Effect of Low Intensity Pulsed Ultrasound with Adipose-Derived Stem Cells on Bone Healing around a Titanium Implant in Tibia of Osteoporosis-Induced Rats

Original Article

원고 접수일 2011년 3월 10일, 게재 확정일 2011년 4월 8일 책임저자 김욱규

(628-870) 경남 양산시 물금읍 범어리, 부산대학교 치의학전문대학원 구강악안면외 과학교실

Tel: 055-360-5100, Fax: 055-360-5104, E-mail: [email protected]

RECEIVED March 10, 2011, ACCEPTED April 8, 2011 Correspondence to Uk-Kyu Kim

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, Pusan National University, Beomeo-ri, Mulgeum-eup, Yangsan 628-870, Korea Tel: 82-55-360-5100, Fax: 82-55-360-5104, E-mail: [email protected]

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골다공증 유도 백서 경골에 티타늄 임플랜트 매식 시 지방조직유래 줄기세포 주입과 저출력 초음파 적용이

골치유에 미치는 영향

이광호¹ㆍ최연식¹ㆍ신상훈¹ㆍ정인교¹ㆍ김규천²ㆍ김철훈³ㆍ김욱규¹

부산대학교 치의학전문대학원 ¹구강악안면외과학교실, ²구강해부학교실, ³동아대학교의료원 치과학교실 구강악안면외과

Abstract

Effect of Low Intensity Pulsed Ultrasound with Adipose-Derived Stem Cells on Bone Healing around a Titanium Implant in Tibia of

Osteoporosis-Induced Rats

Kwang-Ho Lee ¹ , Yeon-Sik Choi ¹ , Sang-Hun Shin ¹ , In-Kyo Chung ¹ , Gyoo-Cheon Kim ² , Cheol-Hun Kim ³ , Uk-Kyu Kim ¹

Departments of

Oral and Maxillofacial Surgery,

Oral Anatomy, School of Dentistry, Pusan National University,

3

Department of Dentistry, Dong-A Medical Center

Purpose: Osteoporosis, is a major health problem for the elderly and post-menopausal women and shown to alter the properties of bone as well as impair bone healing around titanium implants in both human and animals. The objective of this study was to examine the effect of LIPUS with adipose-derived stem cells on the healing process around a titanium implant in rats with osteoporosis.

Methods: Sixteen osteoporosis-induced rats were divided into two groups: an adipose-derived stem cell injected with Low Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) application group and a control group. Titanium screw implants (diameter, 2.0 mm:

length, 3.5 mm, Cowell Medi, Korea) were placed into both tibia of 16 rats, on 8 rats as the control group and the other 8 rats as the experimental group. Rats were sacrificed at different intervals from 1, 2, 4 and 8 weeks after implantation for histopathologic and immunohistochemical analyses.

Results: Histopathological analysis revealed newly formed bone in experimental group earlier than that in control group.

Especially at 1 week after implantation, more amounts of new bone matrix and collagen around the implant in the experimental group were seen compared with the control group. Immunohistochemical analysis showed that the levels of osteoprotegerin (OPG) expression in the experimental group were increased at early stages compared with that of control group until 2 weeks after implantation. But after 2 weeks, the expression level of OPG similar in both groups. The expression levels of receptor activator of nuclear factor kB ligand (RANKL) were stronger in the experimental group than the control group until

2 weeks after implantation. After 4 weeks, expression of RANKL in experimental group was similar to the control group.

Conclusion: The results of this study suggest that LIPUS with Adipose-Derived Stem Cells in implantation could promote bone healing around titanium implants in rats with osteoporosis.

Key words: Low Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS), Stem cell, Osteoporosis, Implant

서 론

지금까지 임플랜트는 무치악 부위의 기능적, 심미적 수복에 성공적인 역할을 수행해왔다. 또한 상악구치부처럼 국소적으로 불량한 골질이거나 골다공증이나 당뇨처럼 전신적 요인으로 인한 약한 골에서도 임플랜트의 성공률을 높이고, 좀 더 빠른 골유착을 위한 여러 연구들을 시행하고 있다[1-5].

골다공증은 정상인에 비해서 낮은 골질량과 골조직의 미세구조 의 저하를 특징으로 하는 대사성 골질환이며, 폐경기 이후 여자 환자와 노인 환자에서 많이 이환된다. 골다공증이 치조골에 미치 는 영향은 크게 두 가지인데 골의 무기성분의 감소와 치조골의 골부피 감소이다. 이는 임플랜트 시술 시 가장 큰 위험요소 중 하나이다. 임플랜트와 골다공증에 관한 여러 연구들에서 Friberg 등[6,7]은 골유착의 성공은 숙주골의 상태와 치유능력에 달려 있다 고 보고하였다. Erdoğan 등[8]은 골다공증이 골이식편의 흡수, 비유착, 치유시간 지연 등과 상관관계가 있다고 보고하였다.

