Synthesis of Pyto-patch as Silver Nanoparticle Product and Antimicrobial Activity

은나노 제품인 Pyto-patch의 제조공정 및 Pyto-patch의 고추 탄저병 방제효과

곽영기¹*·김성일²·이종만³·김일섭¹

1강원대학교, ²강원도 농업기술원, ³ABC나노텍

Synthesis of Pyto-patch as Silver Nanoparticle Product and Antimicrobial Activity

Young-Ki Kwak¹*, Seong-Il Kim², Jong-Man Lee³, and Il-Seop Kim¹

1Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea

2Gangwon Provincial ARES, Chunchon 200-150, Korea

3ABC NANOTECH CO. LTD, Daejeon 305-500, Korea

Abstract. The commercial product “pyto-patch” prepared as nano sized silver particle less than 5 nm, has effective antifungal activity against Collectotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotio- rum in vitro. As a fungal growth inhibiton mechanism, it can reduce spore germination rate and mycelial growth. As s promising fungicide, Phyto-patch can control anthracnose effectively. The spore of C.

gloeosporioides dipped in 5 ppm phyto-patch dilute suppressed germination rate to 13.2%, and mycelial growth stopped for 15 days at 10 ppm. The spore postinoculated on 10 ppm phyto-path smeared PDA sur- face could not germinate for 3 days and prohibit pathogen infection effectively. In field test, the anthracnose development of 4 ppm phyto-patch treated plot was less than 7% after 21 days compaired to 40% of it in untreated plot. In heavy rainfall season, pepper anthracnose effectivly contrrolled by regular 10 ppm phyto- patch spraying every 7 days. The diseased pepper fruit decreased to 5.8% compaired to 94.6% in untreated plot. During drying period, the diseased pepper fruit havested in phyto-patch treated plot was 24.2%, but pepper fruit havested in untreated plot destroyed to 100% within 3 days. The nano silver particle coated on multching textile prevented late blight of pepper effectively and disease occurance delayed about month.

Key wards : anthracnose, field test, Mycelial growth inhibion, spore germination rate, silver nanoparticle

서 론

합성항생제에 대한 진균류의 저항성 출현으로 이를 극복할 수 있는 대체물질로 많은 연구자들이 은나노입 자의 항균작용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

주요 연구내용은 은과 은화합물이 세균, 곰팡이, 바이 러스등과 같은 미생물들에 대해 광범위하게 살균내지 생육억제능을 가지고 있으며, 이러한 은의 살균효과는 은입자의 나노화 입자를 작게 가공하였을 때 증가된다 고 하였다(Silver, 2003; Baker 등, 2005; Lee 등,

2008; Melaiye 등, 2005; Sondi 등, 2004; Lok 등, 2006; Franke 등, 2001). 생산된 은나노제품은 가전제 품, 의료산업, 섬유산업 등 다양하게 이용되고 있다.

은나노제품은 낮은 농도에서 항균력이 높고 수은, 동, 납, 크롬, 주석과 같은 광물보다 항균력이 높다 (Berger 등, 1976). 산화은은 산소가 있을때 은이온으 로 환원되어 살균력은 은의 활성표면에 의한 것이며, 저농도에서도 은나노입자는 세포를 통과하여 세포벽에 손상을 주고 DNA에 결합하여 복제를 저해한다(Dorau 등, 2004). Nasrollahi 등(2011)은 Candida albicans 와 Saccharomyces cerevisiae에 대한 은나노제품의 살 균력을 조사한 결과 AmphotericinB나 Fluconazole보다 MIC 농도가 낮아 항균력이 높다고 하였다. 잔디에 발

*Corresponding author: [email protected]

*Received February 22, 2012; Revised March 15, 2012;

*Accepted April 3, 2012

생하는 진균병(Bipolaris sorokiniana)에 대한 은나노제 품의 항균살균효과로 Jo 등(2009)은 125ppm에서 병원 균포자의 발아를 억제하고, 폿트시험에서는 8.8ppm에서 방제효과를 확인하였다. 이와 같은 은 이온(Ag+)의 항 균활성 메커니즘에 대해서는 아미노산의 일종인 시스테 인(cysteine)의 -SH기와 은 이온이 반응함으로써 S-Ag 가 형성되어 미생물을 불활성화 시킨다는 설명 외에 활 성산소의 생성 유도, 세포질 막의 K⁺이온 방출에 의한 미생물을 불활성화, 과산화수소나 구리이온과 같은 다른 항균 물질과의 시너지 효과 등으로 설명되고 있다.

