Characterization of Heavy Metal Tolerant and Plant Growth-Promoting Rhizobacteria Isolated from Soil Contaminated with Heavy Metal and Diesel

(1)

중금속 및 디젤 오염 토양에서 분리한 중금속 내성 식물 생장 촉진 근권세균의 특성

이수연, 이윤영, 조경숙*

이화여자대학교환경공학과

Received: June 26, 2021 / Revised: August 5, 2021 / Accepted: August 5, 2021

서 론

토양은생태계를구성하는필수요소로^,토양내에는미량 의중금속이식물의생장에유해하지않은 농도로존재한 다^.그러나산업활동의증가와도시개발로인해토양내축 적되는중금속으로인한오염이심화되고있다^.토양내중 금속의독성은자연생태계및환경에유해한영향을끼쳐 잠재적인위협이된다^.토양에축적된중금속은토양에잔류

하는시간이길며^,식물에흡수된후이를섭취한동물및인 간의체내로부터배출되지않고먹이사슬의상위단계로올 라감에따라고농도로생물농축된다^.또한중금속은토양 내에서살아가는미생물군집의자유로운활동을저해할뿐 만아니라^,군집다양성감소및기능저해등다양한영향 을미친다^.

구리는식물생장에필수미량원소이며^,자연적으로토양 내에³−^{4 mg·kg}^-1^,식물체내에서⁵−^{30 mg·kg}^-1정도의존재 한다^[1].광업^,화석연료연소및폐기물소각등인위적인활 동으로인해배출된많은양의구리는엽록소농도를감소 시켜잎의황화를촉진하며세포독성을유발하여식물생

장을저해한다^[1].카드뮴은화석연료연소^,야금산업및인

Characterization of Heavy Metal Tolerant and Plant Growth-Promoting Rhizobacteria Isolated from Soil Contaminated with Heavy Metal and Diesel

Soo Yeon Lee, Yun-Yeong Lee, and Kyung-Suk Cho*

Department of Environmental Science and Engineering, Ewha Womans University, Seoul 03760, Republic of Korea

In order to enhance rhizoremediation performance, which remediates contaminated soils using the inter- actions between plants and microorganisms in rhizosphere, it is required to develop effective microbial resources that simultaneously degrade contaminants and promote plant growth. In this study, heavy metal-resistant rhizobacteria, which had been cultivated in soils contaminated with heavy metals (copper, cadmium, and lead) and diesel were isolated from rhizospheres of maize and tall fescue. After that, the isolates were qualitatively evaluated for plant growth promoting (PGP) activities, heavy metal tolerance, and diesel degradability. As a result, six strains with heavy metal tolerance, PGP activities, and diesel degradability were isolated. Strains CuM5 and CdM2 were isolated from the rhizosphere soils of maize, and were identified as belonging to the genus Cupriavidus. From the rhizosphere soils of tall fescue, strains CuT6, CdT2, CdT5, and PbT3 were isolated and were identified as Fulvimonas soli, Cupriavidus sp., Novosphin- gobium sp., and Bacillus sp., respectively. Cupriavidus sp. CuM5 and CdM2 showed a low heavy metal tolerance and diesel degradability, but exhibited an excellent PGP ability. Among the six isolates, Cupriavidus sp. CdT2 and Bacillus sp. PbT3 showed the best diesel degradability. Additionally, Bacillus sp. PbT3 also exhibited excellent heavy metal tolerance and PGP abilities. These results indicate that the isolates can be used as promising microbial resources to promote plant growth and restore soils with contaminated heavy metals and diesel.

Keywords: Rhizobacteria, plant growth-promoting traits, heavy metals, tolerance, contaminated soil

*Corresponding author

Tel.: +82-2-3277-2393, Fax: +82-2-3277-3575 E-mail: [email protected]

(2)

산비료의과다사용등으로배출되어토양을오염시킨다^[2].

카드뮴에의해식물은시들고괴사하며무기영양분및탄수

화물대사장애로인해생체량생성이감소된다^[2].납은일

반적으로 농업 토양에서⁵⁰−^{300 mg·kg}^-1^,식물 체내에서 2 mg·kg^-1이하로존재하고^,광업^,인쇄업^,화석연료사용및

살충제사용등에의해배출된다^[3].납에의한한식물의영

양소흡수장애^,뿌리생장감소및광합성작용저해등으 로인해궁극적으로작물수확량도감소된다^[3].

