

시간 동안

hybridization

시켰

^. Hybridization^! chip& non-confocal laser scanner

인

GenePix4000B(Axon Instruments, CA, USA

)로

scanning

하였다

. Scanning

하여얻온

image

는

16 bit TIFF file

로 저장한후

GenePix v6.0 software

롤사용하여

image

분석을하 였다

. Locally weighted scatter-plot smoother(LOWESS) nor­

malization

방법을 사용하여

normalization

하였다

. Microarray

데이터의 분석을 위해서

hierarchical clustering, principal component analysis

방법을사용하였으며 유전자의군접희를통 해유사한발현양상을보이는그룹을확인하였다

.

분석 프로그 램은

multiexperiment viewer(MeV) software

^{를이용하였다}

.

간조직에서 A M P K 발현측정

간 조직에서

5'-AMP activated protein kinase(AMPK)

30 60 90 ¹²⁰

DC

i i i s

우

J _ H

m

RGL RGH m i A GPZ PIO

Fig. 1 - Effects o f RG, M ET, GPZ & PIO on oral glucose tolerance te st (A). Anim als fasted o ve rn ig h t w ere given on oral glucose load of 1.5 g/

kg a fter oral adm inistration of c ith e r vehicle o r RG, M E T , GPZ, PIO. (B) Area under the blood-glucose co ncentration cu rve was measured ove r 120 m in (AUC-120 m in). Values represent as m ean± S .E . (n = 4 ). *p<0.05, **/)< 0 .0 1 vs. DC.

Vol. 52, No. 5, 2008

선사체 프로과i i 을 이용한 고려 동삼의 항당뇨 기견 연구 347

밖헌을 확인하고자

Western blot

방법으로

phospho-5'-AMP activated protein kinase(P-AMPK), AMPK, phospho-acetyl CoA carboxylase(P-ACC), acetyl CoA carboxylase(ACC)

를 측 정하였다

.

단백질분석을 위해 간조직을

lysis buffer

률이용하 여균질화하였다

.

단백질 정량은

Bio-Rad assay reagent(Bio- Rad, USA)

^{를이용하여측정하였으며}

,

^{정량한단백질}

20ug

^을8

% SDS-PAGES.

^{분리하였다}

.

^이후

geh3; membrane(Milipore, Cat.

No: IPVHOOOlO)

에

transfer

하고

5% skim milk

로상온에서

1

시

blocking

하였으며

1:3000

버율로희석시킨

primary antibody (P-AMPK, AMPK, P-ACC, ACC)

와

4°C

에서

overnight

하였다

. Tris-buffered saline tween-20(TBST)

로

4

번

washing

한 후

1:5000

의비율로희석시킨

secondary antibody

와상온에서 1시 간반응시켰다

.

이후

TBST

로

4

번

washing

하고

ECL solution (Amersham, Sweden)

^{을 이용하여}

X-ray

^될름에

developing

^하 였다

.

간조직에서

RT-PCR

DNA microarray

실험을통하여 특이적인발현을보이는유선 자를선별하여

RT-PCR

을

:

진행하였다

.

총

RNA 10

¹보

g

을

Moloney murine leukemia virus transcriptasefi]- Oligo(dT) 15 primerii-

이용하식 역전사하였다

. Primer

의중류및서열은다옴과 같다

. SREBPlaCSterol regulatory element-binding proteins)

의주형 사서열은

GCG CTA CCG GTC TTC TAT CA,

비주형사서 열은

TGC TGC CAA AAG ACA AGG G

：

FAS(Fattv acid synthesis)

의주형사서열은

GAT CCT GGA ACG AGA ACA C,

비주형사 서열은

AGA CTG TGG AAC ACG GTG GT;

SCDKStearovl CoA desaturase)

의수형사 서열은

CGA GGG TTG GTT GTT GAT CTG X

미주형사 서열은

ATA GCA

CTG TTG GCC CTG GA

：

GPAT(Glvcerol-3-phosphate acyltransferase)

