Inhibitory Effects of Scoparone on Thrombus Formation via Regulation of Cyclic Nucleotides in Collagen-Induced Platelets

(1)

콜라겐 유도의 혈소판에서 사이클릭 뉴클레오티드의 조절을 통한 Scoparone의 혈전 형성 억제 효과

이 동 하

남서울대학교 임상병리학과․분자진단연구소

Inhibitory Effects of Scoparone on Thrombus Formation via Regulation of Cyclic Nucleotides in Collagen-Induced Platelets

Dong-Ha Lee

Department of Biomedical Laboratory Science, Molecular Diagnostics Research Institute, Namseoul University

ABSTRACT Platelet activation is essential for the hemostatic process for vascular damage. Excessive platelet activa- tion, however, can lead to several cardiovascular diseases, including atherosclerosis, thrombosis, and myocardial infarction. Scoparone is found in the roots of the genus Artemisia or Scopolia. The pharmacological properties of this compound, including immunosuppression and vascular relaxation, have been studied, but no antiplatelet effects have been reported. This study examined the activities of scoparone on collagen-induced human platelet activation.

Scoparone increased the levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in a concentration-dependent manner. In addition, scoparone phosphorylated the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) and vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) that act as substrates for cAMP-dependent kinase (PKA) and cGMP-dependent kinase (PKG). The phosphorylation of IP3R by scoparone-inhibited the Ca²⁺ mobilized from the Ca²⁺ channel of the dense tubular system. Moreover, the phosphorylation of VASP was involved in the inhibition of fibrinogen binding by inactivating αIIb/β3 in the platelet membrane. Scoparone finally reduced the level of thrombin-induced fibrin clot production and reduced thrombus formation. Therefore, scoparone has strong antiplatelet activity and is a potential prophylactic and therapeutic agent for thrombotic diseases from which platelets are derived.

Key words: scoparone, cyclic nucleotide, inositol 1,4,5-triphosphate receptor, intracellular Ca²⁺, vasodilator-stimulated phosphoprotein

Received 28 October 2019; Accepted 7 December 2019 Correspondence author: Dong-Ha Lee, Department of Biomedical Laboratory Science, Namseoul University, Cheonan, Chungnam 31020, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-41-580-2148 Author information: Dong-Ha Lee (Professor)

서 론

혈소판 응집은 혈관이 손상되었을 때 지혈 plug의 형성에 있어서 필수적인 반응이다. 그러나 혈소판과 collagen 사이 의 과도한 상호작용과 혈소판 응집은 혈전증, 죽상동맥경화 증 및 심근경색과 같은 순환장애를 유발할 수 있다(Sch- wartz 등, 1990). Collagen은 내피세포에 대한 혈소판 부착 을 지지하고, 이어서 응집, 분비 및 응고의 활성화를 유도한 다. Collagen이 유도하는 혈소판 활성화가 일어날 때 혈소 판의 세포질 내 Ca²⁺([Ca²⁺]i)의 농도는 혈소판 응집을 일으 키는 데 핵심적인 역할을 하는데, [Ca²⁺]i는 inositol 1,4,5- triphosphate(IP₃)에 의해 dense tubular system이라고 하

는 세포의 내부 저장소에 있는 수용체를 통해 세포질 내로 동원되는 것으로 알려져 있다(Furuichi와 Mikoshiba, 1995).

증가한 [Ca²⁺]_i는 Ca²⁺/calmodulin 복합체에 의존하는 myosin light chain(20 kDa)을 인산화하고, diacylglycerol (DG)과 협력하여 단백질 kinase C(PKC)를 활성화함으로써 plecktrin을 인산화시킨다. 이것은 세포골격 단백질의 재배 열로 이어지고 최종적으로 혈소판 응집을 일으킨다(Furui- chi와 Mikoshiba, 1995).

또한 혈소판 막에 위치한 phosphatidylinositol 4,5-bi- sphosphate(PIP2)의 분해에 의해 생성된 DG는 DG lipase 및 monoacyglycerol(MG) lipase에 의해 순차적으로 가수 분해되어 arachidonic acid를 생성시키고 이는 thromboxane A₂(TXA₂)로 전환된다(Ohkubo 등, 1996). TXA₂는 혈 소판을 활성화하여 세포 내 과립의 분비 및 형태학적 변화를 유도하는 것으로 알려져 있다(Saitoh 등, 1986). 실제로 TXA2의 안정적인 유사체인 U46619(9,11-dideoxy-9a.la- methanoepoxyprostaglandin F2a)는 [Ca²⁺]_i를 증가시킴 으로써 myosin light chain과 plecktrin의 인산화를 일으키

(2)

Fig. 1. The structure of scoparone. PIN: 6,7-dimethoxy-2H- chromen-2-one, chemical formula: C11H10O4, molar mass: 206.19 g/moL.

