Effect on bone healing by the application of low intensity pulsed ultrasound after injection of adipose tissue-derived stem cells at the implantation of titanium implant in the tibia of diabetes-induced rat

Ⅰ.

임플란트 치료에 있어서 전신질환은 환자의 치료계획과

임플란트 수술에 있어서 중요한 영향을 미친다. 임플란트 치료의 성공에 영향을 미치는 전신질환 중에서 당뇨병은 임플란트의 골유착과 골 재형성에 영향을 주는 대표적인 전신질환이다

. 우리나라에도 연간 당뇨병 발생률이 전체 인구의 2.5%에 이르고 있어

, 임플란트 치료에 있어서 당 뇨병은 중요하게 고려해야 할 전신질환 중 하나가 되었다.

당뇨병 환자에서는 감염과 혈관질환이 병발하기 쉽고, 치유과정은 손상된 혈관기능으로 인한 화학주성, 호중구 기능 손상, 무산소성 환경 등에 의해 영향을 받으며, 단백 질대사는 감소되고 연조직과 경조직의 치유는 늦어진다

. 김 욱 규

626-870 경남 양산시 물금읍 범어리

부산대학교 치의학전문대학원 구강악안면외과학교실 Uk-Kyu Kim

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, Pusan National University

Beomeo-ri, Mulgeum-eup, Yangsan, 626-870, Korea TEL: +82-55-360-5100 FAX: +82-55-360-5104 E-mail: [email protected]

당뇨유도 백서 경골에 티타늄 임플란트 매식 시 지방조직 유래 줄기세포 주입 후 저출력 초음파 적용이 골치유에 미치는 영향

정태영

∙박상준

∙황대석

∙김용덕

∙이수운

∙김욱규

1

인제대학교 부산백병원 구강악안면외과,

부산대학교 치의학전문대학원 구강악안면외과학교실,

3

인제대학교 해운대백병원 구강악안면외과

Effect on bone healing by the application of low intensity pulsed ultrasound after injection of adipose tissue-derived stem cells at the implantation of titanium implant in the tibia of diabetes-induced rat

Tae-Young Jung

, Sang-Jun Park

, Dae-Suk Hwang

, Yong-Deok Kim

, Soo-Woon Lee

, Uk-Kyu Kim

1

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Inje University Pusan Paik Hospital, Busan,

2

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Pusan National University School of Dentistry,Yangsan,

3

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Inje University Haeundae Paik Hospital, Busan, Korea

Introduction: This study examined the effect of the application of low intensity pulsed ultrasound on bone healing after an injection of adipose tis- sue-derived stem cells (ADSCs) during the implantation of a titanium implant in the tibia of diabetes-induced rats.

Materials and Methods: Twelve Sprague-Dawely rats were used. After inducing diabetes, the ADSCs were injected into the hole for the implant.

Customized screw type implants, 2.0 mm in diameter and 3.5 ㎜ in length, were implanted in both the tibia of the diabetes-induced rats. After implan- tation, LIPUS was applied with parameters of 3 MHz, 40 mW/cm

, and 10 minutes for 7 days to the left tibiae (experimental group) of the diabetes- induced rats. The right tibiae in each rat were used in the control group. At 1, 2 and 4 week rats were sacrificed, and the bone tissues of both tibia were harvested. The bone tissues of the three rats in each week were used for bone-to-implant contact (BIC) and bone area (BA) analyses and the bone tis- sues of one rat were used to make sagittal serial sections.

Results: In histomorphometric analyses, the BIC in the experimental and control group were respectively, 39.00±18.17% and 42.87±9.27% at 1 week, 43.74±6.83% and 32.27±6.00% at 2 weeks, and 32.62±11.02% and 47.10±9.77% at 4 weeks. The BA in experimental and control group were respectively, 37.28±3.68% and 31.90±2.84% at 1 week, 20.62±2.47% and 15.64±2.69% at 2 weeks, and 11.37±4.54% and 17.69±8.77%

at 4 weeks. In immunohistochemistry analyses, Osteoprotegerin expression was strong at 1 and 2 weeks in the experimental group than the control group. Receptor activator of nuclear factor kB ligand expression showed similar staining at each week in the experimental and control group.

Conclusion: These results suggest that the application of low intensity pulsed ultrasound after an injection of adipose tissue-derived stem cells dur- ing the implantation of titanium implants in the tibia of diabetes-induced rats provided some positive effect on bone regeneration at the early stage after implantation. On the other hand, this method is unable to increase the level of osseointegration and bone regeneration of the implant in an uncon- trolled diabetic patient.

Key words: Diabetes, Implant, Low intensity pulsed ultrasound, ADSCs

[paper submitted 2011. 3. 8 / revised 2011. 7. 22 / accepted 2011. 7. 25]

Abstract (J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37:301-11)

골에 대한 당뇨병의 영향에 있어서는 고혈당에 의해 여러 다양한 조직에 염증 반응이 야기되고 골흡수가 자극된다

. 또한 고혈당은 골모세포의 분화를 억제하고 인과 칼슘 대 사를 조절하는 부갑상선 호르몬의 반응을 변화시키며, 골 기질과 그 성분에 해로운 효과를 줄 뿐 아니라 세포외 기질 의 부착, 성장, 축적 등에도 해로운 영향을 준다

. 임플란 트의 골유착에 있어서 당뇨병의 영향에 대한 연구가 시행 되었는데 동물실험 결과 골-임플란트 접촉이 감소하며

, 피 질골이 아닌 망상골에서의 골유착(osseointegration)이 감소

되었다

. 이러한 당뇨병 환자에 대한 임플란트 치료에 있어

서는 골유착과 골 재형성을 촉진하기 위한 방법들이 필요 하며, 특히 당뇨에 의한 골모세포의 분화 억제를 개선하고 분화를 촉진하여 골 형성을 향상시키는 방법들이 필요하다.

