Comparative analysis of amino acid content of Lentinula edodes, a new variety of shiitake mushroom, in 'Poongnyunko'

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J. Mushrooms 2017 March, 15(1): 31-37 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2017.15.1. 31 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853

© The Korean Society of Mushroom Science

*Corresponding author

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Received March 2, 2017 Revised March 16, 2017 Accepted March 23, 2017

표고 신품종 ‘풍년고’의 아미노산 함량 분석

박영애¹ · 박원철¹ · 가강현¹ · 구창덕^2,*

1

국립산림과학원 화학미생물과

2

충북대학교생태학연구실

Comparative analysis of amino acid content of Lentinula

edodes, a new variety of shiitake mushroom, in ‘Poongnyunko‘

Young-Ae Park¹, Won-Chull Bak¹, Kang-Hyeon Ka¹, and Chang-Duck Koo^2,*

1

Division of Wood Chemistry & Microbiology, National Institute of Forest Science, Seoul 02455, Korea

2

Department of Forest Science, Chungbuk National University, Cheongju 02455, Korea

ABSTRACT:

In this study, we investigated the amino acids content of shiitake mushrooms grown in eight different media and under three different temperature conditions. The sawdust media were supplemented with 4 kinds of nutrients - rice bran, barley, bean curd refuse, and red ginseng refuse in an 8:2 ratio with or without 0.5% calcium chloride, and the fruiting temperature was set to low (13–15

C), medium (18–20

C), or high temperatures (24–26

C). Seventeen amino acids were detected, and the content varied depending on the compositions of the media. The highest total amino acid content (209.7 mg/g) was measured in mushrooms from the media with red ginseng refuse, and the glutamic acid content was the highest (51.3 mg/g) in mushrooms from the media with barley. In terms of fruiting temperature, the amino acid content was the highest (38.2%) at medium temperature followed by the content at low (32.5%) and high temperature (29.3%). The amino acid composition of shiitake mushrooms was similar between the medium and low temperature conditions.

KEYWORDS:

Amino acids, Medium, Poongnyunko, Shiitake, Temperature

서 론

버섯은 향과 맛 그리고 영양적인 면에서 뛰어난 기능성 식품이며 당류, 단백질, 무기질, 비타민, 아미노산, 효소 등 인체에 중요한 영양 성분을 함유하고 있어 오래전부터 식용은 물론 약용으로 널리 이용되어 왔다(Breene, 1990;

Chang and Miles, 1989).

표고는 항종양, 항당뇨, 혈압조절, 동맥경화, 비만억제, 면역조절, 간장 보호, 생식력 증진(Fang et al, 2006;

Enman et al, 2007) 등의 성인병 예방 효과가 있다. 또한 각종 미네랄과 식이섬유를 포함한 저칼로리 식품으로 매 우 다양한 순기능이 알려져 있어 건강기능성 식품으로 주 목을 받고 있다. 버섯은 그 자체만으로도 영양원이 풍부 하지만 배지에 기능성 소재를 첨가하여 기능이 증진된 버 섯을 생산하려는 연구가 많이 시도되고 있다(Leem, 2012). 예를 들면 톱밥 및 액체배지에 비타민 B1, B12 첨 가 배양된 표고 자실체와 균사체의 성분변화(Jang et al, 2016), 칼슘 및 셀레늄 등의 무기성분을 첨가하여 버섯 자 실체로 전이여부 실험(Lotan et al, 1976; Lee et al, 2008, Chang et al, 2005; Yoon et al, 2007), 글루탐산나 트륨 첨가배지에서 재배된 큰느타리(Yoon et al, 2010)등 이다. 이처럼 기능성 식품으로 크게 주목받고 있는 버섯 은 기호성이 높고 항암활성(Lee and Nishikawa, 2003) 및 항산화효과(Cheung et al, 2003) 혈당강하(Konno et al, 2001) 콜레스테롤 저하작용(Kim et al, 2001) 등의 성인 병 예방에 효과가 있는 의약품 소재라 할 수 있다. 최근

미생물과 관련한 산업과 연구분야에서 세포 내 아미노산 의 분석에 대한 중요성과 관심이 증대되고 있다(Casal et al, 2000).