본 연구는 은나노 제조공정과 은나노 제품(상품명

‘pyto-patch’)의 식물 진균에 대한 항균력을 확인하기 위해 탄저병원균(Collectotrichum gloeosporioides), 잿 빛곰팡이균(Botrytis cinerea), 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum)에 대한 포자발아 억제능, 균사 억제능을 기내에서 확인하고, 포장 실증실험을 통해 고추 탄저병 의 방제 효과를 구명하고자 실시하였다.

재료 및 방법

1. 은나노 제조 공정

은 입자를 합성하기 위한 전구체로 질산은(AgNO3) 을, 환원제는 sodium ferro sulfate을, 단분산을 위한 분산제로는 Citric acid를 사용하였다. 질소 burbling을

통하여 용존산소를 제거한 증류수에 적정량의 AgNO3

를 magnetic stirrer 로 충분히 교반하여 A용액을 만 들고, 분산제와 환원제를 충분히 용해시킨 B용액의 pH를 실험조건에 맞춰 조절한 다음 반응기내 잔류 기 체에 의한 추가 반응을 막기 위해질소가스로 충분히 purge시킨 후, A용액을 micro tube pump(EYELA MP-3, Japan)를 이용하여 B용액에 천천히 적하 하면서 은 콜로이드 입자를 제조하였다(Fig. 1). 생성된 은나노 콜로이드는 TEM(JEM-2010, JEOL, Japan)에 의한 입 자의 형상을 관찰하고 UV-visible spectrophotometer (Agilent 8453)에 의한 입도분포를 측정하였다.

2. 진균병 균사생장억제효과

PDA사면배지에 보존중인 고추 탄저병원균 (Collectotricum gloeosporioides), 인삼 균핵병원균 (Sclerotinia sclerotiorum), 토마토 잿빛곰팡이병 (Botrytis cinerea)을 PDA평판배지에 접종하여 배양하 였다. 배지에서 자라고 있는 각 병원균의 집락가장자리 에서 균체를 떼어내어 은나노제품(파이투패치)을 100,

250, 500로 희석한 배지 중앙에 접종하고 배양하면서

균사생장거리를 측정하여 생육억제효과를 확인하였다.

3. 고추탄저병원균 포자발아억제

보관중인 균주는 탄저병원균 포자형성배지(Glucose

Fig. 1. Schematic diagram of the nano sized silver particle.

2.8g, Neopeptone 2g, MgSO4· 7H2O 1.23g, KH2PO4

2.72g, Agar 20g, D.W. 1l)에 접종하여 28^oC 광조건 하에서 20일 배양하여 포자형성을 확인한 후 멸균수로 포자를 수확하고, 4겹의 gauze에 통과시켜 균사를 제 거하였다. 준비된 포자는 은나노 시료를 희석한 용액에 2시간 침지처리한 후 포자현탁액을 0.2ml씩 PDA평판 배지에 도말한 후 배양일 수 별로 200배 광학현미경 으로 관찰하면서 발아율을 조사하였다.

4. 균사침지처리 실험

PDA 평판배지에 탄저병원균을 3일간 배양하여 형성 된 집락에 희석한 은나노 시료를 부어 2시간 침지한 후 시료를 제거하고 5mm(i.d)cork borer로 균사를 채 취하여 PDA 평판배지에 접종하여 배양일수 별로 생 장거리를 측정하였다.

5. 은나노 배지첨가실험

살균제 농약효과조사를 위해 사용하는 배지내 약효 성분첨과효과 조사방법에 따라 PDA를 멸균한 후 50^oC에서 은나노를 첨가한 후 분주하고, 평판배지 중 앙에 탄저병원균 균사를 접종하여 균사생자억제효과를 조사하고, 포자는 멸균수로 처리한 시료를 은나노가 첨 가된 배지위에 도말한 후 발아율을 조사하였다.

6. 고추재배지 탄저병방제시험

파이투패치의 농가포장시험 추진을 위해 250, 500배 액을 기준으로 살포하여 7일 간격으로 수확하면서 이 병과율을 조사하여 살포농도를 혹인하고, 다음해 2011

년에는 250배액을 발병초기부터 7일, 10일, 15일 간격 으로 고압분무기를 사용하여 흠뻑 적시게 살포하였다.