중금속으로오염된환경을정화하기위해화학적침전^,이 온교환^,전기화학적처리^,필터링및부유물침전등과같은 물리화학적방법들이존재하나^[4],상대적으로적은비용으 로 높은 처리효율을 얻을 수 있는 근권미생물을 이용한 rhizoremediation 방법이최근주목받고있다^[4].식물과근 권미생물사이의상호작용은 rhizoremediation 효율에긍정 적인영향을미친다^.근권미생물중식물생장을향상시키는 미생물을 ‘식물 생장 촉진 근권미생물(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)’이라고 한다^. 이들은 indole-3-acetic acid (IAA)와같은식물생장촉진호르몬을 분비하거나나^,킬레이트제역할을수행하는 siderophore 생 성하기도 하며^, 여러 스트레스에 저항성을 갖는^1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase를 생성하는등의다양한메커니즘을통해식물의생장을증진 시킨다^.

대부분산업지역의토양은중금속에의한단일오염보다 는중금속과유류가함께복합적으로오염되는경우가많 다^.유류의경우^,막대한규모의석유산업이발전함에따라 주요토양오염물질중하나로대두되었다^.유류는많은독 성물질을함유하고있어고농도로오염될경우토양생태계 파괴에주원인이될수있다^.대부분의토양오염복원기술 은중금속혹은유류의단일오염정화에초점이맞추어있 다^.그러나중금속및유류등의복합오염토양의경우^,단 일오염토양에비해정화시간및비용이많이소모되기때 문에^,이를처리하는기술에대한요구가증가하고있다^.따 라서복합오염토양정화에대한다양한연구가진행되어 많은정보를구축하는것이필요하다^.

Rhizoremediation을이용하여중금속과유류로오염된토

양의정화효율을향상시키기위해서는^,오염물질을정화함 과동시에식물생장을촉진시킬수있는근권세균자원개 발이필요하다^.따라서^,본연구에서는중금속및유류복합 오염토양에서서식하고있는옥수수와톨페스큐의근권토 양으로부터중금속⁽구리^,카드뮴및납⁾에내성을가진근권 세균을순수분리하여동정하였다^.순수분리한중금속내성 근권세균을대상으로식물생장촉진활성과유류분해능을 평가하여우수한균주를선별하였다^.

재료 및 방법

중금속 stock 용액 및 중금속 함유 배지 제조

중금속내성근권세균을분리하기위해필요한중금속⁽구 리^,카드뮴 및납^{) stock}용액을 다음과 같이 제조하였다^. CuSO₄·5H₂O, CdCl₂·H₂O 및^Pb(NO3)₂시약을이용하여각 각의농도가^{1 M}이되도록^stock용액을만들었다^.멸균한 여과필터^(0.45μ^m)와실린지를이용해중금속^stock용액은 제균처리하였다.

1/10 희석 Luria-Bertani (LB) 배지(Difco, USA) [5]는 trytone 1 g/l, yeast extract 0.5 g/l, NaCl 1 g/l에 한천 15 g/l를첨가한후¹²⁰℃에서¹⁵분간멸균하였다^.멸균한 1/10 LB 배지를⁶⁰℃전후로냉각한후^,최종중금속농도 가각각 0.01, 0.1, 0.5, 1 mM이되도록중금속^stock용액을 첨가한후^,페트리디쉬에분주하였다^.

중금속 내성 근권세균의 분리

이화여자대학교신공학관옥상⁽³⁷^o^{57'N, 126}^o^95'E)에서중 금속⁽구리^500,카드뮴²⁰및납^{500 mg·kg}^-1⁾과디젤^(25,000 mg·kg^-1) 복합오염토양에서재배한옥수수(Zea mays, Maize) 와톨페스큐(Festuca arundinacea, Tall fescue)의근권토양 을채취하였다^.근권토양채취를위해뿌리에느슨하게붙어 있는토양을식물을흔들어서제거한후^,뿌리에단단히붙 어있는토양을털어내었다^.이렇게채취한근권토양을^{2 mm} 체에거른후실험에사용하기전까지⁴℃에서보관하였다^. 시험관에근권토양^{1 g}과^{9 ml}의멸균수를 넣어^1,200 rpm에서¹분동안교반하였으며^{, 15}분간정치한후상등액 을채취하였다^.상등액을¹⁰^-4까지단계별로희석한후^,구리^, 카드뮴및납(0.01, 0.1, 0.5, 1 mM)이각각첨가된^{1/10 LB} 배지에^{200 µl}씩분주하여도말하였다^.이후³⁰℃에서⁴⁸− 72시간동안배양하였으며^,배양후생육한콜로니수를측 정하였다^.또한^,콜로니의색과모양에따라총¹⁰⁸개의균 주를선별하였다^.

