Detection and Genetic Differentiation of Megalocytiviruses in Shellfish, via High-Resolution Melting (HRM) Analysis

(1)

Kor J Fish Aquat Sci 47(3),241-246,2014

한수지 47(3), 241-246, 2014

Original Article

241 Copyright © 2014 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

서 론

참돔이리도바이러스병

(RSIVD, red seabream iridovirus dis- ease)

^은

1990

^년^일본^시코쿠^지역의^참돔^{양식장에서}^처음^발 병된후

,

^매년^{발병지역의}^확산되고^있다

(Inouye et al., 1992).

원인체가 되는

Megalocytiviruses

는

major capsid protein (MCP) gene, adenosine triphosphatase (ATPase) gene

^등을^사 용한계통적분석에의해

4

개의

subgroup

으로분류되고있다

(Imajoh et al., 2007). Subgroup 1

^은

RSIV

^를^포함하고^있으며

, subgroup 2

^는^{우리나라의}^주요^{병원체로서}^돌돔

(Oplegnathus fasciatus)

등에매년대량폐사를유도하는

rock bream irido- virus (RBIV)

^를^포함한다

. Subgroup 3

^은^중국의^담수^식용어인

mandarin fish (Siniperca chuatsi)

에서분리된

infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)

^가^{대표적이며}

, subgroup

4

^는^최근^넙치

(Paralichthys olivaceus)

와터봇

(Scophthalmus maximus)

^에서 ^분리된

flounder iridovirus (FLIV)

^와

turbot reddish body iridovirus (TRBIV)

을 포함하고 있다

.

이러한

subgroup

^중^최근까지^국내의^어류^{양식장에서는}

subgroup 2

와

4

^에^의한^질병의^발생만이^보고되어^있다

(Do et al., 2005;

Oh et al., 2006; Jeong et al., 2003).

패류는여과섭식

(filter-feeding)

^을 ^통해^{먹이섭취를}^하는^과 정중

norovirus

등의

human enteric virus

뿐만아니라

marine birnavirus (MABV), white spot syndrome virus (WSSV)

^와^같 은수생동물에영향을줄수있는바이러스들이중장선

(diges- tive gland)

^에^축적되어^존재하는^것이^보고되고^있다

(Atmar et al., 1995; Gerba et al., 1978; Goyal et al., 1979; Suzuki and Nojima, 1999; Vazquez-Boucard et al., 2010).

특히

Megalo-

cytivirus

는국내에서매년주기적으로발병하고있으나최근

HRM 분석법을 이용한 패류 내 Megalocytiviruses의 검출과 유전적 분석

김광일·진지웅

¹

·김영철

¹

·정현도

¹

*

국립수산과학원 수산생물방역과, ¹부경대학교 수산생명의학과

Detection and Genetic Differentiation of Megalocytiviruses in Shellfish, via High-Resolution Melting (HRM) Analysis

Kwang Il Kim, Ji Woong Jin

¹

, Young Chul Kim

¹

and Hyun Do Jeong

¹

*

Aquatic Life Disease Control Division, National Fisheries Research & Development Institute, Busan 619-902, Korea

1

Department of Aquatic Life Medicine, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea

Viruses in the genus Megalocytivirus have been subdivided into four subgroups. Among these subgroups 2 and 4, represented by the red sea bream iridovirus (RBIV) and the olive flounder iridovirus (FLIV), respectively, are non- exotic. subgroups 1 and 3, represented by the red sea bream iridovirus (RSIV) and the infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV), respectively, have not been detected in Korea and are known as exotic. Shellfish are filter- feeders, and can thus filter and accumulate Megalocytivirus in their digestive glands, allowing us to track viral con- tamination in surrounding aquatic environment. In this study, we developed a high-resolution melting (HRM) analy- sis to differentiate among subgroups of Megalocytivirus accumulated in shellfish, and confirmed the convenience and efficiency of this method. More than two subgroups of Megalocytivirus were found in the digestive gland of a single shellfish. We classified all Megalocytivirus viruses from shellfish in Korea into subgroups 2 and 4, although proportions of subgroups were different among regions. Compared to nucleotide sequencing analysis, HRM analysis is a simple and rapid method for differentiating of Megalocytivirus subgroups.