저출력 초음파(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)는 정형외과 영역에서 골절치료 후 골유합을 높이는 방식으 로 적용해 왔으며, 창상치유의 촉진과 골절의 치유에 유효 하다고 보고되었다

. 여러 연구들에서 LIPUS 적용이 골 모세포의 분화를 촉진하여 골 형성을 증가시키는 것으로 보고되었다

. 또한 정형외과 영역에서의 임플란트 골유 착에 있어서도 LIPUS의 적용이 골유착에 긍정적인 결과를

보였으며

, 이러한 LIPUS의 골재생과 골유착에 대한 효

과를 치과치료에 응용하고자 하는 연구들이 있었다

. 더불어 임플란트 치료에 있어 중요한 부분인 골 재형성 에 관련된 부분에서 줄기세포를 이용한 조직공학을 통해 골 재형성을 향상시키려는 연구들이 있었다

. 이 중에서 성체줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에서 발견되는 미분화 세포로 스스로 증식할 수 있으며, 특수한 기능을 보유하는 세포로 분화할 수 있는 능력이 있어 세포 의 특성을 유지하고, 손상된 세포가 있으면 치료하는 역할 을 한다. 또한 성체줄기세포는 분화다양성이 배아줄기세 포만큼 크지는 않으나, 특정 배양조건을 조절함으로써 골 모세포, 연골모세포, 근육모세포, 신경세포 등으로 분화가 가능함이 밝혀졌다

.

성체줄기세포 중에서 지방조직 유래 줄기세포는 윤리적 인 문제가 없고, 채취가 용이하여 많이 이용되고 있으며, 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 골모세포로의 분화에 대한 연구들이 보고되었다

. 또한 임플란트 식립 시 지방 조직 유래 줄기세포의 적용이 초기 골 재형성에 긍정적인 효과를 보인 연구가 있었고

, 더불어 성체줄기세포가 골모 세포로 분화하는 데 있어 LIPUS의 적용이 골모세포로의 분화를 촉진한다는 보고들도 있었다

.

따라서 본 연구에서는 당뇨환자의 임플란트 치료에 있어 임플란트의 골유착과 골 재형성을 촉진시키기 위한 방법 으로 지방조직 유래 줄기세포를 임플란트 식립 부위에 이 식하고, 이와 함께 오래 전부터 정형외과 영역에서 골절치 료 후 골유합을 높이는 방식으로 적용해 왔던 LIPUS를 복 합 적용한 술식이 임플란트의 골유착과 골 재형성을 촉진 시키는지 평가하기 위하여 동물연구를 시행하였다.

Ⅱ.

1. 연구 대상

실험 동물은 일정 기간 동일 조건 하에서 사육한 250 g 내 외의 자성 백서 16마리를 이용하였으며, 당뇨 유도 후 임플 란트 식립 시 지방세포 유래 줄기세포를 각 쥐의 좌, 우측 경골에 주입 후 임플란트를 식립하였고, 술 후 1주간 LIPUS를 적용한 좌측 경골을 실험군으로, 적용하지 않은 우측 경골을 대조군으로 이용하였다.

실험 재료는 순수 티타늄(commercially pure titanium- grade 3)으로 주문 제작한 직경 2.0 mm, 길이 3.5 mm의 나 사형 임플란트(Cowellmedi, Busan, Korea)가 사용되었다.

LIPUS 적용을 위해서 저출력 초음파기기(BR-Sonic, ITO Co., Tokyo, Japan)가 사용되었다.

2. 연구 방법

모든 실험은 부산대학교 동물실험윤리위원회 운영규정에 따라 심의하고, 그 내용이 동물실험의 신뢰성, 안전성, 윤리 성 등의 측면에서 적합하여 동물실험을 승인 받았으며, 모 든 사항을 준수하여 시행하였다.(승인번호:PNU-2009-24)

1) 당뇨 유발

Streptozotocin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 citric acid (0.1 mol/l, pH 4.5)에 용해시켜 60 mg/kg을 복강 내에 투여하는 방법을 사용하였다. 1주 후에 미정맥에서 혈액을 채취하여 혈당계(Accu-chek sensor, Roche, Basel, Swiss)로 혈당치를 측정하고 그 수치가 300 mg/dl 이상인 동물만을 당뇨 백서로 인정하였다.