시험구는 구당 20주씩 5반복으로 하였으며, 발병율을 조사하기 위해 약제살포 후 15일부터 7일 간격으로 3 회 홍고추를 수확하고 수확한 고추는 3일간 음건한 후 병반형성유무로 판정하였다.

7. 은나노처리 피복제 병발생억제효과

은나노를 처리한 멀칭피복재인 ‘weed stop’을 고추 재배포장에 피복하여 고추 탄저병 방제효과를 조사하 였다.

결과 및 고찰

은 이온의 경우 은 이온이 함유된 용액 상태에서 사용해야 하거나 보다 물에 잘 용해될 수 있도록 하 는 특정 물질에 이온 결합을 시켜야 응용이 가능하다 는 제한이 있다. 반면 은나노 입자는 나노(1~100nm) 크기로써 고체 상태로도 제조가 가능하고 지속성이 뛰 어나서 생활 용품 및 의료용품으로 연구 및 개발이 활발히 이루어지고 있다.

은나노 입자의 합성 방법에는 여러 방법들이 있다.

AgNO3(silver nitrate)을 이용한 방법, UV light을 이 용한 광 환원법과 다양한 종의 박테리아나 곰팡이들을 이용한생체합성 등의 다양한 방법이 있다. 이러한 다양 한 방법들은 각각의 특별한 장단점이 존재하는데 생성 되는 크기나 모양, 안정성 또는 순도 등에서 차이점을 보인다. 이들 중 가장 일반적인 방법은 AgNO3을 이

Fig. 2. TEM phtograph and distribution of silver nano particles.

용한 방법이다. 본 시험에 사용된 은나노 제품의 TEM사진과 입도분포를 Fig. 2에 나타냈다.

1. 은나노제품의 균사생장 억제능

고추 탄저병원균(Collectotricum gloeosporioides), 인삼 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum), 토마토 잿 빛곰팡이병(Botrytis cinerea)을 PDA평판배지에 접종하 여 배양한 뒤, 각 병원균의 균체를 떼어내어 은나노제 품(파이투패치)을 100, 250, 500로 희석한 배지 중앙 에 접종하고 배양하면서 균사생장거리를 측정하여 생 육억제효과를 확인한 결과 대조구에 비해 모든 처리구 에서 균사 생장 억제효과가 인정되었다. 전반적으로 처 리농도가 높을수록(희석배수가 낮을수록) 생장억제 효 과가 크게 나타났으며, 같은 농도에서는 탄저병원균 >

잿빛곰팡이균 > 균핵병원균 순으로 파이투패치에 의한 균사 생장저해 효과가 크게 나타났다(Fig. 3). 특히 균 핵병원균은 100배를 제외한 250배와 500배로 희석한 처리구에서는 대조구에 비해 5% 정도의 미미한 억제 효과를 보였다. 배지표면에 접촉한 균사는 길이생장이 억제되고 균사 끝 부분이 비정상적으로 비대되어 생장

Fig. 3. Mycelial growth inhibion by Phyto-patch on different concentration (A: control, B: 100×, C: 250×, D: 500×).

Fig. 4. Abnormal mycelial tip area growth of phytopathogen on phyto-patch added PDA plate.

Table 1. Spore germination rate of C. gloeosporioide after phyto-patch absorbtion.

Incubation terms

cfu/plate Dilution rate of phyto-patch

×100 ×200 ×500 ×1,000 Control

2 days 0. 0. 13.2 12.4 12.5

3 days 0. 03.7 28.7 22.6 26.2

5 days 12.6 26.5 36.4 28.7 48.7

7 days 13.2 27.3 48.7 36.4 52.3

이 멈추었다(Fig. 4).

2. 탄저병원균 포자 발아억제효과

탄저병원균 포자에 흡수된 파이투패치의 발아억제효 과를 조사하기 위해 수확한 포자를 공시한 희석액에 1 시간 침지처리하고 원심분리하여 포자를 수확한 후 멸 균수에 희석한 후 PDA 평판배지에 도암접종한 후 발 아율을 형성된 집락수로 확인하였다. 접종 7일후 무처 리구의 집락수는 52.3개에 비해, 100배 희석액에서는 13.2개, 200배 희석액에서는 27.3개로 대조구에 비해 각각 74%와 47%의 높은 발아억제효과를 보였으며,

500배와 1,000배로 희석한 처리구에서도 7~30% 정도 의 발아억제효과가 확인되었다(Table 1).