1차 선별 중금속 내성 근권세균의 식물 생장 촉진(Plant growth-promoting, PGP) 활성 평가

5 ml의^{1/10 LB}배지에¹차선별한중금속내성균주를접 종하여³⁰℃에서⁴⁸시간동안진탕배양⁽¹⁰⁰−^{120 rpm)}하여

배양액을준비한후^PGP활성을다음과같이정성평가하

였다^.모든평가실험은³반복으로수행하였다^.

IAA 생성능. ¹차선별균주의식물성호르몬인^IAA생성능

을평가하기위해[6, 7], 2 ml의배양액이들어있는시험관

에 phosphate buffer (pH7.5) 6 ml, L-tryptophane (0.06%, w/v)

(3)

4 ml를주입한후³⁷℃의암조건에서서²⁴시간동안배양하 였다. Phosphate buffer의조성은^Na3PO₄·12H₂O 22.81 g/l, glucose 10 g/l이다^.배양종료후배양액을^{4,000 rpm}에서 5분 간 원심분리하여 얻은 상등액^{3 ml}와 Salkowski’s reagent (HClO₄ (35%, v/v) 98 ml, 0.2 M FeCl₃·6H₂O 2 ml을혼합한용액^{) 2 ml}를혼합하였다^.암조건의²⁵℃에 서³⁰분동안정치시킨후분홍색^~자주색으로발색되는정

도를^{535 nm}파장에서흡광도를측정하였다^.

Siderophore 생성능. ¹차선별균주의금속성분과의결합 물질인 siderophore 생성 여부 측정을 위해^{[8, 9],}배양액 5 ml에^{1 M HCl}용액을^{50 µl}씩첨가하여^pH를²−³사이로

맞춰주었다^.배양액및첨가한^{1 M HCl}용액과동일한양

의 ethyl acetate (C₂H₅OH, Ethyl alcohol, 99.9%)를첨가 하여천천히흔들어서유기상과수용액상이분리되도록정

치시켰다^.상층의유기상^{2 ml}를회수하여새로운시험관에

분주한후, Hathway reagent (0.1 M potassium ferricyanide 1 ml, 0.1 M FeCl₃ in 0.1 M HCl 1 ml, 증류수^{98 ml}를혼 합한용액⁾를^{2 ml}첨가하고³⁰℃에서³⁰분동안정치하였 다^.하층의수용액상이청록색으로발색되는정도를^{700 nm} 파장에서흡광도를측정하였다^.

ACC deaminase 활성능. ¹차선별균주의환경스트레스에 대한저항성기작의주요지표인 ACC deaminase 활성능은 다음과같이평가하였다^[10–12].균주를 tryptic soy broth (TSB, Difco) 배지에접종하여³⁰℃^{, 120 rpm}조건에서²⁴시 간배양하였다^{. TSB}배지조성은 pancreatic digest of casein 17.0 g/l, papaic digest of soybean 3.0 g/l, dextrose 2.5 g/l, sodium chloride 5.0 g/l, dipotassium phosphate 2.5 g/l이 다^.이배양액을질소원으로서^(NH4)₂SO₄대신에^ACC를함 유한^DF배지에접종한후^{, 30}℃^{, 200 rpm}에서⁴⁸시간동 안배양하였다^{. DF}배지조성은^Na2HPO₄5.8 g/l, KH₂PO₄ 3 g/l, NaCl 0.5 g/l, NH₄Cl 1 g/l, CaCl₂0.25 mM, MgSO₄ 1 mM, glucose 0.15%, biotin 0.3 mg/l이다. ACC (98%, Sigma-Aldrich, Israel)는 0.5 M stock 용액으로제조하고제균 처리^(Minisart^® Syringe filter, 0.2 µm)한후^DF배지에최

종농도가^{3 mM}이되도록첨가하였다^.대조군의경우^,동일

하게질소원이없는^DF배지에균주를접종하고¹⁰일동안 배양하였다^.실험군과대조군모두^{600 nm}파장에서흡광도 측정한값을비교하여 ACC deaminase 활성을평가하였다^.