2) 지방조직 유래 줄기세포 분리

Enflurane (Gerolan, Choongwae, Seoul, Korea)과 산소압의

농도를 1:1로 혼합하여 백서에 흡입마취를 통한 전신마취

시행 후, 복부 제모를 시행하고 베타딘 용액을 도포하여 소

독하였다. 수술용 가위를 이용하여 복부에 3 cm의 수직절

개를 가하여 복부를 노출시키고, 복부에 존재하는 지방을

조심스럽게 분리한 후 통법에 따라 봉합하였다. 이후 gen-

tamycin (Gentamycin, Choongwae) 항생제(3 mg/kg)를 근주

하였다. 분리된 지방을 phosphate-buffered saline (PBS)로 2-

3회 세척을 시행하고, 잘게 썬 지방에 0.075% (w/v) collage-

nase typeⅠ (Sigma-Aldrich Co.)를 넣어 섞은 후, 37℃에서

20-30분간 incubation해주었다. 이후 10% fetal bovine serum

(FBS; Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 함유한

modified Eagle’ s medium (α-MEM; Gibco, Invitrogen Co.) 배

지를 지방과 동량 넣어 섞고, 1,200 rpm에서 10분간 원심분

리를 시행하였다. Pellet만 남기고 나머지 내용물을 흡인한

후 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지를 이용하여 pellet 부유

(suspension)와 nylon mesh에 걸러서 dish에 분주하였다. 분 리된 세포가 지방조직 유래 줄기세포 인지를 평가하기 위 한 방법으로 동일한 방법으로 시행된 이전 연구에서 FACScan argon laser cytometer (Becton Dickson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 유동 세포계수검사(flow cytometry) 를 시행하였으며, 검사 결과 분리된 세포들은 CD44에 양 성반응을 보이고 CD45에 음성반응을 보여 미분화된 지방 조직유래 줄기세포임을 확인할 수 있었다

. 이 결과를 바 탕으로 동일한 방법으로 시행된 본 연구에서는 분리된 세 포에 대한 유동 세포계수검사를 시행하지 않았다.

3) 지방조직 유래 줄기세포의 배양 및 주입 준비

분리한 줄기세포를 2주간 37℃ 인큐베이터에서 배양한 후 세포의 세척, 분리, 계수 과정 등을 시행하였다. 세포가 들어있는 배지를 흡인하고 PBS를 5 ml 넣어 dish를 천천히 흔든 다음 PBS 흡인 후 한 번 더 세척을 하고, trypsin EDTA (Sigma-Aldrich Co.) 용액을 1 mL 넣은 다음 37℃ 인큐베이 터에서 2분간 둔 다음 현미경으로 세포가 분리되었는지 확 인하고 FBS가 들어간 배지를 5-10 mL 넣어 세포를 회수하 여 tube에 담았다. 1,200 rpm에서 4분간 원심분리 한 다음 tube 아래 모인 pellet은 남기고 배지는 흡인하였다. Pellet을 1 mL PBS로 부유한 후 계수기(count meter)에 cover glass를 깔고 부유한 세포 중 10 μl를 넣었다. 계수를 시행하고 난 후, 동물에 주입할 세포의 경우 PBS를 넣고 원심분리를 위 와 동일한 조건에서 해주었다. 필요한 개수의 세포를 total 10-15 μl 정도의 PBS에 부유하였으며, 각 임플란트 식립 부 위에 약 5×10

개의 세포가 주입되도록 준비하였다.(Fig. 1)

4) 임플란트 식립 및 LIPUS 적용

당뇨가 유도된 16마리의 백서에 enflurane과 산소압의 농 도를 1:1로 혼합하여 흡입 마취를 통한 전신마취 시행 후, 좌, 우측 경골부를 골막까지 박리하고 골을 노출시켰다. 이

후 경골 근심 측 5 mm 부분의 경골 외측 최대 폭경부 중앙 부에 직경 1.6 mm round bur를 이용하여 임플란트 식립 골 구를 형성하고, 준비된 줄기세포를 주사기를 이용하여 주 입하였다. 이후 임플란트를 골수강에 도달할 때까지 조심 스럽게 식립하고, 통법에 따라 봉합한 후 gentamycin (3 mg/kg)을 근주하였다.

임플란트 식립 후 다음 날부터 1주일 동안 매일 저출력 초음파를 좌측 경골(실험군) 임플란트 식립부에 주파수 3 MHz, 초음파 출력 40 mW/cm

로 10분간 적용하였다. 우측 경골(대조군)은 저출력 초음파를 적용하지 않았다.

4) 표본 제작

임플란트 식립 후 각 주당 4마리씩 선택하여 1주, 2주, 4 주, 6주가 경과한 백서들에 대하여 흡입을 통한 전신마취 를 시행한 후 심장 관류법으로 흉곽을 열어 심장을 노출시 켰다. 이후 좌심실에 20 게이지 바늘을 삽입하고 겸자 고정 후 연동 관류 펌프를 작용시켜서 체순환시키고, 우심 방벽 을 절개하여 피를 배출시킨 후 PBS를 사용하여 체내혈액 을 세척하였다. 이후 4% paraformaldehyde 고정액을 다시 30분간 펌프 관류시킨 후 대퇴 관절을 포함하여 경골을 절 단하여 조직을 채취하였다. 각 주당 3마리에서 채취된 조 직들은 조직형태계측학적 분석에 이용되었다. 채취된 조 직은 70% 알코올에서 3일 간 고정을 한 후 villanueva 염색 용액에서 7-10일간 두어 염색을 먼저 시행하였다. 탈수와 탈색을 위해 50, 70, 80, 95, 100% 알코올 용액들에 각각 4시 간씩 거친 후 완전한 탈수를 위해 propylene oxide에 두어 하룻밤을 보냈다. 블록은 에폭시 레진(Eponate, TedPella Inc., Redding, CA, USA)을 사용하여 60℃ 인큐베이터에서 3일간 굳혀서 만들었다. 이후 trimming 절편은 Accutom50 (Struers Co., Copenhagen, Denmark), 연마(grinding)는 미세 절단 및 연마 시스템(EXAKT, Exakt Co., Norderstedt, Germany)을 이용하여 10-20 μm 두께의 조직 슬라이드를 제작하였다.