아미노산(amino acid)은 1900년대 초 생화학자들에 의 해 다시마의 맛성분으로 분리하여 monosodium glutamate (MSG)를 생산된 이후 1910년에 Ajinomoto사가 단백질을 산으로 가수분해하여 아미노산의 공업적 생산이 시작되었 다(Ruffio, 1987). 1956년에 일본의 Kyowa Hakko사가 Corynebacterium glutamicum의 야생균주를 이용한 미생 물의 발효에 의해 글루탐산나트륨(MSG, monosodium glutamate)을 생산하는 방법을 개발함으로써 대량생산이 가능하게 되었고, 1958년 L-lysine을 미생물을 이용한 발 효법으로 생산할 수 있게 되면서 급속하게 발전하였다 (Koinia and Shimono, 1957). 우리나라에서도 1956년 동 아화성사에서 밀 글루텐을 분해하여 MSG를 생산한 이래 1961년 미원(주)에 의해서 발효적 생산법이 도입되었다.

현재 아미노산은 단백질 가수분해 추출법, 화학합성법, 효 소전환법, 미생물 직접 발효법 등 약 20여종의 아미노산 과 400여종 정도의 아미노산 유도체가 개발되어 생산되 며, 13종 이상의 아미노산이 직법 발효법에 의해 생산되 고 있다. 최근에는 유전자 재조합에 의한 아미노산 생산 연구를 활발하게 추진되고 있다(Jung, 2013).

아미노산은 단백질을 이루는 구성성분으로 세포 기능 과 성장을 유지하기 위해 신진대사 과정에서 에너지 생 성을 위한 중요한 영양소로 알려져 있다. α-아미노산은 아미노단백질을 구성하는 원료로 총 20여 종이 있다. 이 중 류신, 라이신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 트레오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 히스티딘 등 아홉 가지는 체내에 서 합성되지 않으므로 반드시 음식물로 섭취해야 하는 필수 아미노산이다. 아미노산의 효능은 첫째, 근육의 원 료물질로 에너지를 발생시키고 활력을 도우며 둘째, 신 진대사의 촉매 역할과 셋째, 인체 조직의 재생과 회복을 돕는다. 표고는 독특한 향을 갖고 있어 널리 선호하는 식품으로 각종 아미노산이 풍부하고(Kalberer, 1974), 여러 약리작용 등이 있는 다당류를 함유하고 있어 기능 성식품으로 많이 연구되고 있다(Lee et al, 1981). 한편 어육류나 표고의 주요 맛성분이 핵산계 화합물인 disodium-5'-inosinate(IMP)로 밝혀진 이래 버섯에서 아 미노산 생합성 관련 효소의 유전자 재조합을 통해 산업 균주 개발에 적용되었다.

본 연구에서는 표고 신품종 ‘풍년고’를 이용하여 배지 영양원 종류와 버섯발생온도 조건에 따라 자실체를 생산 하고 아미노산 성분을 분석하였다. ‘풍년고’ 균주는 표고 버섯이 갖고 있는 아미노산의 종류 및 함량을 제공하는 기초자료의 제공과 이를 신품종 개발, 기능성 버섯 등 목 적에 맞는 맞춤형 재배에서 배지영양원, 재배환경 등에 유용한 자료로 활용하고자 한다.