중금속 내성 및 PGP 활성이 우수한 균주 2차 선별 및 동정

1차선별균주의^PGP활성을비교평가하여상대적으로

우수한균주⁶종을²차선별하였다^{. 16S rRNA}의부분염기 서열을분석하여⁶종의균을동정하였다^.멸균한이쑤시개

를사용해²차선별균주의콜로니를 1.5 ml microcentrifuge tube에넣고³차증류수를^{30 µl}주입하여여충분히현탁시 킨 다음 11,000 rpm에서⁵초 간 원심분리하였다^.균체를 lysis시키기위해 heat block을이용하여⁹⁵℃에서¹⁵분간 열처리한후, 11,000 rpm에서⁵초간원심분리하였다^.이러 한^Lysis과정을³번씩반복하고추출된 genomic DNA를주 형^(templete)으로하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다^.총박테리아의^{16S rRNA}유전자를타겟으로 하는 340 f (5'-TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')과 805 r (5'-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3') 프라이 머를사용하였다^{[13]. DNA}주형^{2 µl, 10}μ^M의각프라이머 1 µl, dNTPs (2.5 mM) 4 µl, PCR buffer (with MgCl₂) 5 µl, Taq polymerase를^{0.25 µl}를넣고멸균한증류수로최 종부피를^{50 µl}로하였다^{. PCR}조건은⁹⁴℃에서³분동안 pre-denaturation한 후, denaturation 94℃³⁰초, annealing 55℃³⁰초, extension 72℃³⁰초과정을^{30 cycle}반복하였 으며^{, 72}℃에서⁵분동안최종^extension을진행하고⁴℃에 서^holding하였다^.증폭된^PCR산물을전기영동분석으로 길이를확인한다음동결하여㈜마크로젠에분석의뢰하였 다^.염기서열이 분석된 균주는 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) website의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여^GenBank database와비교하여동정하였다^.

동정한균주의염기서열이외에도중금속내성이뛰어난 균주^,유사한염기서열을가진균주등의^{16S rRNA}염기서 열을비교분석하고자다음의프로그램들을사용해계통도 를작성하였다^{. BioEdit}프로그램(BioEdit sequence alignment editor, version 7.0.5.3)을사용하여염기서열을^fasta파일 로변환하였으며 DNA baser (DNA baser, version 5.15.0.0BT) 로균주들의염기서열을정렬해주었다. ClustalX 프로그램 (ClustalX2.1, version 2.0)을활용해^phb파일생성후최종 적으로 MEGA-X (MEGA-X, version 10.2.2)을이용하여계 통도를작성하였다^.

2차 선별균주의 고농도 중금속에 대한 내성 평가

2차선별한균주의고농도중금속에대한내성은고농도

중금속이함유된^{1/10 LB}배지에서의균주의생장여부로

평가하였다^.구리^,카드뮴및납^stock용액을이용하여최종 농도가 0.5, 1, 5 및^{10 mM}가되도록^{1/10 LB}배지에첨가 하였다^.세종류의중금속을첨가한^{1/10 LB}고체배지에^,앞 서서동정한⁸종의균주를각각접종한후³⁰℃에서⁴⁸−⁷² 시간동안배양한뒤생장여부를관찰하였다^.

2차 선별균주의 디젤 분해능력 평가

2차선별한⁸종의균주들의디젤분해능을평가하기위해

(4)

[13], 시험관에무기염배지를^{5 ml}씩주입한후균주를접 종하였다^. 무기염 배지 조성은^MgSO4·7H₂O 0.25 g/l, Na₂HPO₄·12H₂O 17.09 g/l, KH₂PO₄ 3 g/l, NaCl 0.5 g/l, CaCl₂0.01 g/l, NH₄Cl 1 g/l이다^.멸균한 디젤을^{0.15 ml} (3%, v/v)를 주입한 후³⁰℃에서²주 동안 진탕배양⁽¹²⁰

rpm)하였다^.대조군은균주를접종하지않은무기염배지에

동일한양의디젤을첨가한후동일조건에서배양하였다^. 배양액^{5 ml}에추출용매인 hexane 5 ml를 넣은 후³⁰℃^, 120 rpm의조건에서³⁰분간교반하여추출하였다^.그후시 험관을실온에서³⁰분간정치한후상등액^(hexane용매층⁾을 채취하여잔류총석유화합물(total petroleum hydrocarbons,