각 주당 1마리의 조직들은 동일한 고정액에 24시간 고정 시킨 후 10% EDTA와 NaOH를 녹인 탈회액에 12주간 탈회 시켰다. 이후 조직을 조직캡슐에 넣어 흐르는 물에 12시간 동안 수세한 다음, 통상적인 방법에 따라 알코올과 xylene 으로 탈수와 투명화를 한 후 파라핀에 포매하고 6 μm 두께 의 시상연속절편을 만들었다.

6) 조직형태계측학적 분석

(1) Bone-to-implant contact (BIC) ratio: 임플란트의 나사산 을 따라 직접 접촉하고 있는 골조직의 비율

BIC (in %)=BIC 전체 길이×100/전체 임플란트 나사산 길이 (2) Bone area (BA) ratio: 임플란트의 나사산 한계 내에 존

재하는 골조직의 비율을 측정함

BA (in %)=나사산 한계 내의 전체 BA×100/나사산 한계 내의 전체 면적

Fig. 1. Cultivated adipose tissue-derived stem cells.

이 수치들은 각 임플란트의 양측 4번째 나사산까지의 골 조직을 광학현미경(Axioscop, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 관찰한 후(×100), Axiovision (Carl Zeiss) 프로그 램을 이용하여 수치를 계측하고 그 비율을 계산하였 다.(Fig. 2)

7) 조직학적 분석

(1) Hematoxylin-Eosin (H-E) stain

H-E 염색표본에서 골생성 관련 세포 및 세포 외 기질을 관찰하기 위해 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.

(2) Masson’ s trichrome stain

교원질의 생성정도에 따른 광화된 골조직과 비광화된 골 조직을 관찰하기 위해 상기 제작된 6 μm 두께의 파라핀 조 직 절편을 xylene으로 파라핀을 제거하고 Bouin (Sigma- Aldrich Co.) 용액에 실온에서 하룻밤 담가 놓은 후, 조직표 본의 노란색이 없어질 때까지 유수에 수세하였다. 증류수 로 여러 번 세척하고 weigert iron hematoxylin 용액에 10분 간 핵 염색을 하였다. 이후 유수에 10분간 수세하여 핵을 청화시키고 Biebrich Scarlet-acid fuchsin (Sigma-Aldrich Co.) 용액에 10분간 염색하였다. 증류수로 여러 번 세척 후 phosphomlybdic-phosphotungstic acid 용액에 10분간 처리하 였다. 수세하지 않고 aniline blue 용액에 5분간 염색한 후 증류수로 여러 번 세척하였다. 이후 1% acetic acid 용액에 1-3분간 적용시킨 다음 증류수로 여러 번 세척하였다. 탈수 및 투명과정을 거친 후 봉입하였다.

(3) 면역조직화학적 검사(immunohistochemistry)

Osteoprotegerin (OPG)과 receptor activator of nuclear factor

kB ligand (RANKL)의 발현을 분석하기 위한 과정으로서 파라핀 포매 조직으로부터 4 μm 두께의 절편을 얻어 코팅 슬라이드에 부착시킨 다음, 60℃ 오븐에 1시간 넣은 후 xylene으로 5분간 4회 반복 처리하여 탈 파라핀하고 여러 단계의 알코올로 함수 후 증류수로 세척하였다. 세척 완충 액으로 3분씩 3회 세척하고 조직 내의 내인성 과산화효소 를 제거하기 위하여 0.3% H

O

용액에 5분간 반응시켰다.

이어서 세척 완충액으로 4회 수세 후 조직 내 비특이적 결 합을 억제하기 위해 blocking serum (Goat immunocruz stain- ing system, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 을 1시간 반응시킨 후 각각의 일차 항체, OPG (sc-8468, Santa Cruz Biotechnology)와 RANKL (sc-7692, Santa Cruz Biotechnology)을 희석하여 (OPG 1:80, RANKL 1:70) 하룻 밤 반응시켰다. 세척 완충액으로 수세한 다음 biotin이 표시 된 이차 항체(Goat immunocruz staining system, Santa Cruz Biotechnology)를 1시간 반응시킨 후 세척 완충액으로 4회 수세하고 enzyme conjugate streptavidin (Goat immunocruz staining system, Santa Cruz Biotechnology)로 1시간 반응시 켰다. 다시 세척 완충액으로 4회 수세 후 DAB로 발색하고 증류수로 수세한 후 hematoxylin으로 대조 염색하여 관찰 하였다. 이후 광학현미경을 이용하여 OPG와 RANKL의 발 현 양상을 관찰하고 그 결과를 -: no immunoreactivity, +:

weak but visible staining, ++: moderate staining, +++: strong staining intensity 등의 4등급 발색 반응으로 나누어 분석하 였다.

8) 통계방법 및 분석

조직형태계측학적 계측치인 BIC와 BA에 대한 통계적 분 석을 시행하였다. 통계적 분석은 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 사용하여, paired t-test로 유의 성을 검정하였고, P<0.05인 경우 유의하다고 판정하였다.

Ⅲ.

1. 조직형태계측학적 분석

1) BIC

조직 슬라이드 제작 시 6주군에서 조직의 탈락이 많이 발 생되어 6주군 4마리 쥐들의 조직은 분석에서 제외되었다.