는 효과적인 혈소판 응집유도제로 이용되고 있다(Cattanco 등, 1991; Su 등, 1999). 이것은 혈액에서 정상적인 지혈반 응 과정이지만 과도한 혈소판 응집이 발생하게 될 경우 죽상 동맥경화증과 같은 다양한 혈관 질환을 유발할 수 있다. 그 러므로 혈소판의 활성화를 적절히 억제하는 것은 심혈관 질 환을 예방하는 데 유용한 접근법이 될 수 있다(Cattanco 등, 1991; Su 등, 1999).

Verapamil 및 theophylline은 혈소판 응집의 필수 성분 인 [Ca²⁺]i를 감소시키는 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)의 수준을 증가시킴으로써 항혈소판제로서 기능한다고 알려져 있다(Quinton와 Dean, 1992). 또한 혈 소판의 cyclic guanosine monophosphate(cGMP) 수준은 erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine 및 zaprinast 와 같은 cGMP phosphodiesterase(PDE) 억제제를 사용하 거나 molsidomine 및 nitroprusside와 같은 혈관 확장제를 사용함으로써 증가한다(Menshikov 등, 1993). 정상적인 혈 액순환 과정에서 혈관 내피세포는 nitric oxide(NO) 및 prostaglandin I₂를 방출하여 혈소판이 cAMP 및 cGMP를 생성하게 한다. 증가한 cAMP 수준은 단백질 kinase A(PKA) 의 활성화를 유도하는 반면, cGMP 수준의 증가는 단백질 kinase G(PKG)의 활성화를 유도한다. PKA와 PKG는 기질 단백질인 inositol 1,4,5-triphosphate receptor(IP3R)와 vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)을 인산 화한다고 알려져 있다(Schwarz 등, 2001). IP₃R의 인산화 는 IP₃R을 비활성화시킴으로써 dense tubular system으로 부터의 세포질 내로의 Ca²⁺동원을 억제시킨다(Cavallini 등, 1996; Quinton와 Dean, 1992). 혈소판에서 VASP는 PKA 및 PKG의 주요 기질이며, αIIb/β₃의 활성화 및 actin filament 활성을 조절하는 데 기여한다. cAMP-의존성 VASP Ser¹⁵⁷의 인산화 또는 cGMP-의존성 VASP Ser²³⁹의 인산 화가 αIIb/β3 활성화의 억제 및 actin filament 신장의 억제 를 야기한다고 알려져 있다(Laurent 등, 1999; Sudo 등, 2003). 결과적으로 IP3R의 인산화는 Ca²⁺동원의 억제를 통해, VASP의 인산화는 αIIb/β₃억제를 통해 혈소판의 활성 을 저해하므로 항혈소판 효과를 확인하는 데 필수적이다.

Scopolia 또는 Artemisia 속 식물의 뿌리에서 흔히 발견 되는 scoparone은 면역억제 및 혈관이완 등의 잠재적인 약 리학적 특성들에 대하여 연구된 바 있으며, PI3K/Akt/NF-κ B pathway 조절을 통해 IL-1β가 매개하는 염증반응을 억 제하여 관절 치료의 소재로 가능성이 있음이 알려져 있다 (Huang 등, 1991; Huang 등, 1992; Lu 등, 2018). 그러나 혈소판 활성화에 있어서 scoparone의 역할과 collagen으 로 유도한 사람 혈소판 응집에 대한 scoparone의 기전은 현재까지 알려진 바가 없다. 본 연구는 scoparone의 항혈소 판 효과를 명확하게 하기 위해서 collagen 유도의 혈소판 활성화와 그와 관련된 다양한 요인들에 미치는 scoparone 의 효과를 확인하였다.

항혈소판 효과를 가지는 성분으로써 scoparone의 유효

성이 입증된다면 scoparone을 함유하는 식물체로 알려진 쑥이나 가지 등을 식품으로 섭취함으로써 혈전 형성으로 인 한 심혈관계 질환을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

재료 및 방법

시료

Scoparone(6,7-dimethoxy-2H-chromen-2-one)은 Avention Corporation(Seoul, Korea)에서 구입하였다 (Fig. 1). Collagen은 Chrono-Log Corporation(Haver- town, PA, USA)에서 제공받았다. cAMP 및 cGMP Enzyme Immunoassay(EIA) kit은 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)로부터 제공받았다. Fura 2-AM는 Invitrogen (Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. Anti-VASP, Anti- phosho-VASP Ser²³⁹, Anti-phosho-VASP Ser¹⁵⁷, anti- phospho-inositol-3-phosphate receptor type Ⅰ, lysis buffer, anti-rabbit IgG-HRP-conjugate 및 anti-β-actin 은 Cell Signaling(Beverly, MA, USA)로부터 입수하였다.