TPHs)의 농도를 불꽃 이온화 검출기와 HP-5 capillary

column (30 m × 0.320 mm × 0.25 μm, Agilent Technologies, USA)가 장착된 가스크로마토그래피(GC 6980N system, Agilent Technologies, USA)를이용하여분석하였다^.가스크 로마토그래피의주입기와감지기작동온도는각각³⁰⁰℃ 와³²⁰℃였다^.또한가스크로마토그래피의오븐온도는³분 동안⁶⁰℃로유지하고^{, 4}℃^·min^-1속도로²⁶⁰℃까지상승한 다음⁸⁴℃^·min^-1속도로³¹⁰℃로상승한후⁵분간유지되 었다^.디젤제거효율은초기농도와²주후농도를비교하여 백분율로환산하여평가하였다^.

결 과

중금속 함유 배지에서 근권세균의 생균수 비교

옥수수와톨페스큐근권토양현탁액을중금속함유^1/10

LB 배지에도말하여배양한후측정한생균수결과를^Table

1에나타내었다^.중금속종류에관계없이전체적으로중금

속농도가증가할수록생균수가점점감소하는경향을나타

내었다^.구리의경우^{, 0.01 mM}농도조건에서톨페스큐근권

세균은다른조건에비해콜로니가과도하게생장하여정확

한생균수를측정할수없었다^{. 0.1 mM}농도에서측정한옥

수수근권세균에서가장많은콜로니수를보였으며다른조 건과큰차이를보였다^.반면^{0.5 mM}와^{1 mM}의비교적높 은중금속농도조건에서는톨페스큐근권세균의콜로니가 옥수수근권세균보다더많이생장하였음을알수있었다^.

카드뮴의경우^{, 1 mM}농도조건을제외하고모든농도에서

옥수수보다톨페스큐에서유래한근권세균에서더많은생 균수가측정되었다^.납의경우^{, 0.01 mM}농도조건의옥수수 근권세균이가장많은생균수를보였으며톨페스큐근권세 균과도유의한차이를보였다^.마찬가지로^{0.5 mM}농도에 서도옥수수근권세균이톨페스큐근권세균보다더많은생

균수를보였다^.반면에 0.1 mM, 1 mM 농도에서는톨페스

큐근권세균의생균수가더많이측정되었으며옥수수근권 세균과의유의한차이를나타내었다^.

생균수측정배지에생육한콜로니의색과모양^,특성에 따라옥수수근권토양유래^Cu내성근권세균⁸종^(CuM1− CuM8), 카드뮴내성세균⁶종^(CdM1−^CdM6),납내성세균 6종(PbM1, PbM3−^PbM7)을선별하였다^.또한^,톨페스큐근 권토양유래구리내성근권세균⁶종^(CuT2−^CuT7),카드뮴 내성세균⁷종^(CdT1−^CdT7),납내성세균⁹종^(PbT1−^PbT9) 을선별하였다^.

1차 선별 중금속 내성 근권세균의 PGP 활성능

1차선별총⁴²종의중금속내성근권세균의식물생장향 상능력평가결과를^{Table 2}에나타내었다^{. 42}종균주모두

Table 1. Comparison of viable cell numbers grown on heavy metal-containing plates inoculated with the rhizospheric soil suspensions.

Heavy metal Concentration (mM)

Bacterial number (CFU/g-dry soil)

Maize Tall Fescue

Cu 0.01 04.59 × 10⁷ ± 0.45 × 10³^{B a} TMTC ^b

0.1 5.04 × 10⁷ ± 0.44 × 10³^A 3.29 × 10⁷ ± 0.46 × 10³^C 0.5 2.21 × 10⁷ ± 0.34 × 10³^E 2.75 × 10⁷ ± 0.24 × 10³^D 1 3.02 × 10⁶ ± 0.40 × 10³^G 8.19 × 10⁶ ± 0.85 × 10³^F

Cd 0.01 1.08 × 10⁷ ± 0.28 × 10³^B 5.04 × 10⁷ ± 0.62 × 10³^A

0.1 4.95 × 10⁶ ± 0.41 × 10³^D 8.24 × 10⁶ ± 0.61 × 10³^C 0.5 6.30 × 10⁵ ± 0.36 × 10³^F 1.08 × 10⁶ ± 0.13 × 10³^E 1 3.83 × 10⁵ ± 0.45 × 10³^G 3.74 × 10⁵ ± 0.23 × 10³^H