조직형태계측학적 분석에서 실험군과 대조군의 평균 BIC 값은 1주군에서는 각각 39.00±18.17%와 42.87±9.27%, 2 주군에서는 43.74±6.83%와 32.27±6.00%, 4주군에서는 32.62±11.02%와 47.10±9.77% 등으로 측정되었다.(Table 1, Fig. 3) 각 주군의 평균 BIC값의 비교에서 2주군에서는 실험군의 평균값이 대조군에 비해 높은 값을 보였고, 1주 와 4주군에서는 대조군의 평균값이 실험군보다 다소 높은 값을 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다.

(P>0.05)(Table 1, Fig. 3)

Fig. 2. Non-decalcified section: histological aspects observed

within the limits of the thread.(Villanueva stain, ×100)

2) BA

조직형태계측학적 분석에서 실험군과 대조군의 평균 BA값은 1주군에서는 각각 37.28±3.68%와 31.90±2.84%, 2주군에서는 20.62±2.47%와 15.64±2.69%, 4주군에서는 11.37±4.54%와 17.69±8.77% 등으로 측정되었다.(Table 2, Fig. 4) 각 주군의 평균 BA값의 비교에서 1주와 2주군에서 는 실험군의 평균값이 대조군에 비해 높은 값을 보였고, 4 주군에서는 대조군의 평균값이 실험군보다 높은 값을 보 였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다.

(P>0.05)(Table 2, Fig. 4)

2. 조직학적 소견

1) H-E stain

1주군에서 실험군과 대조군에 대한 조직비교에서는 임 플란트 주위로 대조군에 비교하여 실험군에서 약간 많은 골기질이 형성된 것이 관찰되었다.(Figs. 5. A, 5. B) 2주군 에서는 임플란트 주위로 대조군과 비교하여 실험군에서 약간 많은 골기질이 형성된 것이 관찰되었다.(Figs. 5. C, 5.

D) 4주군에서는 임플란트 주위로 실험군과 비교하여 대조 군에서 다소 많은 골조직이 형성된 것이 관찰되었다.(Figs.

5. E, 5. F)

2) Masson’ s trichrome stain

1주군에서 실험군과 대조군에 대한 조직비교에서는 임 플란트 주위로 대조군에 비교하여 실험군에서 약간 많은 콜 라 겐 과 비 광 화 된 골 기 질 의 형 성 소 견 이 관 찰 되 었 다.(Figs. 6. A, 6. B) 2주군에서는 임플란트 주위로 대조군 과 비교하여 실험군에서 약간 많은 콜라겐과 비광화된 골 기질의 형성소견이 관찰되었으나 1주군에 비해서는 차이 가 적었다.(Figs. 6. C, 6. D) 4주군에서는 임플란트 주위로 실험군과 비교하여 대조군에서 다소 많은 콜라겐과 골 형 성 소견이 관찰되었다.(Figs. 6. E, 6. F)

3) 면역조직화학적 검사 (1) OPG 발현

OPG 발현을 분석한 결과 1주와 2주군 모두에서 대조군 은 중등도의 발현양상을 보였으나 실험군에서는 강한 발 현양상을 보였다. 4주군에서는 실험군과 대조군 모두 약한 발현양상을 보였다.(Table 3, Figs. 7. A-F)

(2) RANKL 발현

RANKL 발현양상은 1주, 2주, 4주군 모두에서 실험군과 대조군에서 약한 발현양상을 보였으며, 실험군과 대조군 에서 발현양상의 차이는 보이지 않았다.(Table 4, Figs. 8.

A-F) Table 1. Mean bone-to-implant contact in experimental

and control group

Weeks after Experimental Control

P value

implantation (%) (%)

1 39.00±18.17 42.87±9.27 .572

2 43.74±6.83 32.27±6.00 .190

4 32.62±11.02 47.10±9.77 .168

Data is presented by mean±SD.

Fig. 3. Mean bone-to-implant contact (BIC) in experimental and control group.

BIC (%)

50

40

30

20

10

0

1 2 4 Time (week) Bone-to-implant contact

Experimental Control

Fig. 4. Mean bone area (BA) in experimental and control group.

BA (%)

40

30

20

10

0

1 2 4 Time (week)

Bone area

Experimental Control

Table 2. Mean bone area in experimental and control group

Weeks after Experimental Control

P value

implantation (%) (%)

1 37.28±3.68 31.90±2.84 .080

2 20.62±2.47 15.64±2.69 .139

4 11.37±4.54 17.69±8.77 .405

Data is presented by mean±SD.

Fig. 6. Microphotographs. (Masson's trichrome stain, ×100)

A. 1 week after implantation in experimental rat, B. 1 week after implantation in control rat, C. 2 weeks after implantation in experimental rat, D. 2 weeks after implantation in control rat, E. 4 weeks after implantation in experimental rat, F. 4 weeks after implantation in control rat.

Fig. 5. Microphotographs.(H-E stain, ×100)

A. 1 week after implantation in

experimental rat, B. 1 week

after implantation in control rat,

C. 2 weeks after implantation in

experimental rat, D. 2 weeks

after implantation in control rat,

E. 4 weeks after implantation in

experimental rat, F. 4 weeks

after implantation in control rat.

Fig. 7. Osteoprotegerin antibody reactions. (×100)

A. 1 week after implantation in experimental rat, B. 1 week after implantation in control rat, C. 2 weeks after implantation in experimental rat, D. 2 weeks after implantation in control rat, E. 4 weeks after implantation in experimental rat, F. 4 weeks after implantation in control rat.