Enhanced chemiluminescence solution(ECL)과 poly- vinylidene difluoride(PVDF) membrane은 General Elec- tric Healthcare(Buckinghamshire, UK)로부터 구입하였다.

Fibrinogen Alexa Fluor 488 접합체는 Invitrogen Molecu- lar Probes(Eugene, OR, USA)를 통해 얻었다.

사람 세척혈소판의 제조

대한 적십자사 혈액원(Suwon, Korea)에서 사람 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 제공받았다. 세척 혈소판은 이전에 수행 된 방법(Shin 등, 2019)에 따라 제조하였다. PRP를 1,300×

g에서 10분 동안 원심분리 하여 혈소판을 획득하고, 이를 세척완충액(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose 및 1 mM Na₂EDTA, pH 6.9)으로 2회 세척하였다. 현탁완충액(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 0.49 mM MgCl2, 5.5 mM glucose, 0.25% gelatin, pH 7.4)을 사용하여 세척된 혈소판을 10⁸cells/mL의 최종 농도로 현 탁시켰다. 저온에서의 혈소판 응집을 피하기 위해 모든 절차 를 25°C에서 수행하였고, 이 실험은 남서울대학교 Institu- tional Review Board(IRB)의 승인을 받아 수행하였다(104 1479-HR-201803-003).

(3)

A

B

Fig. 2. Effects of scoparone on cyclic nucleotides production.

(A) Effects of scoparone on cAMP production stimulated by collagen. (B) Effects of scoparone on cGMP production stimulated by collagen. Data are expressed as mean±SD (n=4). ^*P<

0.05, ^**P<0.01 compared with the collagen-stimulated platelets.

Cyclic nulceotides(cAMP 및 cGMP) 생성량 측정 세척혈소판(10⁸cells/mL)을 37°C에서 3분간 배양하고 2 mM의 CaCl₂를 첨가한 후, collagen(2.5 μg/mL)으로 자 극하여 5분 동안 응집을 유도하였다. 1 M HCl를 첨가하여 반응을 종결하였고, cAMP 및 cGMP를 EIA kit을 사용하여 Synergy HT Multi-Model Microplate Reader(BioTek Instruments, Winooski, Vermont, USA)를 통해 측정하였다.

세포 내 Ca²⁺ 동원량 측정

PRP를 5 μM의 Fura 2-AM과 함께 37^oC에서 60분 동안 배양하고 상기 명시된 절차에 따라 세척혈소판(10⁸cells/

mL)으로 제조한 후, 2 mM CaCl₂를 첨가하여 37^oC에서 3분 동안 배양한 다음 collagen(2.5 μg/mL)으로 자극하여 5분 동안 측정하였다. Fura 2의 형광은 BioTeck Instrument사 (Winooski, Vermont, USA)의 분광 형광광도계(SFM 25) 를 사용하여 측정하였다. 여기 파장은 초기에 340 nm로 설 정하였고 궁극적으로 380 nm에 도달하여 0.5초씩 증가하 였다. 방출 파장에 대해 510 nm의 파장 설정을 사용하였다.

동원되는 Ca²⁺양의 계산은 Grynkiewicz의 방법(Grynkie- wicz 등, 1985)을 사용하여 수행하였다.

Immunoblotting

1× lysis buffer를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 혈소판 용해물의 단백질 농도는 BCA 단백질 kit(Pierce Biotech- nology, Rockford, IL, USA)을 사용하여 측정하였다. 단백 질(20 μg)을 4~20% SDS-PAGE를 통해 분리하고 PVDF membrane으로 옮겼다. 1차 항체는 1:1,000의 희석배수로 처리하였고, 2차 항체는 1:2,000의 희석배수로 처리하였다.

ECL 시약(General Electric Healthcare)을 사용하여 시각 화하였다.

Fibrinogen binding 측정

세척혈소판(10⁸cells/mL)에 2 mM CaCl₂를 첨가하여 Alexa Flour 488-human fibrinogen(30 μg/mL)을 처리한 후, collagen(2.5 μg/mL)으로 자극하여 5분 동안 측정하였 다. 반응을 종결시키기 위해 0.5% paraformaldehyde를 함 유하는 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)을 첨가 하였다. 이 과정은 빛을 차단하면서 수행하였으며, BD Bio- sciences(San Jose, CA, USA)의 유세포 분석기(FACS)를 사용하여 fibrinogen binding을 측정하고 Cell-Quest software(BD Biosciences)로 분석했다.