Pb 0.01 4.05 × 10⁷ ± 0.40 × 10³^A 3.51 × 10⁷ ± 1.34 × 10³^B

0.1 6.71 × 10⁶ ± 0.86 × 10³^D 6.98 × 10⁶ ± 0.22 × 10³^C 0.5 5.40 × 10⁶ ± 0.53 × 10³^E 4.91 × 10⁶ ± 2.26 × 10³^F 1 1.05 × 10⁴ ± 0.13 × 10³^H 5.36 × 10⁴ ± 0.12 × 10³^G

aDifferent letters indicate significant difference (p < 0.05).

bToo many colonies to count.

(5)

IAA를생성하는능력을보유하고있었으나^,옥수수근권에 비해톨페스큐의근권에서분리한균주들의활성이더우수 함을확인할수있었다^.그중에서도^CdT5과^PbT2균주의 IAA 생성능이우수하였다^.

Siderophore 생성능의경우^{, IAA}생성능에비해활성을가 진균주의비율이낮았다. CuM5, PbT1, PbT3 및^PbT9균 주에서가장높은활성을보였으며^,대부분납함유배지에 서분리한균주들의 siderophore 생성능이높았다^.

ACC deaminase 활성능은⁴⁴종세균중²⁶종이활성을보 였는데, siderophore 생성능과유사하게납함유배지에서분 리한균주(PbM3, PbM6 및^PbM7)의 ACC deaminase 활성 이 상대적으로 높았다^.또한^,구리 함유 배지에서 분리한 CuM5와^CdT3균주의 ACC deaminase 활성도상대적으로 우수하였다^{. PGP}활성을종합적으로분석하여중금속내성

과^PGP능력이 상대적으로 우수한⁶종근권세균^(CuM5,

CuT6, CdM2, CdT2, CdT5 및 PbT3 균주)을 2차선별하 였다^.

2차 선별균주의 동정

2차선별한⁸종균주의동정결과및및계통발생학적특성 을^{Fig. 1}에도시하였다. CuM5 (Accession no. MW407068), CdM2 (Accession no. MW407022) 및 CdT2 (Accession

no. MW407064)의세균주는중금속에내성을지닌균으로

알려진 Cupriavidus sp.와유사도가각각 100%, 99.1% 및 99.6%이었다[14]. CdT5 (Accession no. MW407024) 균주는 Novosphingobium sp.와유사도가^100%로^,이종은방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)를분

해하는 것으로 알려져 있다[15]. CuT6(Accession no.

MW407070) 균주는 Fulvimonas soli와 유사도가 높았고 (100%), Fulvimonas 속의균주는공기중질소를고정시킬

수있고토양내중금속을감소시킬수있으며^BTEX와같

은방향족화합물을분해할수있다고보고된바있다^[16].

PbT3 (Accession no. MW407072) 균주의경우 Bacillus sp.

와높은유사도^(82.5%)을보였으며폐광지역에서중금속오

염토양에서중금속을완화함과동시에식물생장을촉진하

는능력이있다는연구결과가존재한다^[17].

2차 선별균주의 중금속 내성 및 TPHs 분해능

2차선별한⁶종균주의중금속⁽구리^,카드뮴및납⁾에대 한내성과^TPHs분해능을평가한결과를^{Table 3}에나타내

었다^{. 0.5 mM}구리함유배지에서는^CdM2균주를제외한

5종 모두 생장하였고^{, 1 mM}구리 함유 배지에서는³종 (CuT6, CdT5, PbT3), 5 mM 구리 함유 배지에서는^CuT6 균주만이생장하였다^{. 10 mM}구리함유배지에서는생장할 수있는균주는없었다^.동일농도조건에서비교해보면^,구 Table 2. Plant growth promoting activities of heavy metal-

tolerant rhizobacteria isolated from the rhizosphere soils.

Isolation source

Strain no.