Fig. 8. Receptor activator of nuclear factor kB ligand anti- body reactions.(×100)

A. 1 week after implantation in

experimental rat, B. 1 week

after implantation in control rat,

C. 2 weeks after implantation in

experimental rat, D. 2 weeks

after implantation in control rat,

E. 4 weeks after implantation in

experimental rat, F. 4 weeks

after implantation in control rat.

Ⅳ.

당뇨병에 대한 연구가 동물과 사람에서 많이 시행되어 왔으며, 당뇨병 연구를 위해 당뇨를 유도하는 여러 가지 방 법들이 소개되었는데, 그 중 하나가 streptozotocin을 이용 하여 당뇨를 유도하는 방법이다. Streptozotocin 대용량을 한번에 투입할 경우 직접적인 베타세포의 파괴에 의한 당 뇨병이 유발되며 소용량을 반복 투여할 경우에는 자가면 역기전을 통한 당뇨병이 유도된다

. 본 연구에서는 strepto- zotocin을 citric acid (0.1 mol/l, pH 4.5)에 용해시켜 60 mg/kg 을 복강 내에 투여하는 방법을 사용하였으며, 1주 뒤 미정 맥에서 혈액을 채취하여 검사한 결과에서 300 mg/dl 이상 의 혈당치가 측정된 쥐를 당뇨 백서로 인정하였다.

이러한 당뇨병 환자에 대한 임플란트 치료에 있어서는 골유착 및 골 재형성을 촉진하기 위한 방법들이 필요하며, 특히 당뇨에 의한 골모세포의 분화 억제를 개선하고 분화 를 촉진하여 골 형성을 향상시키는 방법들이 필요하다. 이 러한 골모세포의 분화를 촉진하기 위한 방법으로써 LIPUS 나 줄기세포 등이 이용될 수 있다.

LIPUS는 정형외과 영역에서 골절치료 후 골유합을 높이 는 방식으로 적용해 왔으며, 창상치유의 촉진과 골절의 치 유에 유효하다고 보고되었다

. 이러한 골 재형성을 유도 하는 초음파의 생물 물리학적 효과는 열적 효과와 비열적 효과로 구분될 수 있다. 열적 효과에 있어서 1,000-3,000

mW/cm

의 고강도 출력으로 초음파 적용 시 조직에 상당한

열이 발생할 수 있고, 에너지 흡수에 의한 열의 발생으로 조직과 세포의 변화를 자극할 수 있다

. 그러나 최근에 이 용되고 있는 LIPUS는 저출력 초음파로서 20-50 mW/cm

의 초음파 출력으로 사용되며 조직에서의 온도 변화가 1℃ 이 하인 것으로 보고되었다

.

한편 LIPUS의 비열적 효과에 있어 LIPUS의 적용 후 조직 과 세포들에서 관찰된 변화들이 음파의 흐름(acoustic streaming)과 공동화(cavitation) 같은 비열적 과정과 관계있 다는 보고가 있었다

. 안정적인 공동화와 음파의 흐름이 세포의 확산율과 막 투과성에 영향을 미치는데, 여러 연구 에서 LIPUS가 이러한 세포막 투과성에 직접적인 효과를 보이는 것으로 제안되었다

. 또한 세포막 투과성을 변화

시키는 LIPUS의 효과가 미세기계적인 혈압 상승을 가져오 고 이것이 골절 치유를 가속화시키는 것으로 보고되었다

. 여러 다른 가설로는 초음파 자극이 세포 수준에서 생화학 적 작용을 자극하는 기전과 관련되어 있고, 여러 연구에서 LIPUS가 기계적 자극을 만드는 미세운동을 유도하는 것을 제안하고 있다

. 그러나 이러한 LIPUS의 골 재형성 효과 에 대한 많은 임상적 및 실험실적 연구들에도 불구하고 복 합 골절치유 과정과 관계된 생물리학적 기전은 아직도 불 명확하다.

이러한 LIPUS의 주파수와 출력에 대한 연구에서 주파수 는 0.5-1.5 MHz, 초음파 출력은 30-200 mW/cm

인 경우에 있어 치유, 골 침착, 성장 등을 진전시키는 것으로 보고되

었다

. 주파수에 대한 다른 연구에서는 1.5 MHz와 3 MHz

를 비교하는 실험이 시행되었고, 1.5 MHz로 처치된 경우 더 많은 무기질 침착을 보였다고 보고하고 있다

. 또한 LIPUS의 초음파 출력은 골절치유와 실험실적 연구들에서 30 mW/cm

가 널리 이용되고 있다

. 본 연구에서는 주파 수 3 MHz와 초음파 출력 40 mW/cm

으로 설정하여 LIPUS 를 적용하였다.

또 다른 연구에서 LIPUS의 적용이 골모세포의 분화를 촉 진하는 것으로 나타났는데, LIPUS의 적용이 인간 골모세 포에 있어 VEGF-A mRNA와 단백질 수준 상승을 야기하였 다. 다른 연구에서도 LIPUS의 적용이 alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin, VEGF 발현 등에 의한 골모세포의 분화 를 자극하여 광화작용을 촉진하는 것으로 보고되었다

. 또한 LIPUS의 적용이 골모세포의 활동성을 증가시키는 것 으로 보고되고 있고

, 다른 연구에서도 LIPUS의 자극이 세 포의 증식이 아닌 골세포의 분화와 석회화된 골기질의 생 성을 자극하여 골 생성을 증가 시키는 것으로 보고하고 있 다

.