임플랜트와 치조골 사이의 골유착(osseointegration)은 매우 중요한 요소인데, 골유착을 증가시키기 위해 임플랜트의 거대외 형과 미세외형에 관한 연구뿐 아니라, 임플랜트 표면에 줄기세포 와 여러 성장인자 및 골형성단백질을 첨가하는 연구들까지 시행해 왔다. 또한 골 주위에서 치유를 향상시키는 생체물리적 자극요법 (biophysical stimulation) 즉, 저출력 파동형 초음파(Low Inten- sity Pulsed UltraSound, LIPUS)[9,10]나 저강도 레이져 치료 (Low-Level Laser Treatment, LLLT)[11] 또한 파동형 전자기장 치료(Pulsed Electro-Magnetic Field, PEMF)[12]와 같은 분야에 있어서도 연구가 이루어지고 있다.

저출력 파동형 초음파를 이용한 임상보고는 1983년 Duarte[13]

가 최초로 골의 성장에 사용한 이후 1994년 Heckman 등[14]이 잘 치유되지 않는 경골 골절에 있어서 이를 적용하여 탁월한 치유를 보였다고 보고하였다. 또한 In Vitro에서 Wu[15]은 연골 세포에서 aggrecan mRNA와 DNA 결합단백의 증가를 보고하였 으며, Ryaby[16]은 osteoblast에서의 TGFβ 합성의 증가를 보고 하였다.

줄기세포(Stem cell)는 어떠한 세포로도 분화될 수 있는 성질 과 인체면역반응이 없다는 점에서 골결손부의 이상적인 이식재이 며, 골유착에 걸리는 시간을 줄이는 골형성 유도인자이다. 또한 줄기세포를 통해 골치유능을 증진시키기 위한 연구도 보고되어 왔다. 최근에는 임플랜트 시술 후 골유착의 정도와 시간을 촉진시

키기 위한 여러 연구들 중의 하나인 osteogenic coating법으로서 줄기세포를 임플랜트 표면에 활용하는 연구들도 보고되고 있다 [17-21]. 본 연구에서는 임플랜트 매식 시 줄기세포를 주입하고, 줄기세포의 활성을 높이면서 골 치유를 촉진하기 위해 저출력 초음파를 적용하여 병용효과를 확인하고자 하였다.

이에 본 연구에서는 난소절제를 통해 골다공증을 유발한 백서 에 임플랜트를 식립하면서, 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세 포를 주입하고, 저출력 파동형 초음파를 적용하여 불량한 골질에 서 임플랜트 골유착의 변화를 관찰하였다. 골조직 형성이 촉진된 양상을 관찰하기위해 조직병리학적 검사를 시행하였으며, 골재생 과 강화의 촉진 양상을 관찰하기 위해 골재생에 중요하게 작용하 는 세포인 골모세포와 파골세포의 분화, 생성 등에 중요하게 관여 하는 사이토카인으로 알려진 osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factor kB ligand (RANKL)의 발현양상을 면역 조직 화학 검사를 통해 관찰하였다.

연구방법

1. 연구 재료 1) 실험동물

실험동물은 일정 기간 동일 조건하에서 사육한 250 g 내외의 자성 백서 16마리를 골다공증을 유도하여 사용하였다. 이 중 임플 랜트 매식 시 줄기세포를 주입하고 이후 저출력 초음파를 조사한 8마리를 실험군으로, 줄기세포를 주입하지 않고 저출력 초음파를 조사하지 않은 8마리를 대조군으로 나누었다.

2) 연구재료

연구재료는 순수 티타늄(Commercially Pure titanum-Grade 3)으로 주문 제작한 직경 2.0 mm, 길이 3.5 mm (pitch height 0.4 mm)의 나사형 임플랜트(Cowell-Medi, Busan, Korea)를 사용하였으며, 사용된 저출력 초음파는 BR-sonic

(ITO co., Tokyo, Japan)을 이용하였다.

2. 연구 방법 1) 골다공증 유도

Enflurane (Gerolan

, 중외, Seoul, Korea)과 산소압의 농도

를 1：1로 혼합하여 백서에 흡입마취를 통한 전신마취를 시행하

였다. 복부소독 후 5 cm의 수평절개를 가하고 복부노출 후 양측 신장의 하방에 존재하는 난소를 조심스럽게 완전 제거하여 골다공 증을 유도하였다. 통법에 따라 봉합한 후 겐타마이신(Gentami- cin hydrochloride, 중외, Seoul, Korea) 3 mg/kg을 근주하였다.

2) 지방조직 유래 줄기세포의 분리 및 배양

실험군 백서는 난소 절제와 동시에 복부에서 지방조직도 분리 하였다. 분리된 지방을 phosphate-buffered saline (PBS)로 2

∼3회 세척을 시행하고, 잘게 썬 지방에 0.075% (w/v) collage- nase type I (Sigma-Aldrich Co., Missouri, USA)를 넣어 섞은 후, 37

C에서 20∼30분간 incubation해주었다. 이후 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 함유한 modified Eagle's medium (α-MEM; Gibco, Invitrogen Co., CA, USA)배지를 지방과 동량 넣어 섞고, 1,200 RPM에서 10분간 원심분리를 시행하였다. Pellet만 남기고 나머 지 내용물을 흡인한 후 10% FBS를 함유한 α-MEM배지를 이용 하여 pellet 부유(suspension)와 nylon mesh에 걸러서 dish에 분주하였다. 분리된 세포가 지방조직 유래 줄기세포 인지를 평가 하기 위한 방법으로 동일한 방법으로 시행된 이전 연구[20]에서 FACScan argon laser cytometer (Becton Dickson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 유동 세포계수검사(flow cytometry)를 시행하였으며, 검사 결과 분리된 세포들은 CD44에 양성반응을 보였고, CD45에 음성반응을 보임으로써 미분화된 지방조직유래 줄기세포임을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 동일한 방법 으로 시행된 본 연구에서는 분리된 세포에 대한 유동 세포계수검 사를 시행하지 않았다.