Key words: Megalocytivirus, Differentiation , 2-step PCR, High-resolution melting, Shellfish

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/)which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

http://dx.doi.org/10.5657/KFAS.2014.0241 Kor J Fish Aquat Sci 47(3) 241-246, June 2014

Received 21 April 2014; Revised 27 May 2014; Accepted 16 June 2014

*Corresponding author: Tel: +82.51.629.5941 Fax: +82. 51. 629. 5938

E-mail address: [email protected]

(2)

에야국내에서식하는패류내로의축적및분석방법에대한접 근이겨우이루어지고있는실정이다

(Kim et al., 2011).

더구나 현재까지패류내에축적된

Megalocytivirus

의유전적분류에 대한신속한분석방법이마련되지않고있어보다정밀한패류 내바이러스의위험성에대한유전적정보가충분히이루어지 지않고있다

.

현재

PCR

방법과함께자주사용되고 있는

high-resolution melting (HRM)

^기법은

PCR

^수행^시

intercalating fluorescent dye

를첨가하여

PCR

과정에서생성되는

amplicon

에결합시키 고

,

^이후^온도^상승을^줌으로써

target

^부위의^{염기서열에}^따라 서각기다른형태로나타나는

fluorescence signal

^의^변화^특성 을분석하는방법이다

(Kristensen and Dobrovic, 2008; Tajiri- Utagawa et al., 2008; Wittwer et al., 2003).

^따라서

HRM

^기법 의적용은

PCR target

부위에서의

variation

을보다빠르고손 쉽게구별함으로써패류내에축적된

Megalocytivirus

의진단

과함께

subgroup

^까지의^유전적^특성을^분별^확인을^가능하게

하여어류질병발생과패류내축적원인체간의상관관계를 확립할수있게한다

.

본연구에서는

Megalocytivirus

의패류중장선에의축적을확 인하고

,

^이들^{바이러스의}^유전적^분류를^위하여

, MCP

^유전자

부위에서나타나는유전적변이특성에대해

HRM

^기법을^적

용하여

subgroup

을확인하는기법을확립하고국내발생

RSIV

질병원인체에대한유전적의미를보고하고자한다

.

재료 및 방법

실험재료

본실험에사용된굴은

2010

^년

3

^월^진하

(

^동해^지역

)

^및

2011

^년

3

월고성

(

남해지역

)

에서채취한굴

(Crassostrea gigas)

그리고

2011

^년

9

^월^서산

(

^서해^지역

)

^에서^바지락

(Tapes philippinarum)

을채취하였다

.

^채취한^각각의^{패류로부터}^중장선을^각각^분리 하여

-70℃

에보관하면서사용하였다

.

바이러스

2000

년

9

월에 남해안 양식장에서

Megalocytivirus

에 감염 된 돌돔비장에서 분리한

IVS strain (subgroup 2, Jeong et al., 2003, GenBank accession numbers for ATPase gene : AF487899)

과

2004

년국내로수입되는관상어중

Megalocyti- virus

에감염된

pearl gourami (Trichogaster leeri)

의비장에서

분리한

PGIV-K1 strain (subgroup 3, Jeong et al., 2008)

^을^숙 주세포인

GF

세포

(ATCC CCL-58)

에접종하여배양하였다

.

배 양방법으로

70-80%

^배양된^단일^층의

GF

^세포에^감염^비장^조 직마쇄액

200 μL (10 mg/mL)

를접종하여

25℃

에서배양하는 방법을사용하였다

. 2-3

^일^배양한^후

cytopathic effect (CPE)

가일어나부착된세포가떨어지면

15 mL tube

^에^회수하여^냉 동과해동의과정을

3

번씩수행한후

1,500 × g

에서

10

분간원 심분리하여상징액

1 mL

^씩^{분주하여서}

-70℃

^에^보관하여^사 용하였다

.