한편 임플란트 치료에 있어 중요한 부분인 골 재형성에 관련된 부분에서 줄기세포를 이용한 조직공학을 통해 골 재형성을 향상시키려는 연구들이 있었다

. 이 중에서 성 체줄기세포는 분화다양성이 배아줄기세포만큼 크지는 않 으나, 특정 배양조건을 조절함으로써 골모세포, 연골모세 포, 근육모세포, 신경세포 등으로 분화가 가능함이 밝혀졌

다

. 성체줄기세포 중에서 지방조직 유래 줄기세포는 채취

Table 4. RANKL expressions in experimental and control group Weeks after implantation Experimental Control

1 + +

2 + +

4 + +

(-: no immunoreactivity, +: weak but visible staining, ++: moderate staining, +++: strong staining intensity, RANKL: Receptor activator of nuclear factor kB ligand)

Table 3. OPG expressions in experimental and control group Weeks after implantation Experimental Control

1 +++ ++/+

2 +++ ++/+

4 + +

(-: no immunoreactivity, +: weak but visible staining, ++: moderate

staining, +++: strong staining intensity, OPG: Osteoprotegerin)

가 쉽고, 빠르게 성장하며, 공여부의 이환율이 낮고, 채취 에 있어 골수 유래 줄기세포와 비교하여 많은 수의 줄기세 포를 이용할 수 있어 널리 이용되고 있다

.

이러한 지방조직 유래 줄기세포는 골 조직공학의 파종 세포(seeding cell)로 널리 이용되고 있으며, 생체 외에서의 골형성 분화의 단계는 지방조직 유래 줄기세포가 골형성 능력을 가지기 위한 필수적인 단계로 인식되어 왔다

. 그러나 최근 연구에서는 지방조직 유래 줄기세포의 직접 적용에 있어 생체 외에서의 골형성 분화(osteogenic differ- entiation) 단계를 거치지 않은 줄기세포를 이용하려는 연구 들이 있었다

. 이러한 비 골형성 분화 줄기세포의 적용에 대한 이유로써 골형성 분화의 과정은 고비용과 생체 외에 서의 배양기간이 연장된다는 단점이 있다

. 또한 최근에 비 골형성 분화(non-osteogenic differentiation) 줄기세포가 새로운 골을 형성하여 임계 크기(critical size)의 골 결손부 가 치유된 연구들도 있었고

, 골형성 분화된 줄기세포와 의 비교 연구에서도 새로운 골형성에 유의한 차이가 없다 고 보고되었다

. 더불어 성체줄기세포가 골모세포로 분화 하는 데 있어 LIPUS의 적용이 골모세포로의 분화를 촉진 한다는 보고들도 있었다

. 이러한 연구를 바탕으로 본 연 구에서도 골형성 분화의 단계를 거치지 않은 비 골형성 분 화의 지방조직 유래 줄기세포를 사용하여 임플란트 식립 골구에 직접 주입하는 방법이 사용되었으며, 지방조직 유 래 줄기세포의 골모세포로의 분화를 촉진하기 위하여 LIPUS를 적용하였다.

한편 본 연구에서는 변화된 골의 대사를 증명하기 위한 방법으로 RANKL/OPG 발현을 분석하였다. RANKL/

RANK/OPG 체계는 1990년 중반에 발견된 이래로 골 흡수 의 조절을 통하여 골 개조 과정이 어떻게 조절되는 가에 대 한 이해를 넓혀 왔다

. RANKL은 317-amino acid polypep- tide이며, 세포막에 부착되는 고정형과 용해성 형태의 두 가지 생리적 활성형태가 존재한다. OPG는 TNF receptor의 상과(superfamily)에 속하는 분비성 당단백질이며, 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 억제하는 것으로 알려져 있다

. RANKL과 OPG는 골조직에서 골모세포에 의해 합성되며, RANKL과 OPG 발현의 균형에 의해 골의 생성과 흡수가

결정된다

. RANKL-to-OPG 비율에 의해 골 대사의 방향

이 결정되는데, 비율이 상승할 경우 심각한 골흡수가 야기 되며, 감소할 경우 즉 OPG의 발현이 증가할 경우 골생성이

일어난다

. 최근 인간 골모세포 유사 세포에 LIPUS를 적용

한 연구에서 LIPUS의 자극이 OPG의 발현을 증가시키는 것으로 보고되었다

.

본 연구의 결과에 있어 실험군과 대조군의 평균 BIC값은 2주군에서 43.74±6.83%와 32.27±6.00%로 나타났으며, 대조군에 비해 실험군에서 높은 값을 보였다. 평균 BA값 은 1주군에서 각각 37.28±3.68%와 31.90±2.84%, 2주군에 서 20.62±2.47%와 15.64±2.69% 등으로 나타났으며, 1주 와 2주군에서 대조군에 비해 실험군에서 높은 값을 보였