3) 지방조직 유래 줄기세포의 주입준비

분리한 줄기세포를 2주간 37

C 인큐베이터(incubator)에서 배양한 후 세포의 세척, 분리, 계수 과정 등을 시행하였다. 세포가 들어있는 배지를 흡인하고 PBS를 5 ml 넣어 dish를 천천히 흔든 다음 PBS 흡인후 한 번 더 세척을 한 후 trypsin EDTA (Sigma- Aldrich Co., Missouri, USA) 용액을 1 ml 넣은 다음 37

C 인큐베이터에서 2분간 둔 다음 현미경으로 세포가 분리되었는지 확인하고 FBS가 들어간 배지를 5∼10 ml 넣어 세포를 회수하여 tube에 담았다. 1,200 RPM에서 4분간 원심분리 한 다음 tube 아래 모인 pellet은 남기고 배지는 흡인하였다. Pellet을 1 ml PBS로 부유한 후 계수기(count meter)에 cover glass를 깔고 부유한 세포 중 10μl를 넣었다. 계수를 시행하고 난 후, 동물에 주입할 세포의 경우 PBS를 넣고 원심분리를 위와 동일한 조건에 서 해주었다. 필요한 개수의 세포를 total 10∼15 μl 정도의 PBS에 부유하였으며, 각 임플란트 식립 부위에 약 5×10

개의 세포가 주입되도록 준비하였다.

4) 지방조직 유래 줄기세포 주입 및 임플랜트 매식 난소 절제 후 5주가 경과되어 골다공증 유도를 확인한 후 실험 동물인 백서 16마리에 Enflurane과 산소압의 농도를 1：1로 혼 합하여 흡입마취를 통한 전신마취 시행하였다. 좌, 우측 경골부를 골막까지 박리하여 골을 노출시킨 후 경골 근심측 5 mm 부분의 경골 외측 최대 폭경부 중앙부에 직경 1.6 mm twist drill을 이용하여 피질골에 구멍을 내고 준비한 임플랜트를 골수강에 도달 할 때까지 조심스럽게 매식하였다. 실험군에서는 twist drill로 형성한 경골에 임플랜트를 매식하기 전에 줄기세포를 먼저 sy- ringe로 주입 후 임플랜트를 매식하였다. 이후 겐타마이신 항생제 주사를 근주하였다.

5) 저출력 초음파 적용

임플랜트를 매식한 다음날부터 실험군에 저출력 초음파를 주파 수 3 MHz, 초음파 출력 40 mW/cm

로 14일간 매일 10분씩 적용하였다. 사용된 저출력 초음파는 BR-sonic

(ITO co., Tokyo, Japan)을 이용하였다. 모든 실험은 부산대학교 동물실험 윤리위원회 운영규정에 따라 적의 심의하고, 그 내용이 동물실험 의 신뢰성, 안전성, 윤리성의 측면에서 적합하여 동물실험을 승인 받았으며 모든 사항을 준수하여 시행하였다.

6) 표본 제작

임플랜트 매식 후 1주, 2주, 4주 및 8주 경과한 백서를 흡입을 통한 전신마취를 시행 후 심장 관류법으로 흉곽을 열어 심장을 노출시킨 후 좌심실에 20게이지 바늘 삽입하고 겸자 고정 후 연동 관류 펌프 작용시켜서 체순환 시킨 후 우심방벽을 절개하여 피를 배출시키고 PBS를 사용하여 체내 혈액을 세척하였다. 이후 4% paraformaldehyde 고정액을 다시 30분간 펌프 관류시킨 후 대퇴 관절을 포함하여 경골을 절단하여 임플랜트 매식 부위를 채취하였다. 그 후 동일한 고정액에 24시간 고정시킨 후 10%

EDTA와 NaOH를 녹인 탈회액에 12주간 탈회시켰다. 그 후 조직 을 조직캡슐에 넣어 흐르는 물에 12시간 동안 수세한 다음, 통상적 인 방법에 따라 alcohol과 xylene으로 탈수와 투명화를 한 후 paraffin에 포매하고 6μm 두께의 시상연속절편을 만들었다.

7) 병리조직학적 관찰

(1) Hematoxylin-Eosin (H-E) stain: 통법에 의해 Hema- toxylin-Eosin (H-E) 염색 처리 후 표본에서 골 형성과 관련된 세포 및 세포외 기질을 관찰하기 위해 광학현미경(Axioscop, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하였다.