그리고

2010

년

11

월포항넙치양식장에서

Mega- locytivirus

에감염된넙치의비장으로부터분리된

FLIV strain (subgroup 4)

^을

-70℃

^에^보관하여^{사용하였다}

.

DNA의 추출

패류의중장선

50 mg

^또는^배양된^바이러스^상등액

200 μL

^로 부터

AccuPrep

^®

Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Ko- rea)

^을^사용하여^제조사의

protocol

^에^따라서

DNA

^를^분리하여

50 μL

^의

TE buffer

^에^현탁^하였다

.

^분리된

DNA

^는^분광^광도 계

(Eppendorf

^®

BioPhotometer)

를 사용하여 흡광도측정으로

A260/A280 nm

^값을^구하여

DNA

^의^양을^{측정하였으며}^실험 전까지

-20℃

에서보관하였다

.

2-step PCR

추출한

DNA

^를

template

^로^사용하여

1-step PCR (Applied Biosystems

^®

2720 Thermal Cycler)

를아래와같은방법으로 실시하였다

. 10× PCR buffer 2 μL, 200 μM

^의^각각의

dNTP, 1 μM

의

sense primer

와

1 μM

의

antisense primer (Table 1), Taq DNA polymerase (G-Taq DNA polymerase, Cosmogentech, Korea)

^및

template 1 μL

^를^첨가한^후^증류수로^최종액의

vol- ume

이

20 μL

가되도록했다

. PCR

혼합물은

94℃

에서

3

분간

pre-denaturation

^시킨^후

, 94℃

^에서

30

^초

denaturation, 55℃

에서

30

초

annealing, 72℃

에서

30

초

extension

의반응을

35 cycle

^수행^한^후

72℃

^에서

7

^분간

post-extension

^시켰다

. 2-step PCR amplification

^은

1-step PCR product 1 μL

^를

template

^로 사용하여위와동일한방법으로실시하였다

.

PCR

^후^증폭^산물은

0.5 μg/μL EtBr (Ethidium Bromide)

^이 첨가된

2% agarose gel

을이용하고

, 1×TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)

^를^{전기영동을}^위한^{완충액으로}^하 여전기영동을실시하였다

. UV

^{검출기에서}^나타나는

band

^를 관찰하여그증폭여부를확인하였다

.

Table 1. Primers information used in this study

Primers Sequence (5’->3’) Object Product size (bp) Reference

M1F GCTGCGCATGCCAATCATCT

1-step PCR 401 Kim et al., 2011

M1R ATGCGATGGAGACCCACTTG

MeHRMF GGCGGCGACAATGCCGTG

2-step PCR & HRM 280 This study

MeHRMR CCACCAGGTCGTTAAATGA

(3)

HRM분석법을 이용한 Megalocytivirus의 유전적 분석

243 Cloning 및 Plasmid 분리

각지역에서가장뚜렷한

2-step PCR

^양성을^보이는^시료를 하나씩택하여

amplicon (280 bp)

^을

GeneAll

^®

Expin Gel SV kit (GeneAll Biotechnology, Korea)

^을 ^사용하여^{정제하였으} 며

,

정제된

DNA

를

pGEM-T Easy vector (Promega, USA)

에

ligation

^후

E. coli DH5α

균주에

transformation

^시켰다

. Am- picillin (50 μg/mL)

^과

X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galactopyranoside, Sigma, USA; 40 μg/mL)

^이^첨가된

LB (Luria-Bertani, Difco, USA)

^{평판배지에서} ^증식된

colonies (clones)

를무작위로선택하여

LB broth

에접종후

37℃

에서

24

^시간 ^{배양하였다}

.