3. 파이투패치 탄저병원균 균사생장억제효과 고추 표면에 감염된 포자가 발아하여 균사생장 단계 에서 파이투패치 살포에 의한 균사생장억제 효과를 조 사하기 위해 배양 중인 균사를 5nm cork borer로 배지 와 함께 채취한 후 각각의 희석액에 30분간 침지하고, PDA평판배지에 배양한 결과 100배 희석액은 15일, 200배 희석액은 7일, 500배 희석액에서는 5일 후까지 생육억제효과를 보였으나, 1,000배 희석액에서는 무처리 구에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Table 2).

4. 포자발아억제 농도

배지에 은나노를 100~5ppm 농도로 처리하면 초기

Table 2. Mycelial growth inhibition after dipping at each phyto-patch dilute.

Incubation terms

Diameter of colony (cm) Dilution rate of phyto-patch

×100 ×200 ×500 ×1,000 Control

03 days 0.2 0.3 0.4 0.2 0.4

05 days 0.3 0.6 1.8 2.3 2.7

07 days 1.2 1.9 3.8 2.9 3.2

15days 1.4 3.7 4.0 3.9 4.1

Table 3. Spore germination inhibition on phyto-patch added PDA.

Incubation terms

% of spore germination Dilution rate of phyto-patch

×10 ×50 ×100 ×200 Control

24 hr 0 0. 0. 0. 46.3

48 hr 0 0. 13.5 29.4 96.7

72 hr 0 12.4 26.7 29.3 98.2

Table 4. Spore germination of C. gloeosporioides on PDA surface smeared with each phyto-patch dilute.

Incubation terms

% of spore germination Dilution rate of phyto-patch

×200 ×500 ×1000 ×1,500 ×2,000

24 hr 0 0. 15.7 24.6 23.7

48 hr 0 26.2 35.7 42.3 56.4

72 hr 0 63.2 73.6 72.5 86.7

Table 5. Pepper fruit anthracnose control effect of phyto- patch tretment after 7 days.

Replicate % of diseased pepper fruit

×250 ×500 Control

1 56.0b 49.6b 59.9a

2 30.2b 32.3b 69.0a

3 43.1b 36.5b 67.7a

Mean 43.1b 39.5b 65.5a

DMRT, P > 0.05 c.v = 18.97.

Table 6. Pepper fruit anthracnose control effect of phyto- patch tretment after 21 days.

Replicate % of diseased pepper fruit

×250 ×500 Control

1 11.6c 19.5c 29.2c

2 03.2c 11.7c 19.1c

3 06.0c 10.4c 21.7c

Mean 06.9c 13.8b 23.3a

DMRT, P < 0.01 c.v = 8.70.

에는 모든 처리구에서 발아율이 억제되고 3일 후에도 발아가 억제되나 20ppm 이상에서는 포자발아 및 포자 발아관 생육이 억제되었다(Table 3, Fig. 2). 배지에 의한 은나노입자 기능저해를 없애기 위해 배지표면에 은나노를 처리한 후 포자를 접종하면 5ppm 처리구에 서 3일 후에도 포자가 발아하지 못했다(Table 4).

5. 포장 실증 시험

탄저병이 발생한 고추밭에 포장에 파이투패치 250배 액과 500배액을 살포하고 7일 및 21일 후 발병과를 조사한 결과 처리농도에 관계없이 탄저병 억제효과가 확인되었다(Table 5). 처리 7일 후에는 250배액에서는

34%, 500배액에서는 40% 정도의 방제효과가 인정되

었으며, 처리 21일 후에 발병율을 조사한 결과 250배 액처리구에서 6.9%로 무처리 대비 70%이상 방제효과 가 확인되었다(Table 6).