혈소판 매개 fibrin clot 형성 측정

PRP(500 μL)는 점착을 피하기 위해 polyethylene tube 로 옮겼고 2 mM CaCl2를 첨가 후 thrombin(0.05 U/mL)을 사용하여 37^oC에서 15분 동안 자극하였다. Fibrin clot의 사진은 디지털카메라를 사용하여 촬영하였다. 응고 면적은 Image J Software(v1.46, National Institutes of Health,

Bethesda, MD, USA)를 사용하여 계산하였다.

통계 분석

실험 결과를 나타내기 위해 평균±표준편차를 사용하였 고, Student’s t-test 또는 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 적절하게 수행하였으며, P<0.05는 통계적으로 유의한 것으 로 간주하였다. 분산 분석에 따라 그룹 평균 간에 유의한 차이가 있는 경우 그룹을 Scheffe의 방법으로 비교하였다.

결 과

Scoparone이 cyclic nucleotides 생성에 미치는 효과 Scoparone이 cAMP 또는 cGMP 생성에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과 Fig. 2A에 나타낸 바와 같이 scopar- one은 3.92±0.41 pmoL/10⁸ cells에서 9.99±0.35 pmoL/

10⁸cells로 cAMP 생성을 유의하게(P<0.05) 증가시켰다.

또한 cGMP 생성도 scoparone에 의해 6.53±0.46 pmoL/

10⁸ cells에서 9.53±0.31 pmoL/10⁸ cells로 유의하게 증가 하였다(Fig. 2B). 특히 scoparone 100 μM 이상의 농도에서 유의성이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다(P<0.01). 이 러한 결과는 collagen 유도의 혈소판에서 scoparone이

(4)

A

B

#

Fig. 3. Effects of scoparone on [Ca²⁺]i mobilization and IP3R phosphorylation. (A) Inhibitory effects of scoparone on collagen-induced [Ca²⁺]i mobilization. (B) Effects of scoparone on collagen-induced IP3R phosphorylation. Measurement of [Ca²⁺]i

mobilization and western blotting was described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±SD (n=4). ^#P<0.05 compared with no-stimulated platelets. ^*P<0.05,

**P<0.01 compared with the collagen-stimulated platelets.

Fig. 4. Effects of scoparone on VASP phosphorylation. Western blotting was determined as described in “Materials and Meth- ods” section. The data are expressed as the mean±SD (n=4).

#P<0.05 compared with no-stimulated platelets. ^*P<0.05, ^**P<

0.01 compared with the collagen-stimulated platelets.

cAMP 및 cGMP의 생성을 유의하게 증가시켜 혈소판의 활 성화를 억제한다는 것을 보여준다.

Scoparone이 세포 내 Ca²⁺ 동원 및 IP3R 인산화에 미치 는 효과

세포 내 Ca²⁺ 동원([Ca²⁺]_i)이 혈소판 활성화에 중요하다 고 알려져 있으므로, 본 연구에서는 [Ca²⁺]_i에 대한 sco- parone의 효과를 확인하였다. Fig. 3A에 보여준 바와 같이 collagen에 의해 [Ca²⁺]i 수준이 100.5±0.3 nM에서 571.1

±11.4 nM로 상승하였다. 그러나 scoparone(50~200 μM) 은 collagen에 의해 증가한 [Ca²⁺]_i 수준을 농도 의존적으로 유의하게 감소시켰다(Fig. 3A). Scoparone(200 μM)의 [Ca²⁺]_i 억제율은 최대 79.5%였다. 또한 본 연구에서는 scoparone이 [Ca²⁺]i을 조절하는 단백질인 IP3R의 인산화 에 미치는 효과를 확인하였다. Fig. 3B에 나타낸 바와 같이

scoparone(50~200 μM)은 collagen으로 유도한 혈소판에 서 IP₃R 인산화를 농도 의존적으로 증가시켰고, 50 μM 이상 의 농도에서 유의성이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다 (P<0.01). 이는 scoparone에 의한 세포 내 Ca²⁺동원의 감 소가 IP3R 인산화로 인한 것임을 보여준다.