(2) Masson's trichrome stain: Masson's trichrome stain

염색표본에서 collagen 및 골 형성과 관련된 세포 및 세포외

기질을 관찰하기 위해 광학현미경(Axioscop, Carl Zeiss, Jena,

Fig. 1. (A) Microphotograph at 1 week after implantation in control rat (H-E. ×100). (B) Microphotograph at 2 week after implantation

Germany)을 이용하였다. 염색 과정은 다음과 같다. 교원질의 생성정도에 따른 광화된 골조직과 비광화된 골조직을 관찰하기 위해 상기 제작된 6μm 두께의 파라핀 조직 절편을 xylene에서 파라핀을 제거하고 실온에서 Bouin 용액에 하룻밤 담가 놓은 후 조직표본의 노란색이 없어질 때까지 유수에 수세한다. 증류수 로 여러 번 행구고 weigert iron hematoxylin 용액에 10분간 핵염색을 한다. 이후 유수에 10분간 수세하여 핵을 청화시키고 Biebrich Scarlet-acid fuchsin 용액에 10분간 염색한다. 증류수 로 여러 번 행군 후 Phosphomlybdic- phosphotungstic acid 용액에 10분간 처리한다. 수세하지 않고 Aniline blue 용액에 5분간 염색한 후 증류수로 여러 번 헹군다. 이후 1% acetic acid 용액을 1∼3분간 적용시킨 다음 증류수로 여러 번 헹군다. 탈수, 투명과정을 거친 후 봉입한다.

8) OPG, RANKL의 발현에 대한 면역 조직 화학적 검사 파라핀 포매 조직으로부터 4μm 두께의 절편을 얻어 코팅 슬라이드에 부착시킨 다음 1시간 동안 60

C 오븐에 넣은 후 xy- lene으로 5분간 4회 반복 처리하여 탈 파라핀을 시행하고 여러 단계의 알코올로 함수 후 증류수로 세척하였다. 세척 완충액으로 3분씩 3회 세척하고 조직 내의 내인성 과산화효소를 제거하기 위하여 0.3% H

O

용액에 5분간 반응시켰다. 이어서 세척 완충 액으로 4회 수세 후 조직 내 비특이적 결합을 억제하기 위해 blocking serum (goat immunocruz staining system-santa- cruz)을 1시간 반응시킨 후 각각의 일차 항체를 희석하여(OPG 1：80, RANKL 1：70) 하룻밤 동안 반응시켰다. 세척 완충액으 로 수세한 다음 biotin이 label된 Secondary Ab (goat im- munocruz staining system-santacruz)를 1시간 반응시킨 후 세척 완충액으로 4회 수세하고 enzyme conjugate streptavidin (goat immunocruz staining system-santacruz)로 1시간 반응

시켰다. 다시 세척 완충액으로 4회 수세 후 DAB로 발색하고 증류수로 수세한 후 헤마톡실린으로 대조 염색하여 관찰하였다.

이후 광학현미경(Axioscop, Carl Zeiss, Jena, Germany)에서 Kappa (K) ratio를 이용하여 2인 관찰자간 판정 일치도를 검정한 후 OPG, RANKL의 발현 양상을 관찰하고 그 결과를 −: no immunoreactivity; ＋: weak but visible staining; ＋＋: mod- erate staining; ＋＋＋: strong staining intensity로 4등급 발색 반응으로 나누어 분석하였다.

결 과

1. 병리조직학적 소견 1) H-E stain

(1) 대조군: 매식 후 1주군에서 임플랜트 계면부위에 요철상을 보이는 골기질과 골기질 내에 막내성 골형성 양상을 보이는 골 소주를 관찰할 수 있었다. 2주군에서는 임플랜트 계면부위에 무기 질화가 일어나지 않은 두꺼운 골기질 상태를 볼 수 있었다. 4주군 에 이르러 임플랜트 계면 부위에서는 2주군과 비교해 약간 두꺼워 지고 성숙된 골의 양상을 관찰할 수 있었다. 매식 후 8주군에서는 두꺼워진 골조직 양상을 확인할 수 있었으며 임플랜트 계면 부위 주위로 성숙된 골이 일정한 두께로 관찰되었다(Fig. 1).

(2) 실험군: 매식 후 1주군에서 임플랜트 주위로 나사상 모양의

부분적인 골재생이 관찰되었고, 이러한 골조직은 대조군에 비해

더 광화된 형태를 보였다. 또한 대조군에 비해 많은 골소주 및

혈관을 관찰할 수 있었다. 2주군에서는 임플랜트와 골이 접촉하는

계면부위에 요철상의 재생되는 골을 볼 수 있으며 미성숙된 양상

을 나타내고 있었지만 대조군에 비해 많은 세포를 관찰할 수

있었고 골소주들이 골수강 내에 관찰되었다. 4주군에 이르러 임플

Fig. 2. (A) Microphotograph at 1 week after implantation in experimental rat (H-E. ×100). (B) Microphotograph at 2 week after implantation

Fig. 3. (A) Microphotograph at 1 week after implantation in control rat. Masson's trichrome stain (×100). (B) Microphotograph at 2

랜트 주위로 재생된 골의 성숙을 나타내고 있었으며, 성숙된 골의 두께가 두꺼워진 양상을 보였다. 매식 후 8주군에서는 대조군에서 와 마찬가지로 임플랜트 계면 부위에서 성숙된 골이 임플랜트 계면 부위에서 발견되었다.