재료 및 방법

배지 영양원별 균사생장 및 버섯 생산량 조사

톱밥에 영영원(미강, 밀기울, 보리, 콩비지, 홍삼박)을 8:2의 비율로 하여 CaCl₂ 첨가, 또는 미첨가 등 총 10 처 리구를 준비하였다. 다음은 18 mm×200 mm 시험관에 각 각의 혼합된 배지를 30±1 g 충진하여 121^oC에서 20분간 고압살균 하였다. 국립산림과학원 균주보존실에 보관되어 있는 풍년고 균주를 potato dextrose agar (PDA) 배지에 계대 배양한 block (7 mm)을 접종하고 25±1^oC의 항온기 에서 45일간 배양하였다. 조사는 5일 간격으로 균사생장 과 중량감소율을 측정하였다

버섯 생산량 조사용 배지의 조성은 참나무류 톱밥과 영 양원(미강, 보리, 콩비지, 홍삼박)의 비율이 8:2에 CaCl₂ 0.5%첨가와 미첨가 배지로 하였다. 총 8 처리구로 하였고 121^oC에서 90분간 고압살균 하였다. 접종 후 120일간 배 양하였으며, 30일 간격으로 중량감소율을 조사하였다 (Park et al, 2016). 발생실 온도는 18±1^oC, 습도는 90±5%, 광(光)은 300 Lux 내외로 조절하여 생산성을 조사하였다.

온도별 실험에서 발생실 온도는 저온(13~15^oC), 중온 (18~20^oC), 고온(24~26^oC)으로 설정하였다. 생산성은 3차 에 거쳐 조사하였다.

아미노산 함량 비교 시료준비 및 처리 가) 시료준비

버섯시료는 건조 후 분쇄기로 분쇄하여 분말 형태의 시 료를 준비하였다. 분석시료는 아미노산 표준물질 (agilent 5061-3330, 5062-2478), 반응 시약으로 Borate buffer (agilent 5061-3339), OPA reagent (agilent 5061-3335), FMOC solution (agilent 5061-3337)와 그 외 Na₂HPO₄, Na₂B₄O₇ (Sigma), ACN. MeOH : HPLC grade(Burdick

＆ Jackson)을 사용하였다.

나) 전처리

전처리는 염산가수분해법(Danial and Steven, 1993)으 로 하였다. 시료 0.5 g을 6 N-HCl 30 ml를 넣고 130^oC에 서 24시간 가수분해한다. 가수분해가 끝난 뒤 3차증류수 로 희석시킨 후 0.45 μm 수용성 syringe filter로 여과 한 다. 가수분해 된 시료를 다시 3차증류수로 희석한 후 HPLC로 분석 한다.

다) HPLC 분석조건(Table 1)

HPLC 분석은 Ultimate 3000 (Agilent, USA) 장비를 이용하였으며, FL Detector는 Emission 450 nm, Excitation 340 nm (OPA)와 Emission 305 nm, Excitation 266 nm (FMOC)로 하였고, UV Detector는 338 nm로 조 건을 잡았다. 표준용액은 1 nmol/Ul의 아미노산 17종 및

추가로 1000, 500, 100, 10 pmol/Ul 농도로 희석하여 만 들었다. 분석조건은 Column을 Inno C18 column (Innopia, Korea, 4.6 mmx150 mm, 5 μm)로 이동상 A는 Na₂HPO₄ 10 mM, Na₂B4O₇ 10H₂0 10 mM, pH 8.2, 이동상 B는 3DW/Acetonitrile/Methano (10:45:45 v/v/%)로 하였다.

시료의 주입량은 1 μL, Column 온도는 40^oC, 시료온도는 20^oC로 하였다. Pre Amino acids 반응이 자동 수행되며 적은 양의 Borate buffer, OPA/MPA, FMOC 시약과 함께 시료를 단계적으로 혼합한 후 반응을 종결하였다.

결과 및 고찰

배지조성에 따른 배양특성

배지첨가물을 달리하여 45일간 배양하며 균사생장과 배 지의 중량감소율을 조사하였다(Table 2, Fig. 1). 균사생장 량은 45일 배양했을 때 홍삼박 배지에서 144.9 mm로 생 장량이 가장 좋았고 다음은 보리가루+CaCl₂, 밀기울, 보 리가루, 콩비지, 미강, 밀기울+CaCl2, 미강+CaCl2, 콩비지 +CaCl_2, 홍삼박+CaCl2 순으로 나타났다. 대체로 균사생장 은 칼슘미첨가 배지가 칼슘첨가 배지보다 양호했다(Table 2). 특이한 것은 홍삼박 배지에서 균사생장이 가장 좋은 반면 홍삼박+ CaCl₂ 배지에서 균사생장이 가장 저조했다.