Scoparone이 VASP 인산화에 미치는 효과

Scoparone이 collagen 유도의 혈소판에서 cAMP 및 cGMP 생성을 농도 의존적으로 증가시켰으므로(Fig. 2), 본 연구에서 scoparone이 collagen 유도의 혈소판에서 cAMP- 의존성인 VASP Ser¹⁵⁷ 및 cGMP-의존성인 VASP Ser²³⁹ 인산화에 미치는 효과를 본 결과는 Fig. 4에서 나타낸 바와 같이 scoparone에 의해 농도 의존적으로 VASP Ser¹⁵⁷ 및 VASP Ser²³⁹ 인산화가 통계학적으로 유의하게 증가하였다.

특히 100 μM 이상의 농도에서 유의성이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였으며(P<0.01), 이는 scoparone에 의해 생성 이 증가한 cAMP 및 cGMP가 VASP의 인산화를 유의하게 증가시킨 것임을 보여준다.

Scoparone이 αIIb/β3에 대한 fibrinogen binding에 미 치는 효과

Scoparone이 cAMP와 cGMP의 생성 증가를 통해 VASP Ser¹⁵⁷및 VASP Ser²³⁹의 인산화를 증가시켰기 때문에(Fig.

(5)

A

B

Fig. 5. Effects of scoparone on collagen-induced fibrinogen binding. (A) The flow cytometry histograms on fibrinogen binding.

a, Intact platelets (base); b, collagen (2.5 μg/mL); c, collagen (2.5 μg/mL)＋scoparone (50 µM); d, collagen (2.5 μg/mL)＋scoparone (100 µM); e, collagen (2.5 μg/mL)＋scoparone (200 µM). (B) Effects of scoparone on collagen-induced fibrinogen binding (%).

Measurement of fibrinogen binding was described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±SD (n=4). ^#P<0.05 compared with no-stimulated platelets. ^*P<0.05, ^**P<0.01 compared with the collagen-stimulated platelets.

4), 본 연구에서는 scoparone이 αIIb/β3에 대한 fibrinogen 결합능에 미치는 효과를 확인하였다. Collagen은 85.2±

1.5%의 비율로 αIIb/β₃에 대한 fibrinogen 결합을 증가시켰 다(Fig. 5A-b, 5B). 그러나 scoparone에 의해 fibrinogen 결합이 농도 의존적으로 억제되었고, 특히 100 μM 이상의 농도에서 유의성이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다(P<

0.01). 또한 scoparone(200 μM)의 억제율은 79.0%로 확인 되었다(Fig. 5A-c~e, 5B).

Scoparone이 혈소판 매개 fibrin clot 형성에 미치는 효과 혈소판 활성유도제를 통한 αIIb/β3의 활성화에 의해 fi- brinogen의 결합이 증가하면서 시간이 지남에 따라 외부 αIIb/β₃ 신호 전달 경로를 통해 fibrin clot이 형성된다. 따라 서 본 연구에서는 scoparone이 thrombin 유도의 fibrin clot 형성에 미치는 효과를 확인하였다. Fig. 6A에 보여준 바와 같이 thrombin에 의해 fibrin clot이 강하게 형성되었

고, scoparone(50, 100, 200 μM)은 thrombin이 유도한 fibrin clot의 형성을 농도 의존적으로 억제하였고, 특히 100 μM 이상의 농도에서 유의성이 뚜렷하게 나타나는 것을 확 인하였다(P<0.01). 또한 scoparone(50, 100, 200 μM)의 억제율은 각각 12.1, 57.1, 90.4%로 확인되었다(Fig. 6B).

고 찰

혈소판 활성화가 일어날 때 phospholipase C-γ₂(PLC-γ₂) 는 혈소판 막의 PIP₂를 가수분해하여 IP₃와 DG로 생성되게 한다. 생성된 IP3는 dense tubular system으로부터 세포 내로의 Ca²⁺ 동원([Ca²⁺]i)을 유도하고, DG에 의해 DG-의 존성 단백질 kinase C(PKC)로 활성화된다(Berridge와 Ir- vine, 1989). 증가한 [Ca²⁺]_i는 Ca²⁺/calmodulin 의존성 단 백질인 myosin light chain(20 kDa) 및 plecktrin(40 또는 47 kDa)의 인산화를 유발하여 혈소판 활성화가 일어난다

(6)

A

B

Fig. 6. Effects of scoparone on fibrin clot retraction. (A) Effects of scoparone on thrombin-retracted fibrin clot photographs (B) Effects of scoparone on thrombin-retracted fibrin clot area. Quan- tification of fibrin clot retraction was described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±SD (n=4). ^#P<0.05 compared with no-stimulated platelets. ^*P<0.05,

**P<0.01 compared with the thrombin-stimulated platelets.

(Nishikawa 등, 1980).