결과적으로 1주군과 2주군에서 실험군의 골 재생 양상이 대조 군에 비해 뛰어났으며 4주군, 8주군으로 갈수록 임플랜트 주위 골양상이 대조군과 비슷해짐을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

2) Masson's trichrome stain

(1) 대조군: 매식 후 1주군에서 임플랜트 계면에서 collagen 및 collagen 형성을 의미하는 푸른색이 나타났다. 4주군에서는 2주군에 비해 collagen 및 골 형성 증가로 인한 세포수가 감소하 였으며 collagen 및 골에 차지하는 범위가 증가되었다. 골소주가

더욱 규칙적인 형태로 관찰되고 형성된 collagen이 관찰되었다.

매식 후 8주군에서 역시 collagen 및 골 형성과 함께 골 소주 부위에서 성숙된 골의 증가와 함께 임플랜트 계면주위의 골 형성 이 더욱 규칙적인 형태를 보였다(Fig. 3).

(2) 실험군: 매식 후 1주군에서는 대조군에 비해 임플랜트 계면

주위로 푸른색의 collagen 및 골 형성이 우세하며 상대적으로

많은 세포 수를 확인할 수 있었다. 2주군에 이르러 실험군과 대조

군에서 비슷한 collagen 및 골형성을 보여주었으며 4주, 8주에도

실험군과 대조군이 비슷한 양상을 보였다. 결과적으로 실험군에

서 이른 시기의 골 개조 활성이 대조군보다 뛰어남을 확인할

수 있었으며 성숙된 골의 형성 역시 더 빠르게 일어남을 확인하였

다(Fig. 4).

Fig. 4. (A) Microphotograph at 1 week after implantation in experimental rat. Masson's trichrome stain (×100). (B) Microphotograph

Fig. 5. (A) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 1 weeks after implantation on tibia of the control rat (×100).

(B)　Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 2 weeks after implantation on tibia of the control rat (×100). (C) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 4 weeks after implantation on tibia of the control rat (×100). (D) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 8 weeks after implantation on tibia of the control rat (×100). (E) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 1 weeks after implantation on tibia of the Experimental rat (×100). (F) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 2 weeks after implantation on tibia of the Experimental rat (×100). (G) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerating bone at 4 weeks after implantation on tibia of the Experimental rat (×100). (H) Osteoprotegerin antibody reaction of regenerat- ing bone at 8 weeks after implantation on tibia of the Experimental rat (×100).

Table 1. OPG expression after implantation

implantation Control Experimental group

1 week ＋ ＋＋

2 week ＋/＋＋ ＋/＋＋

4 week ＋ ＋

8 week ＋ ＋

−, no immunoreactivity; ＋, weak but visible staining; ＋＋, moder- ate staining; ＋＋＋, strong staining intensity.

Fig. 6. (A)　Receptor activator of nuclear factor kB ligand antibody reaction of regenerating bone at 1 weeks after implantation on

2. OPG, RANKL의 발현에 대한 면역 조직 화학적 검사 소견

1) OPG

　OPG의 발현을 분석한 결과, 매식 후 1주 실험군에서 대조군 에 비해 뚜렷한 발현양상을 보였으며 2주 실험군은 대조군과 비슷 한 OPG의 발현도를 보였다. 또한 대조군 및 실험군 모두에서 1주군에 비해 2주군에서 발현의 증가를 보였으나 실험군에서의 발현 양상은 대조군에 비해 1주가량 빠르게 나타난 것으로 파악되 었다. 이후 4주와 8주까지 발현 양상은 두 군 모두에서 매식 후 2주째에 비해 감소하였다(Fig. 5, Table 1).

2) RANKL

실험군, 대조군 모두에서 RANKL이 파골세포와 연관되어 관찰

되었으며 임플랜트 계면 및 혈관 주위 세포에서 관찰되었다. 매식

후 1주 실험군에서 대조군에 비해 RANKL의 발현이 뚜렷하게

Table 2. RANKL expression after implantation

implantation Control Experimental group

1 week ＋ ＋/＋＋

2 week ＋/＋＋ ＋＋

4 week ＋ ＋

8 week ＋ ＋

−, no immunoreactivity; ＋, weak but visible staining; ＋＋, moder- ate staining; ＋＋＋, strong staining intensity.

나타났으며, 2주 실험군에서는 발현 양상이 더욱 증가하였다.

2주 대조군 역시 1주 대조군에 비해 RANKL 발현이 증가되었다.

4주 이후의 RANKL의 발현 양상은 실험군과 대조군이 비슷하게 나타났다. 결과적으로 실험군에서는 1주, 2주, 대조군에서는 2주 에서 더 뚜렷한 발현양상을 보였으며 이는 실험군에서 골 활성이 이른 시기에 일어났음을 알 수 있었다(Fig. 6, Table 2).