중량감소율은 2.9%~1.4%로 나타났고 밀기울 2.9%로 가 장 높았고 콩비지+칼슘이 1.4%로 가장 낮았다 (Fig. 1).

또한 보리의 경우 칼슘첨가 배지가 칼슘 미첨가 배지보다 균사생장 및 중량감소율이 높았다(Table 2, Fig. 1). Table 2와 Fig. 1의 결과에서 보리를 뺀 나머지 영양원의 경우 칼슘미첨가 배지에서 균사생장 및 중량감소율이 높게 나 타났다. 이는 분해율에 따라 균사생장속도가 빠르다는 것 은 섭취할 수 있는 영양원이 많다는 의미로 해석된다. 배 지의 영양원에 따라 균사생장에 영향력이 미치며 빠른 균 사생장은 해균으로부터의 경쟁에서 선점할 수 있다.

아미노산 함량 비교

배지조성에 따른 버섯자실체의 성분변화

본 실험에서 배지의 영양원을 다르게 하여 재배된 ‘풍 년고’ 자실체 내의 아미노산 성분을 분석 결과 총 17종의 아미노산이 검출되었다(Fig. 2). 검출되는 순서로 아스파

Table 1. HPLC condition for the analysis of amino acids.

Time Flow Rate Mobile phase A Mobile phase B

0 1.5 100 0

26 1.5 55 45

28 1.5 0 100

30 1.5 0 100

30.5 1.5 100 0

33 1.5 100 0

Table. 2. Mycelial growths of Lentinula edodes, Poongnyunko in sawdust media containing various supplements.

Period (day)

Supplements

Rice bran Rice bran

Calcium Wheat bran Wheat bran

Calcium Barley flour Barley flour Calcium

Bean curd refuse

Bean curd refuse Calcium

Red ginseng refuse

Red ginseng refuse Calcium 5 9.8±0.9 6.0±0.8 9.87±1.5 7.3±0.9 13.8±2.0 7.5±0.8 13.18±1.4 3.6±1.2 9.91±0.7 6.1±1.0 10 27.2±1.0 18.7±1.6 26.63±2.0 19.1±2.0 34.55±1.8 21.7±2.2 33.3±2.6 14.3±1.5 26.2±2.1 17±1.4 15 44.2±2.8 34.7±2.1 46.25±2.4 36±1.4 57.28±3.3 39.1±2.4 56.45±3.0 28.2±2.3 45.62±3.1 31.7±2.9 20 62.5±4.0 51.2±2.6 65.35±3.6 53.5±1.0 81.36±4.0 59.3±4.0 66.1±3.2 41.1±2.3 64.77±4.8 45.3±4.2 25 78.6±4.7 71.0±4.3 85.16±6.3 72.8±0.8 105.08±5.4 82.1±4.6 102.6±3.5 60.6±1.6 84.66±4.3 62.0±3.5 30 97.0±4.7 90.3±5.3 105.58±6.4 91.5±1.3 127.38±8.4 104.6±4.9 126.0±3.9 80.8±0.6 106.0±4.1 78.3±4.0 35 111.8±5.6 107.0±6.6 120.4±4.3 108.1±2.2 140.6±9.0 124±5.0 141.4±4.4 90.5±1.8 121.3±4.9 91.8±4.9 40 128.4±6.3 124.0±4.7 136.9±1.0 126.5±2.2 141.2±8.4 139.8±6.0 141.4±4.3 115.4±3.1 138.8±4.8 107.5±5.2 45 139.9±4.1 139.0±1.7 142.8±0.5 139.5±2.2 142.5±2.6 142.9±5.5 141.4±2.5 134.2±3.6 144.9±4.7 122.7±6.3 Fig. 1. Weight loss in test tubes containing sawdust media of Lentinula edodes, Poongnyunko by culture periods.