^{의주형사 서열은}

GGT AGT GGA TAC TCT GTC GTC CA,

비주형사 서열은

CAT CAG CAA CAT CAT TCG GT; CD36

의주형사 서열은

TCC TCT GAC ATT TGC AGG TCT ATC,

버주형사서열은

GTG AAT CCA GTT ATG GGT TCC AC; PPAR-a(Peroxisome proliferator activated receptor-a)

^{의주형사서열은}

CCC TGA ACA TCG AGT GTC GA,

비주형사서열은

CTT GCC CAG AGA TTT GAG GTC CT; c m

의주형사 서열은

ATG GTC AAC CCC ACC GTG,

비주형사서열은

TTA GAG TTG TCC ACA GTC GGA GA;

PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase)

의주형사서열은

ATG CCT CCT CAG CTG CAT A,

^{비주형사 서열은}

TTA CAT CTG GCT GAT TCT CTG TT

이다

. PCR

반응 조건은

SREBP-la, FAS, PPAR-a, CPN, PEPCK21

경우

95°C

에서

30

초동안변성

, 57°C

에서

30

초동안붙임

, 72T

에서

30

초동안연 장을하셔 충

30 cycle

^하였고

SCD1, GPAT

^의경우는

95T

^에서

30?'-

동안변성

, 57T

에서

30

초동안붙임

, 72°C

에서

3Q

초동안연 장을하여총

26 cycle

^하였으며

CD36

^의경우는

95°C

^에서

30

^초 동안변성

, 51°C

에서

30

초동안붙임

, 72°C

에서

30

초동안연장을 하식총

30 cycle

하였다

.

이후반응생성물을

0.5 \xiJml ethidium bromide

로염색된

1% agarose gel

을이용하여

100 V

에서 전기영

동하였다

. CPN

은증폭된유전자들의대조군으로사용되었다

.

자료분석 및통계 처리

모든실험 결과는평균±표준오차로나타내었다

.

당뇨대조군

(DC)

과비 교 여 통계적 유의성을

Student's Mest

로 처리하였으 며

/)<0.05

이하인 경우유의성 있는차이가 있는 것으로관정 하였다

.

(A)

700

(B)

0

^

0

0 8

^

4

2 L

H T Z )

€ G G E P

2

D R R M G P

348 원해단 • 신은정 • 정성현

실험결과 및 고찰

경구 당부하시험

Fig. 1

은마우스에

10

주간약물을경구투여한후측정한경구 당부하시험 결과를나타낸 그림이다

. Fig. 1A

는

120

분동안의

혈당번화를 나타낸 것이며

B

는각그룹의 곡선 하면적

(area

under the curve, AUC

^{)을비교한그림으로당뇨대조군과버교} 시

RGL, MET, PIO

그룹에서 곡선 하면적이 감소함을 알수 있었다

.

혈액지표분석

Table I

은

10

주동안약

iH

경구투여한후

,

^{1 2}시간절식시켜 공복상태의 실험동물에서 전혈을 채취한후측정한포도당

,

인 슐린

,

당화혈색소

,

인슐린저항성지수

(HOMA-IR),

중성지방

,

유리 지방산그리고지방세포에서 분비되는

adipokine

인

adiponectin

과

leptin

의농도률나타낸것이다

.

당뇨대조군에 비해

RGL

투

여군은혈당이

19.8%(^><0.05)

감소하였으며

, RGH

또한 당뇨 대조군에 비해혈당이

18.3%(^<0.05)

감소하였다

.

그러나인슐 린수치는고려홍삼투여군에서 유의적인차이룰나타내지않았 으며

MET

^투여군과

PIO

^{투여군은 당뇨 대조군에 비해 각각}

67.9%#<0.001

)와

56.9%^<0.001)

감소하였다

.

인슐린저항성 지수

(HOMA-IR

^{)는당뇨대조군에비해}

RGL

^{투여군에서}

27.7%

감소하였으며 양성약물 대조군에서 각각

80.8%, 41.1%

^그리고

68.9%

감소하였다

. HbAlc

는당뇨대조군에 비해

RGL

투여군

, RGH

투여군

, MET

투여군

, GPZ

투여군

, PIO

투여군에서 각각

11%, 6.4%, 18.9%, 16.1%, 27.9%

감소하였다

.