고 찰

성공적인 골유착은 임플랜트와 보철물 자체의 구조 및 재질과 도 연관이 있으나, 잔존하는 구강 내 조직의 조직학적 요소와 생역학적인 요소에도 크게 영향을 받는다. 즉, 치조골에 충분한 골량 및 골질이 확보되어야 하지만, 골다공증의 경우에는 그렇지 못한 경우가 많다. 골다공증은 전체 골체적에 대한 골조직양 (bony tissue volume)이 감소하고, 그로 인하여 골양(bony mass)의 결핍을 특징으로 하는 대사성 골질환으로 치조골에도 유사한 영향을 미친다[22,23].

Martin 등[24]은 골다공증이 있을 경우 임플랜트 식립 시에 임프랜트의 고정이 감소할 수 있다고 하였고, Pan 등[25]은 임플 랜트 주위의 골량이 감소되며 임플랜트-골 접촉이 감소한다고 보고하였으며, Mori 등[26]은 골다공증이 임플랜트 주위골 치유에 영향을 미치지만 골유착은 일어난다고 보고하였다. Erdogan 등 [8]은 골다공증이 임플랜트 식립과 골이식시에 골이식편의 흡수, 비유착, 치유시간 지연 등과 관련이 있을 수 있다고 보고하였으며, 그럼에도 임플란트 식립 및 골이식의 절대적인 비적응증은 아니라 고 보고하였다. 이에 치과임플랜트 매식시 상대적인 비적응증이 되는 골다공증 환자에서 보다 효율적인 골유착을 위한 연구가 필요하다고 사료된다.

현재까지도 불량한 골환경에서의 성공적인 골유착을 이루기 위해 많은 연구가 진행되었다. 첫째는 임플랜트 자체에 관한 것으 로 생체적합성, 표면형태, 화학적 조성, 표면처리방법과 관련된 요소들에 대한 것이다. 두 번째는 숙주골의 상태에 관한 것으로, 최소한의 외과적 침습수술이나 숙주골의 세포활성이나 혈관화에 관한 것이다. 세 번째는 기계적인 안정성에 관한 것으로 초기고정 력과 식립된 임플랜트의 미세한 움직임이 없도록 하는 것이다.

마지막으로 부가적인 처치로 골유착을 얻기위한 연구들이다. 여 기에는 자가골이나 합성골 등의 골이식법과 LIPUS, PEMF, LLLT 등과 같이 물리적인 자극을 주어서 골유착을 증대시키려는 bio- physical stimulation, 전신적으로 골형성에 관여하는 호르몬 등 을 투여하는 방법, BMP나 TGFβ 등의 골활성 단백질이나 줄기 세포를 이용해서 osteoblast cell을 유도한 뒤 세포자체를 임플랜 트 표면에 주입하는 osteogenic coating법 등이 있다[12].

Osteogenic coating법 중 주목받고 있는 중간엽 줄기세포는 골수에서 처음으로 확인되어, 골막, 활액막, 골격근, 폐를 비롯하 여 지방조직에서도 분리되는데, 지방세포, 연골세포, 근모 세포 및 골모 세포 등으로 분화가 가능하며 배양 조건에 따라 신경과 혈관의 표현형을 나타내기도 한다[17-19].

지방줄기세포는 다른 줄기세포와는 달리 지방조직에서 쉽게 분리 및 배양되어지며, 채취가 간단하고, 자가세포를 이용하므로 면역거부반응이 없으며, 암을 유발하지 않으므로 임상적으로 유 용한 측면이 있다. 최근 연구에서는 지방조직에서 중간엽 줄기세 포를 분리하여, 골모세포로 분화시키는 연구에서 성과가 있었다 [21,27].

본 연구에서는 백서에서 지방조직을 추출하여 성인 줄기세포를 분리하여 이를 임플랜트 매식과 병행하여 osteogenic coating법 으로서 골유착의 정도나 속도를 개선시킬 수 있는 방법으로 줄기 세포 활용에 대한 효용성을 검증하고자 하였으며, 임플랜트와 골계면간의 골유착에 보다 효율적인 치유를 위해 저출력 초음파를 부가적으로 적용시켜 보고자 실험을 계획하였다.

저출력 파동형 초음파는 자극이 적은 초음파를 이용한 창상치 유 촉진방법으로, 주로 1 MHz와 3 MHz의 주파수를 사용한다.

1 MHz는 약 3 cm, 3 MHz는 약 1 cm 정도의 조직 심부로 물리적 자극 및 온열이 유효하게 도달되는데, 1 MHz가 3 MHz에 비해서 에너지가 더 확산되어서 전달된다. 그러므로 임플랜트의 골유합을 촉진시키는 목적으로는 주로 3 MHz의 주파수를 채택된 다.