Rb: Rice bran, Rb-C: Rice bran + Calcium, Wb: wheat bran, Wb-C: wheat bran + Calcium, Bf: Barley flour, Bf-C: Barley flour + Calcium, Bcr: Bean curd refuse, Bcr-C: Bean curd refuse + Calcium, Rgr: Red ginseng refuse, Rgr-C: Red ginseng refuse + Calcium

르트산이 2.992분으로 가장 먼저 검출되었고, 다음은 글 루탐산이 4.459분, 세린이 7.788분 순으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

필수아미노산 중 6종류인 이소류신, 류신, 라이신, 메티 오닌, 페닐알라닌, 트레오닌이 함유되어 있었고 어린이에 게 필수아미노산인 히스티딘이 함유되어 있었다. 총 아미 노산함량은 미강 배지에서 140.8±18.2 mg/g, 미강+칼슘 배지에서 132.5±6.9 mg/g, 보리 배지에서 174.4±11.0 mg/g 보리+칼슘 배지에서 137.8±14.8 mg/g, 콩비지에서 150.4±9.2 mg/g 콩비지+칼슘배지에서 145.0±4.4 mg/g, 홍삼박 배지에서 169.4±11.7 mg/g 홍삼박 배지에서

209.7±8.5 mg/g이었다. 홍삼박+칼슘 배지에서 209.7±8.8 mg/g으로 가장 많았고, 보리+칼슘 배지에서 137.8±14.8 mg/g으로 가장 적었다. 글루탐산이 전반적으로 가장 많았 고 보리배지에서 51.3 mg/g으로 나타났다. 이는 두 번째 로 높은 함량을 보이는 아스파르트산(16.5 mg/g)보다 32% 많은 양이고 가장 적은 히스티딘(1.2 mg/g)보다는 약 377%가 많은 양이다. 아미노산은 단백질의 구성성분 으로서 본 실험에서 가장 많은 함량을 보인 글루탐산은 해독작용, 뇌 진정효과 및 당과 지질대사에 관여하고 (Hong et al, 1989) 아스파라틱산은 체내의 중금속 제거 에 효과가 있으며 식품의 감칠맛 성분으로 천연조미료의

Fig. 2. Amino acid contents in the fruit bodies of Lentinula edodes, Poongnyunko cultivated on sawdust medium with various

Histidine, Iso: Isoleucine, Leu: Leucine, Lys: Lysine, Met: Methionine, Phe: Phenylalanine, pro: proline, Ser: Serine, Thre:

Threonine, Tyr: Tyrosine, Val: Valine.

Fig. 3. HPLC chromatograms showing amino acids analysis of extract from Lentinula edodes mushroom

역할을 한다. 류이신은 골다공증 예방, 치료 및 피로회복에 효과가 뛰어나며 알기닌은 필수아미노산 중 하나로 면역 력 향상에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Eghianruwa et al, 2011). 잣버섯의 경우 아미노산 함량이 100 g당 685.6±13.6 mg이었고(Jung et al, 2013) 목이에서 100 g 당 최대 2,222 g 이었다(Kim et al, 2012). 갈색계열의 팽 이버섯은 성분의 함량이 품종 및 저장기간에 따라 증감의 변화가 백색계통보다 심하였다(Jhune et al, 2012).

버섯 발생온도별 함량 차이

발생온도를 3가지 조건으로 하여 수확한 표고 자실체에 대한 아미노산의 성분을 분석한 결과 Fig. 4와 같은 결과 를 얻었다.

총 아미노산 함량은 저온에서 32.5%, 중온에서 38.2%, 고온에서 29.3%로 중온발생의 함량이 가장 많았다. 이는 베타글루칸의 온도별 함량에서의 저온> 중온> 고온의 순 으로 많았던 연구결과(Park et al, 2016)와 차이가 있었다.