Plant growth promoting activity IAA

(OD_535nm)

Siderophore (OD_700nm)

ACC deaminase

(OD_600nm) Maize

rhizosphere

CuM1 0.097 0.085 0.067

CuM2 0.127 0.000 0.000

CuM3 0.180 0.012 0.070

CuM4 0.008 0.000 0.300

CuM5 0.096 0.110 0.430

CuM6 0.177 0.063 0.180

CuM7 0.162 0.000 0.000

CuM8 0.117 0.000 0.000

CdM1 0.105 0.000 0.000

CdM2 0.103 0.013 0.054

CdM3 0.097 0.000 0.000

CdM4 0.094 0.000 0.000

CdM5 0.211 0.000 0.115

CdM6 0.162 0.000 0.059

PbM1 0.099 0.000 0.000

PbM3 0.141 0.000 0.372

PbM4 0.129 0.000 0.000

PbM5 0.183 0.000 0.063

PbM6 0.038 0.011 0.350

PbM7 0.122 0.052 0.489

Tall fescue rhizosphere

CuT2 0.109 0.000 0.000

CuT3 0.109 0.000 0.000

CuT4 0.131 0.012 0.067

CuT5 0.150 0.039 0.175

CuT6 0.109 0.097 0.129

CuT7 0.174 0.011 0.146

CdT1 0.111 0.000 0.052

CdT2 0.111 0.000 0.051

CdT3 0.101 0.000 0.340

CdT4 0.076 0.000 0.164

CdT5 0.217 0.054 0.000

CdT6 0.161 0.000 0.000

CdT7 0.187 0.000 0.000

PbT1 0.203 0.121 0.000

PbT2 0.248 0.000 0.193

PbT3 0.175 0.163 0.153

PbT4 0.145 0.000 0.064

PbT5 0.103 0.000 0.121

PbT6 0.161 0.000 0.000

PbT7 0.078 0.011 0.000

PbT8 0.155 0.000 0.000

PbT9 0.107 0.118 0.000

(6)

리와납에비해카드뮴이함유된배지에서각균주의생장 이크게저해되었다^{. 6}종균주모두^{5 mM}이상카드뮴을함

유한배지에서생장하지못했고^{1 mM}카드뮴함유배지에

서는^CdM2및^PbT3균주만생장할수있었다^{. 0.5 mM}납 함유배지에서는⁶종균주모두생장하였고^{1 mM}에서또한

CuM5 균주를제외한⁵종모두생장하였다^{. 5 mM}이상의

납함유배지에서는^PbT3균주만이생장하였으며^{10 mM} 에서는생장가능한균주는없었다^.종합적으로^PbT3균주

의중금속 내성이가장 우수하였고^,그 다음으로^CuT6와

CdT5 균주의중금속내성이우수함을알수있었다^.

TPHs 분해능 평가 결과^{, PbT3}와^CdT2균주에서각각 77.65%와^72.88%의제거효율을보였으며⁶종의균주중가

장높은^TPHs분해능력을보유하고있었다. CuM5, CdM2

및^CuT6의^TPHs제거효율은 각각 23.69%, 19.40% 및 14.89% 이었다^{. CdT5}균주의경우^2.68%로^TPHs분해능력 이⁶종의균주중가장낮음을알수있었다^.

Fig. 1. Neighbor-Joining Phylogenetic trees of the strains CuM5, CdM2, CuT6, CdT2, CdT5 and PbT3 estimated from 16S rRNA sequence. Boostrap values (percentages of 1,000 replications) are shown at the branch points. The scale bar represents 0.1 sub- stitutions per site. The 16S rRNA gene sequence of heavy metal tolerance bacteria and similar bacteria to six strains were used as out- group.

(7)

고 찰

일반적으로고정농도이상의중금속은미생물을비롯한 생물에독성영향을미치지만^,일부중금속에내성을가진 미생물은이러한환경조건에서도생장하면서생물학적정화

능력을갖거나및식물의생장을향상시킬수있다^{[18, 19].}

본연구에서는중금속 3종(구리, 카드뮴및납)에내성능력

을가지며^PGP능력과유류분해능을보유한⁸종의균주를

옥수수와톨페스큐근권토양에서분리하였다^.