다. 또한 H-E 조직염색 결과에서도 1주와 2주군에서 임플 란트 주위로 대조군과 비교하여 실험군에서 약간 많은 골 기질이 형성된 것을 관찰할 수 있었고, Masson’ s trichrome 조직염색 결과에서도 임플란트 주위로 대조군과 비교하여 실험군에서 약간 많은 콜라겐과 비광화된 골기질의 형성 소견을 관찰할 수 있었다. 이는 임플란트 식립 후 1주간 적 용된 LIPUS의 숙주골(host bone)에 대한 골 재형성 효과에 의해 1주군에서 실험군의 골형성이 대조군에 비해 증가된 것으로 생각된다. 또한 2주군에서는 BIC와 BA 모두에서 대조군에 비해 실험군이 높은 값을 보였는데, 이는 LIPUS 의 숙주골에 대한 초기 골 재형성 효과와 함께 LIPUS의 적 용에 의해 주입된 지방조직 유래 줄기세포의 골형성 세포 로의 분화가 촉진되었으며, 이 분화된 세포에 의해 골형성 이 증가된 것으로 생각된다. 이는 조직에 대한 OPG와 RANKL의 발현 분석을 통해서도 해석이 가능한데, 초기 1 주군에서 실험군의 OPG가 강한 발현을 보인 것은 LIPUS 의 적용에 의해 숙주 골모세포의 분화가 촉진되어 골흡수 가 억제되고 골 재형성이 촉진된 것으로 생각된다. 2주군 에서 OPG의 발현이 지속적으로 강한 발현을 보인 것은 LIPUS에 의해 골 형성 세포로 분화가 촉진된 지방조직 유 래 줄기세포에 의한 효과로 생각된다.

4주군의 BIC 평균값은 32.62±11.02%와 47.10±9.77%로, BA 평균값은 11.37±4.54%와 17.69±8.77%로 나타났으며, 실험군에 비해 대조군이 다소 높은 값을 보였으나 통계적 으로 유의하지는 않았다. 조직학적 소견에서도 4주군에서 임플란트 주위로 실험군과 비교하여 대조군에서 다소 많 은 골조직이 생성된 것이 관찰되었다. 또한 골형성에 있어 서 시간이 지나감에 따라 BA 평균값의 전반적인 감소가 실험군과 대조군에서 나타났다. 이는 LIPUS의 효과에 의 해 초기 1주와 2주에서 대조군에 비해 실험군에서 골 재형 성이 증가되었으나, 시간이 경과됨에 따라 LIPUS의 효과 는 감소되고 조절되지 않은 당뇨의 영향이 증가되어 골밀 도의 감소가 나타난 것으로 생각된다. 이는 streptozotocin 으로 당뇨 유도된 백서에서 대퇴골과 하악골 모두에서 4주 경부터 유의성 있는 골밀도의 감소가 나타나기 시작하였 으며, 하악골에 비해 대퇴골의 경우가 더욱 뚜렷한 골밀도 의 감소를 나타낸 Jeong 등

의 연구 결과를 바탕으로 해석 이 가능한데, 본 연구에서의 4주군은 streptozotocin으로 당 뇨가 유도된 후 6주가 경과된 백서에 해당하므로, 조절되 지 않은 당뇨의 영향으로 BA의 감소가 나타난 것으로 생 각된다.

끝으로 본 연구의 결과들은 당뇨가 유도된 백서에 있어

LIPUS와 지방조직 유래 줄기세포의 복합 적용이 임플란트

주위의 초기 골 재형성에 다소 긍정적인 효과를 보였으나,

시간이 경과함에 따라 조절되지 않은 당뇨에 의한 골 감소

증을 극복하기는 어렵다는 것을 보여준다 하겠다. 본 연구

에서 대조군과 실험군간의 결과가 통계적으로 유의성이

없는 점은 정량적 분석을 위해 사용된 백서의 수가 적은 것

도 한 원인으로 생각된다. 또한 4주군에서 보여진 결과의 해석에 대해서는 향후 당뇨가 조절되는 백서에서 임플란 트 식립 시 LIPUS와 지방조직 유래 줄기세포를 복합 적용 하는 연구를 통해, 4주군에서의 전체적인 골밀도 감소가 조절되지 않은 당뇨의 영향인지에 대한 평가가 필요하다 할 것이다.

Ⅴ. 결 론

본 연구에서는 당뇨유도 백서 경골에 지방조직 유래 줄 기세포를 주입 후 임플란트를 식립하고, 저출력 초음파를 적용하여 채취된 조직의 조직형태계측학적 분석결과와 조 직학적 소견을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 골-임플란트 접촉률을 비교한 결과 2주군에서는 실험 군의 평균수치가 대조군에 비해 높았고, 4주군에서는 대조군의 평균수치가 높게 나타났으나 모두 통계적 유 의성은 없었다.

2. 골형성률을 비교한 결과 1, 2주군에서는 실험군의 평 균수치가 대조군에 비해 높았고, 4주군에서는 대조군 의 평균수치가 높게 나타났으나 모두 통계적 유의성은 없었다.

3. 조직학적 분석에서 1, 2주군에서는 대조군에 비해 실 험군에서 약간 많은 골기질이 형성된 것을 관찰할 수 있었으나, 4주군에서는 실험군에 비해 대조군에서 다 소 많은 골기질이 형성된 것이 관찰되었다.

4. 면역조직화학적 검사에서 OPG는 1, 2주군에서 대조군 에 비해 실험군에서 더 강한 발현을 보였으며, RANKL 은 1, 2주군에서 대조군과 실험군에서 비슷한 발현을 보였다.

이상의 결과를 통해 조절되지 않는 당뇨를 가진 백서에 서 티타늄 임플란트 식립 시 지방조직 유래 줄기세포 주입 과 저출력 초음파를 복합 적용한 술식이 임플란트 식립 초 기 1주와 2주의 임플란트 주위 골 재형성에 있어서는 다소 긍정적인 효과를 보였으나, 이러한 치료 방식이 조절되지 않는 당뇨를 가진 환자에 있어 임플란트의 골유착과 골 재 형성을 높이기에는 불충분하리라 생각된다.

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