지방세포에서 지방분해

(lipolysis

)는인슐린에 의해 억제된다

.

그러나인슐린저항성 상태에서는지방분해가억제되지 못한결 과혈중유리지방산

(non-esterified fatty acid, NEFA

)의수처는 올라가게된다

.

이렇게상승된유리지방산은근육과지방조직으 로포도당미 유입되는것을방해하며간에서 당생성을촉진하게 된다.2 또한장기적인유리지방산의 싱승은췌장에서 인술린분

T a b le I - M etabolic param eters in Korean red ginseng treated db/db mice

Parameter DC R G L RGH M E T GPZ PIO

Glucose (m M ) 15.8±0.9 12 .7± 1 .3 * 12 .9± 0 .4 * 5 .1 ± 0 .4 ** * 7 4 + 2 .1 * * * 6^.8^±0^.6^{* * *}

In su lin (jaU/m/) 240.6±57.1 216.6±18.2 272.1±50.3 143.0±37.0* 302.6 ±28.3 173.9±33.2*

H O M A -IR 168.9±46.3 122.3±22.4 156.0 ±30.0 32.4 ± 1 3 .0 * 99.5±41.3 5 2 ,5 ± 8 .2 *

H b A lc (%) 7.0 ±0 .2 6.2+0.2* 6 .6 ± 0 .3 * 5.7±0.2*=" 5.9 + 0 .2 ** 5 .1 ± 0 .3 ** *

A diponectin (|aU/m/) 3 1 .5± 1 .6 3 8 .0 ± 1 .3 * 32.8+2.1 29.5±2.3 24.9± 2.3 6 1 .9 + 5 .5 **

L e p tin (ng/m/) 54.5 ± 1 .3 58.0± 1.3 57.6+1.1 5 8 .6 ± 1 .4 * 57.0± 0.8

T G (m g/m /) 94.9 ± 9 .4 77.0± 1.6 95.9± 5.2 6 5 .4 ± 4 .9 * 8 0 .9± 9 .0 89.0± 5.8

N E F A (나eqiv/7) 2179.3±78.0 1 8 1 2 .8 ± 4 4 .7 *** 2278.6± 173.3 1936.3 ±204.5 2022.8±442.0 1 5 5 0.4 ± 6 2 .4***

Data are m e a n ± standard e rro r ( n = 4 ). H om eostasis m odel assessm ent was used to calculate an index o f in s u lin resistance as in su lin (나U /m /J x g lu c o s e (m M )/2 2 .5 . *^ < 0 .0 5 , * * ^ < 0 .0 1 , ***/> < 0 .0 0 1 com pared to diabetic co n tro l group.

R G L G P Z PIO

L iv e r

F a t

P a n c re a s

Fig. 2

- M icroscopic vie w of the liver, fat and pancreas sections obtained from DC, RGL, RGH, M ET, GPZ and PIO treated groups. H & E , magnification x 200^.

선사체 프로파일을 이용한 고려 홍삼의 항 당 기 선 연구 349

In s u lin G lucagon In s u lin + G lu c a g o n

DC

비도방해하는결과를 낳는다

.2® Table I

에서

RGL

투여군은당 뇨대조군과비교시혈중유리지방산의 수치가

16.8%

감소하 였다

.

비록고려홍삼은용량의존적으로 혈중유리지방산의 수치 를낮추어주지는못하였지만저용량에서

17%

가꺼의 유리지방 산수치률낮추어주었고이는포도당항상성에 유리한영향을 머칠수있옴을시사하였다

.

또한

RGL

투여군은통계적으

*

유 의하지는않았지만혈중중성지방억시

DC

군에비해

18.9%

갑 소시켰다

.