Machen 등[10]은 저출력 파동형 초음파가 골재생에 영향을 미치는 기계적, 열적, 전기적 기전을 제시하였다. 기계적 기전은 저출력 초음파가 미세 움직임을 일으켜, 직접적으로 또는 이차적 인 chemical mediator를 통해 골강도를 변화시킨다. 두 번째로 열적 기전은 저출력 초음파가 국소적으로 조직의 온도를 1도 이하 의 범위에서 상승시키므로, 이것이 collagenase 같은 효소의 활 성을 변화시킴으로서 일어난다. 세 번째로 전기적 기전은 저출력 초음파가 세포막의 electrical potential을 변화시켜 골유도성 화 학 신호나 다른 메카니즘의 생성을 통해 골 생성을 자극하게 된다.

1983년 Duarte[13]가 최초로 골의 성장에 사용한 이후 1994년

Heckman 등[14]이 잘 치유되지 않는 경골 골절에 있어서 저출력

파동형 초음파를 적용하여 탁월한 치유를 보였다고 발표하였다.

이후 1997년 Kristiansen 등[28]은 요골 골절을 가진 61명의 환자 에 대해 저출력 파동형 초음파를 적용한 임상 실험에서 치유기간 이 실험군에서 61일, 대조군에서 98일로 나타나 저출력 파동형 초음파가 치유를 촉진하여 치유기간을 단축하였다고 보고하였다.

또한 최근에는 저출력 초음파를 이용한 골세포 활성화에 대한 연구들도 보고되고 있다[29,30].

이에 본 연구에서는 골다공증을 유도한 백서의 경골에 임플랜 트를 매식 시 지방 조직 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하여 임플랜트 주위 골생성을 유도한 뒤에, 추가적으로 골유착을 촉진 하기 위해 biophysical stimulation의 일환으로 저출력 파동형 초음파를 적용하여 그 효과를 검증하고자 하였다.

골재형성에 관한 연구에서 골치유 인자들의 변화량을 보고 골대사의 정도를 확인할 수가 있으며 골재생 및 골개조에 직접 관계하는 골모세포와 파골세포의 분포변화를 관찰함으로써 이 과정을 파악할 수 있다. 이는 1990년대 중후반에 RANKL/RANK/

OPG system과 골흡수를 조절하는 이 system의 역할에 대한 연구들이 이루어짐으로 인해서 골재형성에 대해 많은 부분이 밝혀 졌다[31].

RANKL은 또한 TNF-related activation-induced cytokine (TRANCE), osteoprotegerin ligand (OPGL), osteoclast dif- ferentiation factor로도 알려져 있으며 bone metabolism에 중 요한 분자이다. 이는 골모세포에서 발견되는 자연적이면서 필수 적인 surface-bound molecule이며, 골의 흡수에 작용하는 세포 인 파골세포를 활성화시킨다.

OPG는 osteoclastogenesis inhibitory factor로도 알려져 있 으며 이는 파골세포의 형성을 억제할 수 있는 사이토카인이다.

OPG는 파골세포 전구세포가 파골세포로 분화되는 것을 억제하 고 또한 파골세포의 흡수를 조절할 수 있다. OPG는 RANK의 동족체(homolog)로서 골모세포의 RANKL에 결합하므로 작용 해서 골모세포와 파골세포 전구세포(osteoclast precursor) 사이 의 RANKL-RANK 리간드 상호작용(ligand interaction)을 차단 하게 된다. 이는 파골세포 전구세포가 성숙한 파골세포로 분화하 는 것을 차단하는 효과를 내게 된다. Recombinant human OPG 는 특히 골에서 작용하며, 골밀도와 골량을 증가시킨다[32-34].

OPG와 RANKL의 비율은 골량와 골흡수의 양상을 인지할 수 있는 인자가 될 수 있으므로 시기에 따른 OPG와 RANKL의 발현 양상을 살펴보면 골형성 및 골흡수의 양상을 평가할 수 있으며, 전체적인 골개조의 양상을 평가할 수 있다[35].

본 실험에서는 병리 조직학적 분석 결과 골다공증이 유도된 백서에서도 임플랜트 주위의 골 형성은 성공적으로 일어남을 볼 수 있었다. 하지만 지방조직 유래 줄기세포 및 저출력 파동형 초음파를 추가적으로 적용한 경우 임플랜트 계면의 골조직은 더 빠르게 성숙되었으며, 광화가 우수하게 진행됨을 관찰하였다. 특 히 임플랜트 매식 후 1주 경과 후 대조군에 비해 실험군에서

임플랜트 주위 골 형성 정도가 뛰어났으며 collagen 및 골내 혈관의 수 역시 대조군에 비해 실험군에서 많음을 관찰할 수 있었다. 이는 지방조직 유래 줄기 세포를 주입 후 저출력 초음파를 적용함으로써 임플랜트 매식 후 초기에 발생하는 골개조 활성이 증가하였다고 판단할 수 있으며, 대조군에 비해 더 이른 시기에 발생하는 골개조 활성이 임플랜트 초기 고정에 도움이 된 것으로 사료되었다.