^{배양액으로부터}

GeneAll

^®

Plasmid SV Mini kit (GeneAll Biotechnology, Korea)

^를^이용하여

plasmid DNA

^를^{분리하였으며}^이를

HRM

^분석에^{사용하였다}

. HRM 분석기법을 이용한 Megalocytivirus의 sub- group 분석

Megalocytivirus

의

sub-typing

^에^사용된^{표준검정시료는}^배 양된 바이러스

(subgroup 2, IVS; subgroup 3, PGIV-K1)

^과

FLIV (subgroup 4)

^감염^넙치의^{비장으로부터}^추출된

DNA

^를 사용하였다

.

^그리고

Megalocytivirus

^양성^패류의^{중장선으로} 부터직접추출한

DNA

또는

2-step PCR

생성물로부터

cloning

하여분리된

plasmid DNA

^를

HRM template

^로^{사용하였다}

.

HRM

^을^시행하기^위한^{반응액에는}

10×buffer 2 μL, 200 μM

의각각의

dNTP, 1 μM

^의

forward

^와

reverse primer, EvaGreen (Bioyium, Korea) 1 μL, Hot start Taq (HS prime Taq DNA polymerase, Genet Bio, Korea)

및

template 1 μL

를첨가후증 류수로최종액의

volume

^이

20 μL

^가^되도록^했다

. HRM

^분석 은

Rotor-Gene

^TM

6000 (Qiagen, Germany)

^을^{사용하였고}^아래 와같은방법으로실시하였다

.

먼저

95℃

^에서

5

^분간

pre-denaturation

^시킨 ^후

, 95℃

^에서

10

초

denaturation, 56℃

에서

10

초

annealing, 72℃

에서

15

초

extension

^의^반응을

45 cycle

^{수행하였다}

. 45 cycle

^이^끝난^후

80-90℃

^에서

0.1℃/s

^의^속도로^온도를^{증가시키며}

Tm (melt- ing temperature)

^값을^{측정하였다}

.

결 과

패류 중장선 내 Megalocytivirus의 검출

채집된패류각개체별로

(18

^개체

)

^분리된

DNA

^를

template

로하여

Megalocytivirus

^에^대해

PCR

^을^{수행하였을}^때

1-step PCR (35 cycles)

에서 모두 음성의 결과를 보였으나

, 2-step PCR (35 cycles)

^수행^시^진하^굴^시료에서

50.0%,

^고성^굴^시 료에서

38.9%,

^서산^바지락^시료에서

39.0%

^의^시료에서

280 bp

^의

amplicon

^을^생성하는^양성률을^보여^지역간의^뚜렷한^차 이는나타나지않았다

.

HRM 분석 기법의 최적화

HRM

^{분석기법의}^최적화를^실시하기^위해서

Megalocytivi- rus

의

subgroup 2 (IVS), subgroup 3 (PGIV-K1)

^그리고

sub-

group 4 (FLIV)

^의^각각에^해당하는^{표준검정시료를}^대상으로

HRM

을실시하였다

.

현재

subgroup 1

은우리나라

,

일본중국 에서도발견되지않으며또한새롭게제시되고있는현재의분 류체계에서는

subgroup 2

^에^포함하는^경우가^많으므로^여기서 는따로구별하여분석을실시하지않았다

HRM

^을 ^수행한^결과

, Megalocytivirus

^의 ^각

subgroup

^별로

Tm

값이

IVS

의경우

87.35℃, PGIV-K1

의경우

88.13℃, FLIV

의경우

87.90℃

^차이가^{나타났으며}

,

^증폭된^산물의^염기서열 차이에따라서감소하는형광값이차이가났다

.

^그리고^감소 하는형광값을

normalized fluorescence

^로^{변환하였을}^때

sub- group

^별로^구별이^{가능하였다}

(Fig. 1).

HRM을 활용한 패류 내 존재하는 Megalocytivirus의 subgroup분석

Megalocytivirus

^양성^{개체로부터}^분리된

DNA

^를^직접

tem- plate

^으로^하여

HRM

^을^수행할^경우

PCR

^증폭이^{이루어지지} 않아

melting-curve

^의^분석을^할^수^없었다

.