6. 파이투패치를 이용한 고추탄저병방제

2011년 고추착과 및 수확기간 중 잦은 비로 무처리 고추재배 시험구는 94.6%의 높은 발병율로 수확을 할 수 없었으나 파이투패치처리구는 방제효과가 있었으며 발병초기부터 7일 간격으로 살포한 처리구에서는 발병 과율이 5.8%로 낮았다(Table 7, Fig. 5). 육안으로 건

전한 홍고추를 햇볕에 건조하면 무처리구에서 수확한 고추는 3일이내에 100% 병반이 확대되어 건고추 생 산이 불가능하였으며 10일 및 15일 처리구에서도 70% 이상 병반이 확대되어 폐기하였다. 7일간격 처리 구는 75% 이상 깨끗한 건고추를 수확 할 수 있었다 (Table 8).

7. 은나노처리 피복제 병발생억제효과

은나노를 코팅처리한 피복재료를 고추밭 두둑을 피 Table 7. pepper fruit anthracnose development after phyto-

patch treatment at each interval.

Replicate % of diseased pepper fruit 7 days 10 days 15 days Control

1 05.6 21.5 31.7 100

2 03.2 17.6 41.3 93.2

3 07.1 14.3 32.0 87.6

4 0. 26.7 25.3 100

5 13.2 13.7 31.5 92.3

Mean 05.8 18.7 32.3 94.6

Fig. 5. Pepper fruit anthracnose control efficacy of phyto-patch (left-untreated, right-treated every 7 days with 1/250 phyto- patch dilute in disease occurring season).

Table 8. Anthracnose developmet of harvested pepper fruit during drying period.

Phyto-patch treating interval

% of diseased pepper fruit at each drying terms 3 days 6 days 9 days 15 days

Xontrol 100 - - -

15 day 72.3 86.7 92.3 92.3

10 day 51.7 63.1 69.3 72.1

07 day 10.4 19.7 21.3 24.2

Table 9. Phytophthora blight occurrence reducing efficacy of mulching in pepper growing field.

Treament Counting date

% of late blight occurred plant Mulching plot Naked plot

June 23th Plantig Planting

August 11th 15 0.0

August 26th 24 0.0

September 7th 74 2.3

Fig. 6. Labor saving efficacy in pepper growing field by mulching (left-mulching, right-naked).

복하면 제초작업에 의한 노동력이 10a당 51시간 절약 되어 255,000원의 생산비절감효과가 있었으며, 장마철

고추역병 발생율도 효과적으로 예방되어 고추수확 후 기인 9월 26일 무처리구와 피복처리구의 발병율은 각 각 74%, 2.3%로 확인되었다(Table 9, Fig. 6).

적 요

나노 크기인 5nm 이하로 제조한 은나노제품(파이투 패치)은 주요 식물병원균인 탄저병원균(Collectotrichum gloeosporioides), 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum)에 대해 포자발아 및 균사생장을 억제하는 항균력이 있었다.

파이투패치 살포에 의한 고추탄저병 방제효과를 실 험하기 위해 파이투패치 희석액에 포자를 침지하여 포 습시킨 후 발아율을 조사한 결과 5ppm까지 희석한 처리구에서 병원균의 포자발아억제효과를 보였으며, 균 사는 10ppm에서 생장억제효과가 15일간 지속되었다.

특히 파이투패치를 10ppm으로 희석하여 배지표면에 도말한 후 탄저병원균 포자를 접종하면 3일간 발아가 억제되어 식물체 감염을 효과적으로 예방하였으며, 40% 이상 발병한 시험구에 4ppm 파이투패치를 살포 한 결과 21일 후 7% 이하의 발병과율로 무처리 대비 70% 방제효과가 있었다. 장마철 탄저병 발생율이

94.6%인 시험포장에서 10ppm 농도로 파이투패치를 7

일간격으로 엽면살포한 결과 발병과 발생율이 5.8%로 방제효과를 확인하였으며, 수확한 홍고추를 자연건조한 후에도 발병과율이 24.2%로 건고추 수확량도 증가하 였다.

장마철 고추역병(Phytophthora capsici)은 장마가 끝 난 무피복시험구에서 8월 11일 15%이었으며 고온기를 지난 9월 7일에는 발병율이 74%로 수확을 포기하였 으나, 파이투패치를 코팅처리한 피복재를 씌운 시험구 에서는 발병주가 2.3%로 장마철 역병발생이 효과적으 로 방제되었다.

주제어 : 균사생장억제, 은나노 입자, 탄저병, 포자 발아

율, 포장실험

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