한편 cyclic nucleotides(cAMP 및 cGMP)는 [Ca²⁺]_i를 감소시키고 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 kinase(PKA 및 PKG)를 활성화하여 혈소판 응집을 억제하는 것으로 알 려져 있다(Kuo 등, 1980). 이 연구에서 scoparone은 혈소 판에서 cAMP 및 cGMP 생성을 농도 의존적으로 크게 증가 시켰으며, [Ca²⁺]_i를 억제하였다. 이 결과는 scoparone에 의해 생성이 증가한 cyclic nucleotides가 [Ca²⁺]_i를 하향 조절함으로써 혈소판 활성을 억제하는 데 중심적인 역할을 한다는 것을 나타낸다. 증가한 cAMP 및 cGMP는 PKA 및 PKG를 활성화하여 여러 기질을 인산화하는 데 사용되며, IP3R의 인산화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Sch- warz 등, 2001). Fig. 3A에 나타낸 바와 같이 scoparone에 의해 IP₃R의 인산화가 농도 의존적으로 증가하였다. 이는 scoparone에 의한 PKA 및 PKG의 활성화가 IP₃R의 인산화 를 일으킴으로써 dense tubular system으로부터 Ca²⁺ 채 널의 개방을 억제하여 [Ca²⁺]i를 감소시켰음을 의미한다.

또한 scoparone에 의한 cAMP 및 cGMP 생성의 증가는 PKA 및 PKG의 활성화를 통해 이들의 기질인 VASP의 인산 화를 초래하였다. VASP는 혈소판 분비 및 부착 특성을 조절 하여 혈소판 활성화를 조절하는 cAMP/cGMP-의존성 PKA/

PKG의 주요 기질로서 작용하며, VASP 인산화는 integrin αIIb/β₃의 활성화를 억제하여 혈소판 응집을 저해하는 것으 로 알려져 있다(Wangorsch 등, 2011; Napeñas 등, 2013).

본 연구에서 scoparone은 collagen 유도의 혈소판에서 αIIb/β3에 대한 fibrinogen 결합을 강력하게 억제하였다. 이 는 scoparone에 의한 cAMP 및 cGMP 생산 증가가 PKA 및 PKG의 활성화를 일으켜 PKA 의존성인 VASP Ser¹⁵⁷과 PKG 의존성인 VASP Ser²³⁹를 인산화한 것으로 생각된다.

또한 integrin αIIb/β3 매개 신호 전달은 일반적으로 혈소판 세포 골격의 변형을 일으켜 혈소판 증식 및 혈전 생성에 영 향을 미친다. 혈전 생성은 혈관의 손상된 부분을 수리하는 동안 가장 중요한 단계로서 손상된 혈관은 활성화된 혈소판 을 축적하고 fibrin 혈소판 meshwork로 발전한다. 손상된 혈관의 지혈에 작용하는 fibrin clot의 형성은 30~60분 동 안 수축하기 시작하고 생성된 plug를 당김으로써 혈전을 생 성시킨다. αIIb/β3와 fibrinogen 사이의 상호 작용은 fibrin clot 형성에 중요한 역할을 하며, αIIb/β₃ 활성 억제제는 혈 전 형성을 강하게 억제하는 것으로 알려져 있다(Topol 등, 1999). Thrombin은 응고를 유발하고 혈소판 αIIb/β₃를 활 성화해 fibrinogen의 αIIb/β3에 대한 결합능을 증가시켜 응 고 혈전 생성을 일으킨다. Fig. 6에 나타낸 바와 같이 sco- parone의 항혈소판 효과는 혈전 형성 억제의 실제 결과인 thrombin 유도의 fibrin clot을 농도 의존적으로 억제하였 다. 이러한 결과는 scoparone이 cAMP 및 cGMP 생성을 증가시키고 혈전 생성을 억제하는 강력한 항혈소판 물질로 서 가능성이 있음을 보여준다.