포도당항성성에다양한영향을미치는지방세포에서 유리되 는

adipokine

인

adiponectin

파

leptin

호르몬의 수처를그룹간버 교해보았다

. apMl, GBP28, AdipoQ

흑은

ACRP30

으로불리우 기도하는

adiponectin

은분자량

30kDa

의유리단백질로비만당 뇨쥐에 투여할경우 간과근육조직에서

AMPK activity

룰촉진 시키고결과지방산산화와인술린 반응성을증가시키는활성이

있옴이알려지고있는물질이다

.

²

^

버만

,

인슐린저항성

,

²형당 뇨

,

대시증후군

,

고지혈증

,

고혈압

,

산화적스트레스를보이는사 람이나탄수화물

JL

함유식이를섭취히는경우혈중

adiponectin

은감소하는경향을보이는반면체중을줄이거나콩단백질

,

괴

N u m b e r o f the significant up- o r dow n-regulated genes in hepatocytes and adipocytes trea te d w ith red ginseng or oral hypoglycem ics

U p-regulated ( > 1.5-fold) D ow n -re g u la tcd ( < 1.5-fold)

L iv e r Fat L iv e r Fat

R G L 1453 3496 1540 3658

K G H 2387 4045 1513 4725

R G L + R G H 461 1410 261 1266

M E T 3383 3352 2333 4006

GPZ 4250 4837 3025 7397

PIO 4942 3973 4511 4944

Vol. 52, No. 5, 2008

350 원해단 • 신은정 • 정성현

오글러타존 같은

PPAR-y agonist

약물을 투여하면 혈중

adiponectin level

^{이증가한다.오야따라서 혈중}

adiponectin

^수치 의증가는인슐린의 작용성이 증가되었다는근거가될수있다

. Table I

^{에서 보듯이}

RGL

^군에서는

DC

^{군에 버해}

adiponectin

^및

leptin

수치가2 0

.

⁶

%,

^{1 2}

.

¹

%

증가되었다

.

이결과로부터 고려홍삼은인슐린작용성을증가시키고지방 산산화를곡진하는물질들인

adiponectin

과

leptin

의혈중농도

률증가시키는활성이있옴을알수있었다

.

조직의 형태학적 관찰

Fig. 2

는홍삼

< > 1 ?h

부고환지방및췌장형태에머처는영향 을살펴본결과이다

.

간조지의

hematoxylin-eosin

염색결과에서 홍삼투여군은

DC

군에서 많이보이는지방구

(lipid droplets)

들 이거의사라진것을볼수있었고지방조직의 염색결과에서는

F ig . 4 - Hierarchical clu ste rin g analysis and principal com ponent analyses of gene expression data. Expression profile data were derived from pooled R N A o f the live rs o f db m ice treated w ith Korean red ginseng and oral hypoglycemics.

0 0

OM 2S4

F ig . 5 - H ierarchical clu ste rin g and principal component analyses o f gene expression data. Expression profile data w e re derived from pooled R N A of the fats o f animals treated w ith red ginseng and oral hypoglycemics.

I OS i

AT!

§

보

i l

전사체 프로과월을 이용한 고려 홍삼의 항당뇨 기견 연구 351

홍삼투여군의 지방

size

가

DC

군에 버하여 현저히 작아졌옴을 알수가있었다

.

췌장조직의 형태학적 관찰결과에서

DC

군마

우스의

islets

은모양이 불규칙적이고구조가파괴된 양상을보

였지만홍삼투여군의

islets

은

DC

군마우스에 비하며모양이나 구조가뚜렸하였다

. Fig. 3

은췌장

islets

에서

insulin

과

glucagon

의발현을면역형광염색하여 관찰한결과이다

. DC

에비품}여홍

삼투여군에서

insulin

^{의발현은증가하였으나}

glucagon

^의발현 은감소하였다

.

이결과는홍삼추출물이 비만성 당뇨의

P-cell

에서

insulin

의분비를촉진시킴과동시에

a-cell

에서

glucagon

의 분비를억 제 함 로 혈당을떨어뜨림을알수었었다

.