토양에식재된식물뿌리에서분비되는삼출물은미생물 군집및활성에변화를야기하기도하며근권미생물은식물 의생육상태^,토양내유기물분해등에영향을미칠수있

다^[20].또한근권미생물간의상호작용은서로의군집형성

에변화를일으키기도한다^[20].본연구에서는옥수수와톨 페스큐근권토양에서중금속내성세균특성을조사하기위 해중금속함유배지에서생균수를측정하였다^.그결과근 권세균수는중금속농도가증가할수록감소하는것이명확 히관찰되었다(Table 1). 기존에보고된연구에따르면^,비

오염토양에서옥수수근권토양세균의생균수는^{6.14 × 10}⁸

CFU/g-soil [21], 겉보리속 식물의 근권에서는^{5.05 × 10}⁸ CFU/g-soil, 밀의근권에서는^{7.10 × 10}⁸ CFU/g-soil, 붉은토 끼풀의근권에서는 32.55 × 10⁸ CFU/g-soil이었다^[21].또한 바나나근권에서서식하는세균의생균수는^{3.00 × 10}⁸^CFU/

g-soil이었다^.이와같이비오염토양의근권세균의생균수가

10⁸ CFU/g-soil 수준임을고려하면^,본연구에서^{0.1 mM}의 중금속오염조건에서의근권세균생균수는비오염조건에

서의 생균수에 비해^1/18−^1/100수준으로 감소하였으며^,

1 mM 구리^,카드뮴및납오염조건에서는^1/100−^1/10,000

수준으로감소하였다(Table 1).

본연구결과와유사하게중금속농도에따라토양세균의 생균수가감소하는결과는기존연구에서도보고되었다^.납 오염토양에서의생균수는납농도에비례하여감소하였다

[22]. 또한수은으로오염된토양에서도유사한결과가관찰

되었다^[22].그러나아연오염토양에서의생균수는비오염

토양의생균수와유의미한차이는없었는데^,이는납과수은 에비해아연독성이낮기때문으로고찰되었다^[22].그밖 에도구리로오염된토양에서측정한생균수는비오염토양 의생균수에비해현저히감소하였고[23], 0.8 mM의구리가 함유된배지에서의생균수는대조군⁽구리무첨가배지⁾에비 해최대^1/100수준으로감소하였다^[24].카드뮴오염토양 에서카드뮴농도에비례하여생균수가감소함이여러연구 에의해보고되고있다^{[25, 26].}

본연구에서 순수 분리한⁶종의 균주 중³종의^CuM5, CdM2 및^CdT2균주는 Cupriavidus sp.로 동정되었다 (Table 3, Fig. 1). Cupriavidus 속세균은다양한식물의근 권세균으로알려져있다^.본연구와동일한옥수수근권을 포함하여선인장^,수수의근권에서도분리되었으며^[27],이 외에도인삼^[28],미모사^[29],사다리봉의꼬리^[30]와같이다 양한식물의근권세균으로보고되었다. Cupriavidus 속의세

균은다양한오염물질분해균주로알려져있으며^[31]카드

뮴을비롯한여러중금속의독성을해독할수있는능력을

보유하는대표적인중금속내성균주로알려져있다^[31].또

한 Cupriavidus 속세균은아연^,비소^,구리및코발트의존 재하에서도 생장이 가능하다고 보고되었다^[27]. 특히^, Cupriavidus necator UFLA 01-659 균주는 카드뮴^{9.0 ppm,} 구리^{4.6 ppm}및아연^{3.2 ppm}농도의중금속을세포내축 Table 3. Activities of heavy metal tolerance and PGP by eight identified strains.

Identify

Heavy metal tolerance

TPHs degrading

PGP activity Cu conc. (mM) Cd conc. (mM) Pb conc. (mM)

IAA (OD535nm)

Siderophore (OD700nm)

ACC deaminase

(OD_600nm)

10 5 1 0.5 10 5 1 0.5 10 5 1 0.5

Cupriavidus sp. CuM5

(MW407068) - - - + - - - - - - - + 23.69% 0.096 0.110 0.430

Cupriavidus sp. CdM2

(MW407022) - - - - - - + + - - + + 19.40% 0.103 0.013 0.054

Fulvimonas soli CuT6

(MW407070) - + + + - - - - - - + + 14.89% 0.109 0.097 0.129

Cupriavidus sp. CdT2

(MW407064) - - - + - - - - - - + + 72.88% 0.111 0.000 0.051

Novosphingonium sp.

CdT5 (MW407024) - - + + - - - - - - + + 7.22% 0.217 0.054 0.000

Bacillus sp. PbT3

(MW407072) - - + + - - + + - + + + 77.65% 0.175 0.163 0.153

a-: no activity, +: activity