앞으로 scoparone이 cAMP 및 cGMP 생성을 증가시킨 기전에 대한 추가 연구가 필요하다. 앞선 연구에 따르면 scoparone은 NO를 증가시키고 cGMP 생성을 증가시켜 혈 관 확장을 통해 음경 발기를 촉진한다고 보고된 바가 있다 (Choi 등, 2017). NO는 혈소판에서 NO sensitive guanylyl cyclase(NO-GC)를 활성화해 cGMP 생성을 증가시키며, 활성화된 NO-GC에 이어 일어나는 cGMP 생성, cGMP-의 존성 단백질 kinase(PKG)의 활성화는 혈전 용해를 촉진한 다고 알려져 있다(Wen 등, 2018). 본 실험의 결과에서도 scoparone이 cGMP 생성을 유의하게 증가시켰음이 확인되 며, 이는 scoparone에 의한 NO의 증가로 인한 것일 수 있 다. 또한 cAMP와 cGMP는 PDE(cyclic nucleotide phosphodiesterase) 또는 adenylyl cyclase/guanyl cyclase의 활성화에 의존한다고 알려져 있다(Gao 등, 2015). 혈소판 응집에서 cyclic nucleotides의 수준은 PDE 활성의 억제를 통해 증가하기 때문에 PDE 억제제는 혈전증에 대한 치료 효과를 가지는 것으로 보고되고 있다(Haslam 등, 1999).

실제로 triple rusal, cilostazol 및 dipyridamole과 같은 PDE 억제제는 cyclic nucleotides의 생성을 임상적으로 증 가시키는 항혈소판제로 사용되고 있다(Menshikov 등, 1993).

Scoparone이 이와 유사한 기전을 통해서 항혈소판 작용을 하는 약물로써 개발될 가능성이 있다.

(7)

결론적으로 scoparone은 사람 혈소판에서 cAMP 및 cGMP를 증가시켜 IP₃R 및 VASP 인산화를 유도하여 세포 질 내로의 Ca²⁺의 동원 및 integrin αIIb/β3의 활성화를 유의 하게 억제하였고, 최종적으로 thrombin 유도의 fibrin clot 의 생성을 유의하게 억제하였다. 따라서 본 연구는 scopar- one이 효과적인 항혈전제 및 치료제로 개발될 수 있음을 제안한다.

요 약

혈소판 활성화는 혈관 손상에 대한 지혈 과정에 필수적이다.

그러나 과도한 혈소판 활성화는 죽상동맥경화증, 혈전증 및 심근경색을 포함한 여러 심혈관 질환을 유발할 수 있다.

Scoparone은 Artemisia 또는 Scopolia 속의 뿌리에서 흔 히 발견되며 면역억제 및 혈관 이완을 포함한 약리학적인 특성에 대해 연구되었지만, 항혈소판 효과에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 본 연구는 scoparone이 collagen에 의해 유도한 사람 혈소판 활성화에 미치는 영향을 연구하였다.

그 결과로, scoparone은 농도 의존적으로 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)와 cyclic guanosine monophosphate(cGMP) 수준을 유의하게 증가시켰다. 또한 scopar- one은 cAMP 의존성 kinase(PKA) 및 cGMP 의존성 kinase(PKG)의 기질로 작용하는 inositol 1,4,5-triphosphate receptor(IP3R) 및 vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)을 유의하게 인산화시켰다. Scoparone에 의한 IP₃R의 인산화는 dense tubular system의 Ca²⁺ 채널로부 터 동원되는 Ca²⁺억제를 유발하였고, VASP의 인산화는 혈소판 막에 있는 αIIb/β3의 불활성화를 일으켜 fibrinogen 결합을 저해함으로써 혈소판 활성을 억제하는 데 관여하였 다. Scoparone은 thrombin-유도의 fibrin clot 생성을 억제 함으로써 최종적으로 혈전 형성을 감소시켰다. 그러므로 본 연구에서는 scoparone이 강력한 항혈소판 효과를 가지며 혈소판이 유래하는 혈전성 질환의 예방 및 치료제로서 가능 성이 있음을 제안한다.

감사의 글

이 논문은 2019년도 남서울대학교 학술연구비 지원에 의해 연구되었음.

REFERENCES

Berridge MJ, Irvine RF. Inositol phosphates and cell signalling.

Nature. 1989. 341:197-205.

Cattanco M, Tenconi PM, Lecchi A, Mannucci PM. In vitro effects of picotamide on human platelet aggregation, the re- lease reaction and thromboxane B2 production. Thromb Res.

1991. 62:717-724.

Cavallini L, Coassin M, Borean A, Alexandre A. Prostacyclin and sodium nitroprusside inhibit the activity of the platelet inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and promote its phos-

phorylation. J Biol Chem. 1996. 271:5545-5551.

Choi BR, Kim HK, Park JK. Penile erection induced by scopar- one from Artemisia capillaris through the nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate signaling pathway. World J Mens Health. 2017. 35:196-204.

Furuichi T, Mikoshiba K. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor- mediated Ca²⁺ signaling in the brain. J Neurochem. 1995. 64:

953-960.