^하지만

2-step PCR

생성물로부터

cloning

하여분리된

plasmid DNA

를

template

로 하여

HRM

^을 ^{실시하였을}^때 ^{표준양성시료와}^동일한

Tm

값을확인할수있었으며

subgroup

^분석이^{가능하였다}

. HRM

을수행한모든양성시료에서

Megalocytivirus subgroup 2

와

subgroup 4

^가^존재하고^있음을^확인^할^수^있었으며

,

^나타난

subgroup

들의비율은시료별로차이가나고있었다

. 2010

년

3

^월^진하^굴^내의

Megalocytiviruses (JHOy1003)

의경우분석 된

6

^개의

clones

^중

5

^개가

subgroup 4, 1

^개가

subgroup 2

^에^속 하는것으로나타났으며

, 2011

^년

3

^월^고성^굴^내의

Megalocy- tiviruses (GSOy1103)

^의^경우^분석된

5

^개의

clones

^중

2

^개가

subgroup 4

에

, 3

개가

subgroup 2

로나타났다

.

그리고

2011

년

9

월서산바지락내의

Megalocytiviruses (SSC1109)

의경우분 석된

7

^개의

clones

^중

1

^개가

subgroup 4, 6

^개가

subgroup 2

^에 속하는것으로나타났다

(Fig. 2, Table 2).

^또한

, HRM

^분석에 사용된

plasmid DNA

^를^염기서열^분석을^통해

subgroup

^을^확

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Normalised Fluorescence

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 deg.

84.6

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

100 80 60 40

20

Normalised Fluorescence 84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 89.8

deg.

Fig. 1. Genetic differentiation of the reference Megalocytiviruses using high-resolution melting (HRM) analysis.

(4)

김광일

ㆍ

진지웅

ㆍ

김영철

ㆍ

정현도

244

인한결과

HRM

^결과와^일치하고^있음을^알^수^있었으며

,

^국

내

Megalocytiviruses

에서는동일

subgroup

내에서의유전적

variation

^이^매우^{제한적으로}^일어나고^있음을^확인^할^수^있었 다

(Fig. 3).

고 찰

패류의여과섭식을통한먹이섭취과정중축적된

norovirus

등의

human enteric virus

^에^대한^분석^방법은^많은^연구에^의 해보고되고있으며

,

^{수생동물에}^영향을^줄^수^있는^바이러스

인

MABV, WSSV

의패류조직내에서의축적도보고되고있

다

(Atmar et al., 1995; Gerba et al., 1978; Goyal et al., 1979;

Suzuki and Nojima, 1999; Vazquez-Boucard et al., 2010).

^또 한

Megalocytivirus

의패류내축적은추출방법론적인부분만 이루어져있고정확한감염의생태적상황

,

^그리고^병원체에^대 한빠르고신속한새로운유전적비교방법에대한결과는아직 미진한상태에있다

(Kim et al., 2011).

현재까지감염어류를대상으로하여국내에서보고된

Mega-

locytivirus

의

subgroup

^은^돌돔^등의^돔류에서^보고된

subgroup 2

^와 ^넙치

,

^터봇에서 ^보고된

subgroup 4

^의 ^두 ^종류이며 ^아직

subgroup 1

과

subgroup 3

은보고되지않고있다

.

따라서

feeding-activity

^를^가지는^패류에^오염된

Megalocy-

tivirus

^의^유전적^특성^규명은^주변^{수권에서의}^질병^발생과의

연관관계추적및어류양식산업에있어서본바이러스의위 험성재고측면에서매우의미있는정보라고할수있을것이 다

.

다만여기서명확히하여야할것은현재는

subgroup 2

는

subgroup 1

^을^포함^한다는^분류가^{일반적으로}^{받아들여지고}^있

으며

(Kurita and Nakajima, 2012),

^또한^현재까지^한

,

^중

,

^일의 최근

10

^년간의^보고에서

subgroup 1

^에^대한^질병^보고가^없 었으며

(Imajoh et al., 2007) subgroup 1

^과

subgroup 2

^의^구별 은큰의미를부여하기어려우므로본연구에서

subgroup 1

과

subgroup 3

^로^나누어^논하고^있는

Megalocytivirus

는실질적 인측면에서는새로운개념으로받아들여지고있는

subgroup 3

라는하나의의미로이해되는것도가능할것으로추정된다

.