또한 지방 조직 유래 줄기세포가 골다공증이 유도된 백서에서 골형성 작용을 촉진시키는지 알아보기 위하여 골모세포 및 파골세 포의 분화, 생성 등에 중요하게 관여하는 OPG, RANKL의 변화를 면역 조직 화학 염색법으로 확인하고 발현도를 분석하였다. 그 결과 대조군과 실험군 모두에서 OPG의 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었으며 매식 후 2주까지 OPG 발현 양상은 대조군에 비해 실험군에서 뚜렷했고 이후 8주까지 발현양상은 대조군과 실험군 에서 차이가 없었다. RANKL의 발현은 매식 후 1주와 2주 실험군 에서 그 대조군에 비해 뚜렷한 발현을 보였다. 4주 이후의 RANKL 의 발현 양상은 실험군과 대조군이 비슷하였다. OPG 및 RANKL 의 발현 양상으로 볼 때 실험군에서 매식 1주 후 발현이 빠르게 증가한 것은 줄기세포 주입 시 더 이른 시기에 파골 세포의 분화가 증가하였고 저출력 파동형 초음파의 영향으로 인해 초기에 왕성한 골 개조 활성이 일어났음을 추정할 수 있었다.

이미 성체 줄기 세포의 골 형성 능력에 대한 가능성 및 저출력 파동형 초음파의 골 생성 촉진 능력에 대한 연구들이 있었고, 성체 줄기 세포와 저출력 파동형 초음파는 각각 우수한 골형성 유도능력이 있음이 밝혀졌으며, 여러 분야에서 임상적 적용을 위한 준비가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 성체 줄기 세포와 저출력 파동형 초음파의 복합적인 사용이 임플랜트 영역에 있어서 골 이식이 필요한 경우 골량을 증가시키고 골형성 촉진을 증가시 킬 수 있다고 생각되었기에 골다공증을 유도한 백서를 이용한 실험을 진행하였다. 그 결과 임플랜트 식립 시 지방 조직 유래의 줄기 세포를 주입하고 저출력 초음파를 적용한 경우에 있어서 식립 후 초기 1∼2주 사이에 우수한 골 개조 활성 및 많은 골 생성을 확인하였다. 하지만 아직 명확하게 밝혀지지 않은 저출력 파동형 초음파의 기전에 대한 추가적인 연구가 필요하며 또한 저출력 파동형 초음파가 체내에 주입한 지방 조직 유래 줄기 세포에 구체적으로 어떤 영향을 미치는지에 대한 추가적인 연구도 필요할 것으로 사료된다.

결 론

난소 절제를 통해 골다공증을 유도한 백서의 경골에 임플랜트 를 매식 시 지방조직유래의 줄기세포를 주입하였으며, 임플랜트 매식 후 저출력 초음파를 주파수 3 MHz, 초음파 출력 40 mW/

cm

로 14일간 매일 10분씩 적용하여 세포 활동 및 조골 세포의

분화를 유도하였다. 이후 줄기세포와 저출력 초음파가 임플란트 에 미치는 골형성 및 재생에 관한 효과를 확인하기 위해 임플랜트 매식 후 1, 2, 4, 8주에 백서를 희생하여 병리조직학적 검사와 골재생에 중요하게 관여하는 사이토카인으로 알려진 OPG, RANKL의 변화를 면역 조직 화학 염색법으로 확인하고 발현도를 분석을 시행하고 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 병리 조직학적 분석을 통해 지방조직 유래 줄기세포를 주입 하고 저출력 파동형 초음파를 추가적으로 적용한 실험군에서 임플 란트 계면의 골조직이 더 빠르게 성숙되었으며 광화도 우수하게 조직됨을 관찰하였다. 특히 임플랜트 매식 후 1주군에서 대조군에 비해 실험군에서 임플랜트 주위 골 형성 정도가 뛰어났으며 colla- gen 및 골내 혈관의 수 역시 대조군에 비해 실험군에서 많이 형성되었다.

2. 면역 조직 화학적 분석을 통해 OPG의 발현 정도를 관찰한 결과 대조군과 실험군 모두 OPG의 발현이 증가되었으며 매식 후 1주까지 OPG 발현 양상은 대조군에 비해 실험군에서 뚜렷했 고 이후 2주에서 8주까지 발현양상은 대조군과 실험군에서 차이 가 없었다.

3. 면역 조직 화학적 분석을 통해 RANKL의 발현 정도를 관찰 한 결과 RANKL의 발현은 매식 후 실험군에서는 1주째 대조군에 비해 발현이 증가되어 나타났으며, 2주군에는 1주군에 비해 RANKL의 발현은 좀 더 증가된 양상을 나타냈다. 대조군 역시 1주군에 비해 2주군에서 RANKL 발현의 증가를 보였으나 실험군 보다는 약하게 발현되었다. 4주 이후의 RANKL의 발현 양상은 실험군과 대조군이 비슷하게 나타났다.

이상의 결과를 종합하여 보면, 골다공증 유도 백서에서 지방 조직 유래의 성체 줄기세포 주입과 저출력 파동형 초음파의 추가 적인 적용이 임플랜트의 주위 골 반응에서 초기 골세포 형성과 분화 촉진에 긍정적인 효과를 보이는 것으로 나타났다. 이는 임플 랜트 식립 후 초기 골 개조 활성을 빠르게 하고 이어 임플랜트의 초기 골유착에도 도움이 될 것으로 생각된다.

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