Gao J, Tao J, Liang W, Zhao M, Du X, Cui S, et al. Identifica- tion and characterization of phosphodiesterases that specifi- cally degrade 3’3’-cyclic GMP-AMP. Cell Res. 2015. 25:539- 550.

Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca²⁺

indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 1985. 260:3440-3450.

Haslam RJ, Dickinson NT, Jang EK. Cyclic nucleotides and phosphodiesterases in platelets. Thromb Haemost. 1999. 82:

412-423.

Huang HC, Chu SH, Chao PD. Vasorelaxants from Chinese herbs, emodin and scoparone, possess immunosuppressive properties. Eur J Pharmacol. 1991. 198:211-213.

Huang HC, Lee CR, Weng YI, Lee MC, Lee YT. Vasodilator effect of scoparone (6,7-dimethoxycoumarin) from a Chinese herb. Eur J Pharmacol. 1992. 218:123-128.

Kuo JF, Andersson RG, Wise BC, Mackerlova L, Salomonsson I, Brackett NL, et al. Calcium-dependent protein kinase: wide- spread occurrence in various tissues and phyla of the animal kingdom and comparison of effects of phospholipid, calmodulin, and trifluoperazine. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980.

77:7039-7043.

Laurent V, Loisel TP, Harbeck B, Wehman A, Gröbe L, Jock- usch BM, et al. Role of proteins of the Ena/VASP family in actin-based motility of Listeria monocytogenes. J Cell Biol.

1999. 144:1245-1258.

Lu C, Li Y, Hu S, Cai Y, Yang Z, Peng K. Scoparone prevents IL-1β-induced inflammatory response in human osteoarthritis chondrocytes through the PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 2018. 106:1169-1174.

Menshikov MYU, Ivanova K, Schaefer M, Drummer C, Gerzer R. Influence of the cGMP analog 8-PCPT-cGMP on agonist- induced increases in cytosolic ionized Ca²⁺ and on aggregation of human platelets. Eur J Pharmacol. 1993. 245:281-284.

Napeñas JJ, Oost FC, DeGroot A, Loven B, Hong CH, Brennan MT, et al. Review of postoperative bleeding risk in dental pa- tients on antiplatelet therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 2013. 115:491-499.

Nishikawa M, Tanaka T, Hidaka H. Ca²⁺-calmodulin-dependent phosphorylation and platelet secretion. Nature. 1980. 287:863- 865.

Ohkubo S, Nakahata N, Ohizumi Y. Thromboxane A2-mediated shape change: independent of Gq-phospholipase C－Ca²⁺ pathway in rabbit platelets. Br J Pharmacol. 1996. 117:1095-1104.

Quinton TM, Dean WL. Cyclic AMP-dependent phosphorylation of the inositol-1,4,5-trisphosphate receptor inhibits Ca²⁺ re- lease from platelet membranes. Biochem Biophys Res Com- mun. 1992. 184:893-899.

Saitoh M, Naka M, Hidaka H. The modulatory role of myosin light chain phosphorylation in human platelet activation. Bio- chem Biophys Res Commun. 1986. 140:280-287.

Schwartz SM, Heimark RL, Majesky MW. Developmental mech- anisms underlying pathology of arteries. Physiol Rev. 1990.

70:1177-1209.

Schwarz UR, Walter U, Eigenthaler M. Taming platelets with cyclic nucleotides. Biochem Pharmacol. 2001. 62:1153-1161.

(8)

Shin JH, Kwon HW, Lee DH. Ginsenoside F4 inhibits platelet aggregation and thrombus formation by dephosphorylation of IP3RI and VASP. J Appl Biol Chem. 2019. 62:93-100.

Su CY, Shiao MS, Wang CT. Differential effects of ganodermic acid S on the thromboxane A2-signaling pathways in human platelets. Biochem Pharmacol. 1999. 58:587-595.

Sudo T, Ito H, Kimura Y. Phosphorylation of the vasodilator- stimulated phosphoprotein (VASP) by the anti-platelet drug, cilostazol, in platelets. Platelets. 2003. 14:381-390.

Topol EJ, Byzova TV, Plow EF. Platelet GPIIb-IIIa blockers.

Lancet. 1999. 353:227-231.

Wangorsch G, Butt E, Mark R, Hubertus K, Geiger J, Dandekar T, et al. Time-resolved in silico modeling of fine-tuned cAMP signaling in platelets: feedback loops, titrated phosphoryla- tions and pharmacological modulation. BMC Syst Biol. 2011.

5:178.

Wen L, Feil S, Wolters M, Thunemann M, Regler F, Schmidt K, et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nat Commun. 2018. 16:4301.