Microarray

분석

?H1

서

36,910

개의유전자틀분석한결과

DC

군에 비해

1.5

배 이상높게나타난유전자는홍삼투여군에서

461

개였고반대로

1.5

배이상낮게나타난유전자는

261

개였다

(Table II).

지방에서 는

34,713

개의유전자률분석한 결과홍삼 투여군에서

DC

군에 버해

1.5

배이상높게 나타난유전자는

1410

개였고

1.5

배이상 낮게나타난 유전자는

1266

개였다

(Table II).

그리고간과 지방 에서각각

36,910

개

, 34,713

개의유전자를사용하여

hierarchical clustering analysis

와

principal component analysis

률 하였다

. Hierarchical clusterings

^{：전체유전자의발현양상을분석하여그} 패턴이 버숫한유전자또는투여군을묶어가는방법으로홍삼에 의한유전자발현을기존의 항당뇨약물과비교할수 있다

.

발현 이증가된 것은붉은색으로 발현이 감소한것은 녹색으로나타 내었다

.

간에서는

RGL

투여군과

RGH

투여군의 발 현 양 상 비 숫한것 나 타 났 고 항당뇨약물중에서는

MET

투여군과가 장가까운 것으로나타났다

(Fig. 4).

지방에서는 간의발현 패턴 과는달리

RGL

투여군이

RGH

투여군보다

MET

투여군과더

Tab le I I I - D iffe re n tia lly expressed genes in the liv e r of RG-treated db/db m ice

Accession No. Gene Name Fold Function

UP-regulated

N M J 5 7 2 9 Acyl-Coenzym e A oxidase 1, palm itoyl 1.751 fa tty acid m etabolism PPAR signalling

L38988 Glucokinase 1.451 glycolysis/gluconeogenesis

in su lin signaling

AK083075 L iv e r glycogen phosphorylase 1.5 in su lin signaling

N M 010719 Lipase, horm one sensitive 1.499 in su lin signaling

N M J 1 9 7 0 3 Phosphofructokinase, platelet 1.441 in su lin signaling

glycolysis/gluconeogenesis pentose phosphate

N M _019468 Glucose-6-phosphate dehydrogenase 2 1.502 pentose phosphate

N M 013474 Apolipoprotein A - Il 2.172 PPAR signaling

NM~007980 Fatty acid binding protein 2, intestinal 1.571 PPAR signaling

NM ~ 010634 Fatty acid binding protein 5, epiderm al 1.277 PPAR signaling NM~011978 Solute ca rrie r fam ily 27 (fatty acid transporter), m em ber 2 1.594 PPAR signaling N M J 1 1 9 7 7 Solute ca rrie r fam ily 27 (fatty acid transporter), m em ber 1 2.456 PPAR signaling Down-regulated

N M _013495 C arnitine palm itoyltransferase la , liv e r 0.785 adipocytokin signaling fa tty acid m etabolism PPAR signaling

NM_008061 Glucose-6-phosphatase, catalytic 0.671 adipocytokin signaling

glycolysis/gluconeogenesis In su lin signaling

NM _028994 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (m itochondrial) 0.698 adipocytokin signaling in su lin signaling PPAR signaling pyruvate m etabolism NM _001013367 Protein kinase, AM P-activated, alpha 1 catalytic subunit 0.679 adipocytokin signaling

In su lin signaling N M J 7 8 1 4 3 Protein kinase, AM P-activated, alpha 2 catalytic subunit 0.696 adipocytokin signaling

In su lin signaling

AF374167 Acetyl-Coenzym e A carboxylase alpha 0.75 fa tty acid biosynthesis

in su lin signaling pyruvate m etabolism

N M _007988 Fatty acid synthase 0.762 fa tty acid biosynthesis

In su lin signaling

N M 008509 Lipoprotein lipase 0.737 PPAR signaling

NM _009128 Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 0.639 PPAR signaling

Vol. 52, No. 5, 2008

비숫한양상을띄는것으로나타났다

(Fig. 5).

간에서유전자의 발현

Table III

은간전체 유전자중에서

DC

군에 비하여

1.2

배이 상으로나타났거나0

.