일반적으로패류의중장선에축적된바이러스

particles

수는 감염어류에비해적고또한유전적으로 유사한다양한

sub- group

^의

Megalocytivirus strains

^가^축적될^수^있기^때문에^특이 적인

primer

를사용한

PCR

에서나타난

amplicon

을분석하는 (B) Subgroups of Megalocytiviruses detected in Oysters in Gos- eong (GSOy1103)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 deg.

84.6

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

60 40

20

deg.

(A) Subgroups of Megalocytiviruses detected in Oysters in Jinha (JHOy1003)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 deg.

84.6

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

40

20

deg.

(C) Subgroups of Megalocytiviruses detected in Clams in Seosan (SSC1109)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 deg.

84.6

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

84.8 85.0 85.2 85.4 85.6 85.8 86.0 86.2 86.4 86.6 86.8 87.0 87.2 87.4 87.6 87.8 88.0 88.2 88.4 88.6 88.8 89.0 89.2 89.4 89.6 deg.

80 60 40

20

deg.

Fig. 2. Differentiation of the Megalocytivirus subgroups using high-resolution melting (HRM) analysis. Amplicons of the MCP gene of Megalocytiviruses in 2-step PCR from shellfish were cloned. Each purified plasmid from 5~7 separated colonies grown on a single cloning plate were used for HRM analysis.

Table 2. Distribution of subgroups in Megalocytivirus obtained from shellfish based on differentiation by high-resolution melting analysis.

Name Location Subgroup 2 Subgroup 3 Subgroup 4 JHOy1003 Eastern sea(Jinha) 1/6 0/6 5/6

GSOy1103 Southern

(Gosung)sea 3/5 0/5 2/5

SSC1109 Western

(Seosan)sea 6/7 0/7 1/7

(5)

HRM분석법을 이용한 Megalocytivirus의 유전적 분석

245

것은그

virus

^의^다양성^분석에는^충분한^의미를^부여하지^못한

다

.

그러므로다양한

viral strains

모두에서나타나는

conserved genomic region

^에^대한

primer

^를^사용한

PCR

^을^실시^한^후^생 성된

amplicon

의유전적특성또는

variation

을분석하면

detec- tion

^된

strains

^모두를^분석^할^수^있는^것과^같은^의미를^지니는 빠르고간편한방법의활용이필요하다

.

HRM

은

PCR

의증폭산물로부터

target

이되는유전자의유 전적 다양성을 신속하고 효율적으로 확인할수 있는기술로

mutant

나

variation

부위를 확인할 수 있다

(Kristensen and Dobrovic, 2008; Tajiri-Utagawa et al., 2008; Wittwer et al., 2003).

^따라서^본^{연구에서는}

Megalocytivirus

^의

MCP gene

^을

target

으로한

HRM

기법을사용하여패류내에축적된

Mega- locytivirus

의

subgroup

^의^분석을^유전자^염기^배열^분석^없이 보다빠르고

,

간단하며

,

편리하게실시하고자하였다

.

일반적으로패류에축적된바이러스는양적 문제뿐만아니 라 다른 유전자형의 바이러스가동시에 존재하기 때문에조 직

DNA

를주형으로한

PCR amplicon

에대한

HRM

의직접 적인적용은힘들다

.

^따라서^본^{연구에서는}

4

^종의

subgroup

^의

MCP

유전자부위에서

conserved region

을

target

으로한새로 운

primer

^를^제작하고^이를^사용하여

2-step PCR

^을^실시^한^후

결과물로나타난

amplicon

^을

pGEM-T Easy vector

^에

cloning

하였다

.

나타난

clones

를무작위로선별하여

plasmid

를분리한 후

cloned MCP gene

^에^대한

PCR amplicon

^의

variation

^에^대한

HRM

분석을실시하여

subgroup

을확인하였다

.