^{8배이하로나타난당뇨관련유전자률선} 별한결과이다

.

이결과에서 고려 홍삼은가에서 탄수화물 대사 에영향을

:

^{주는것으로나타났다}

. Glucokinase(GK), phosphoenol­

pyruvate caboxykinase(PEPCK), glucose-

⁶

-phosphatase(G

⁶

pase) glucose-

⁶

-phosphate dehydrogenase(G

⁶

PD)^ glucose

가

glycogen

으로 저장되는

key enzyme

들이다.페 그중에서

PEPCK

와

G

⁶

pase

는

' gluconeogenesis

과정에촉매 작용을하고

G

⁶

PD

는

pentose phosphate pathway

에작용하는

enzyme

으로

glucose metabolism

에결정적인 작용을한다

.^ ^ '^ ® ^

당뇨병 환자 는간에서

gluconeogenesis

에된:여하는

G

⁶

pase

나

PEPCK

같은

gene

둘의 발현이 증가하고

GK

나

G

⁶

PD

같은

gene

돌의발현은 감소한다，고우'째본연구에서

glycolysis

^관련

gene

^인

glucokinas

^는 발현이

1.451

^{배중가하였고}

pentose phosphate pathway

^에관련

gene

^인

glucose-

⁶

-phosphate dehydrogenase 2

^는

1.502

^배중가 하였다

.

반면

gluconeogenesis

관련

gene

인

PEPCK2

는발현이

0.698

^{배감소하였고}

glucose-

⁶

-phosphatase

^는

0.6

^{기배 감소하였} 다

. Lipogenic gene

인

fatty acid synthase(FAS)

와

steroyl- Coenzyme A desaturase 1(SCD 1

)은 각각

0.762

배와

0.639

배 감소하였다

.

이결과률종합하면고려홍삼은간조직에서 란수화 물과지질의 대사쉬

]

^{영향을미쳐인슐린작용성을증가시키고포}

D C R G L R G H M ET G P Z P IO P-AMPK

AMPK

P-ACC

ACC

F ig . 7 - RT-PCR analyses of S R E B P l-a , FAS, S C D l, GPAT, PPAR- ct, CD36 and PE P C K genes in liver.

도당생성을억제하는활성이 있옴을알수있었다

.

선별된 m arker들의 validation

홍삼의항당뇨활성 작용기전이

metformin

과가장유사하다 는 결론을 근거로

AMPK

를 중심으로

marker

들의 발현을

Western blot

흑은

RT-PCR

로검증하였다

.

간조직에서

AMPK

발현은

Western blot

^{방법으로 측정하였다}

. Fig.

^6에서 보는 바와같이 홍삼은 용량의존적으로

AMPK

룔 현저하게

phosphorylation

시켰으며

ACC

역시 현저하게

phosphorylation

시켰다

. ACC

효소가인산화되면 활성은 떨어지고결과반응생

성물인

malonyl CoA

^{의농도가떨어져지방산산화를위해 미토} 콘드리아로지방산을전달하는역할을수행하는효소인

carnitine palmitoyltransferase-l(CPTl

^{)의활성이증가하여결과지방산의} 산화가촉진된다.따라서 홍삼의 간에서

AMPK

를인산화시킨 다는실험결과는지방산산화를촉진하여

TG

^{측적을저해하여} 인슐린번웅성을높인다는기전으로설명이가능하다

.

이어서홍 삼의

AMPK

활성화 결과를 검증하기 위해

target gene

들

(lipogenesis, lipolysis, gluconeogenesis

관련유전자들)의 발현을

RT-PCR

로측정한결과

(Fig. 7)

홍삼은

SREBPla, FAS, SCDl,

GPAT

등지방 합성에관련되는

gene

둘의 발현을현저하게 억

D C R G L R G H M E T G P Z P IO

C PN

F ig . 6 - W estern b lo t analysis o f phospho-AM PK , A M P K , phospho- ACC, ACC levels in liver.

352 원해단 • 신은정 • 정성현

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