그결과

,

모든 양성시료에는

subgroup 2

^와

subgroup 4

^가^함께^존재하고^있는 것을확인할수있었다

.

^그러나

subgroup 1

^과

subgroup 3

^는^검 출되지않아아직까지의국내발병사례에서이두가지

type

에 의한사례가보고된바없다는결과와일치함을알수있었다

.

본연구에서비록

subgroup 1

에대한

HRM

은따로실시하지 않았으나

gene sequence analysis

^에서

subgroup 1

^로^분류^할 수있는

clones

^는^없었다

(Fig. 3).

^그러므로^{우리나라의}^수권은 우리나라양식현장에서나타나는

subgroup 2

와

subgroup 4

두 가지

types

^에^노출^되어^있으며

,

^아직

subgroup 1

^과

subgroup 3

은우리나라양식현장의수권에서비상존성바이러스종

(ex- otic species)

^으로^분류^할^수^있음을^확인^할^수^있었다

.

^향후^수 입수산물의검역에서이에대한보다정밀한분석이항상이루 어져새로운

subgroup

의국내유입방지책이있어야할것이다

.

더욱흥미로운 것은시료를 채취한지역별로 나타난

sub-

group

들의비율이차이가있다는것이었다

. JHOy1003

로부터 의

2-step PCR amplicon-clones

^중에는

subgroup 4

^가

83.3%

Fig. 3. Nucleotide sequence alignment of the MCP genes of Megalocytiviruses in shellfish. Each cloned plasmid was purified from colonies on plate used for cloning of MCP gene amplicons in 2-step PCR and used for determination of nucleotide sequence.

(6)

의비율로나타났고

, SSC1109

^로^부터의

2-step PCR amplicon- clones

중에는

subgroup 2

가

85.7%

의비율을차지하고 있어 동해지역

(

^진하

)

^은

subgroup 4,

^서해지역

(

^서산

)

^은

subgroup 2

^가 각각우점적임을확인할수있었다

.

그리고

GSOy1103

로부 터의

2-step PCR amplicon-clones

^중에는

subgroup 2

^가

60%, subgroup 4

^가

40%

^로^나타나^남해지역

(

^고성

)

^은

subgroup 2

^와

subgroup 4

가서로유사한비율로나타나고있음을확인할수

있었다

.

^이러한^결과는^주변^양식^환경에^따라^{넙치양식이}^주를

이루고있는동해지역의경우넙치에감염되는

FLIV

가굴에

축적되어서나타난다고생각되어지며또한동해지역과는달 리남해지역과서해지역의경우넙치양식뿐만아니라돌돔 양식을포함하여다양한어종의양식이이루어지고있으므로

subgroup 2

^와

subgroup 4

^에^속하는^{바이러스가}^매년^어류에서 발생하여수권으로유출되어패류내로축적되고있는것으로 확인되어졌다

.

^{기법적으로}^보면^염기서열^분석^결과와^본^연구 의

HRM

^결과와^{비교하였을}^때^결정^된

subgroup

^들은^서로^동 일한결과를보였으며

(Fig. 3),

이러한결과를통하여

Megalo- cytivirus

의

subgroup

^분석에^있어서

HRM

^{분석기법이}^기존의 염기서열분석법보다신속하고효율적임을확인할수있었다

.

결론적으로 국내에 서식하고 있는 패류의 중장선 내에서

Megalocytivirus

^의^오염^존재의^확인과^함께

subgroup

^의^결정 을위한

HRM

분석방법을제안할수있었으며

, Megalocytivi- rus

양성패류의중장선내에는

subgroup 2, subgroup 4

^가^존재 하고있음을확인할수있었다

.

향후패류및어류내감염바이

러스의진단및유전적분석을위하여본연구의

HRM

^기법의

응용은한단계진보된기법임을확인하였다

.

사 사

이논문은부경대학교자율창의학술연구비

(2013

^년

)

^의 ^지원 에의해연구되었습니다

.

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