모든 온도에서 글루탐산 함량이 가장 높았고, 각 온도별 로 아미노산 성분의 함량은 조금씩 차이를 보였다. 저온 (13-15^oC)의 발생에서 글루탐산 33.5±1.8 mg/g, 아스파르트 산 15.6±0.8 mg/g, 라이신 12.9±1.6 mg/g, 류신 12.7±0.8 mg/g, 아르기닌 12.0±0.6 mg/g, 알라닌 10.9±0.7 mg/g, 발린 9.3±0.6 mg/g, 세린 9.2±0.5 mg/g, 트레오닌 9.1±0.4 mg/g, 이소류이신 7.7±0.5 mg/g, 글리아신 7.6±0.5 mg/g, 히스티딘 3.1±0.3 mg/g, 프롤라인 7.8±0.5 mg/g, 페닐알 라닌 7.0±0.5 mg/g, 티로신4.3±0.3 mg/g, GABA 2.9±0.1 mg/g, 메티오닌 2.2±0.2 mg/g 순의 함량이었다. 중온(18- 20^oC) 발생에서 글루탐산 41.3±1.5 mg/g, 아스파르트산 18.8±0.5 mg/g, 라이신 13.5±0.6 mg/g, 류신 14.9±0.6 mg/g, 아르기닌 16.0±0.9 mg/g, 알라닌 12.3±0.4 mg/g,

발린 10.7±0.4 mg/g, 세린 10.9±0.3 mg/g, 트레오닌 10.2±0.3 mg/g, 글리아신 9.1±0.4 mg/g, 페닐알라닌 9.0±0.4 mg/g, 이소류이신 8.8±0.3 mg/g, 프롤라인 8.7±0.01 mg/g, 티로신 5.0±0.08 mg/g, GABA 4.0±0.2 mg/g, 히스 티딘 3.4±0.1 mg/g, 메티오닌 2.7±0.08 mg/g으로 아미노 산 17종 모두 저온조건보다 함량이 높았다. 그러나 고온 (24-26^oC) 조건에서는 글루탐산 31.5±2.9 mg/g, 아스파르 트산 15.6±1.3 mg/g, 류신 11.7±1.1 mg/g, 아르기닌 11.6±0.8 mg/g, 알라닌 11.3±1.0 mg/g, 세린 9.2±0.8 mg/g, 트레오 닌 8.3±0.7 mg/g, 발린 8.2±0.8 mg/g, 글리아신 7.8±0.6 mg/g, 프롤라인 7.3±0.5 mg/g, 페닐알라닌 7.2±0.6 mg/g, 라이신 7.5±1.4 mg/g, 이소류이신 6.8±0.7 mg/g, 히스티 딘 2.3±2.1 mg/g, 티로신 4.1±0.4 mg/g, GABA 2.3±0.1 mg/g, 메티오닌 2.0±0.02 mg/g으로 일정한 경향을 보이 지 않았다. 위의 결과는 표고 톱밥재배에서 생산 목적에 따라 응용할 수 있는 기초자료로 활용할 수 있다고 사료 된다.

적 요

본 실험은 표고 톱밥재배에서 배지 부영양원 종류와 버 섯발생 온도에 따라 버섯의 아미노산 함량 변화를 분석하 였다. 배지는 톱밥과 부영양원(미강, 보리, 콩비지, 홍삼박) 의 비율이 8:2에 칼슘 0.5% 첨가와 미첨가 등 8처리구로 하였다. 버섯의 발생온도는 저온(13~15^oC), 중온(18~20^oC), 고온(24~26^oC)으로 처리하였다. 아미노산은 모든 처리구 에 17종이 검출되었고 영양원 종류에 따라 성분차이들이 나타났다. 총아미노산 함량은 홍삼박 배지에서 209.7 mg/g 으로 가장 높았고, 가장 많이 검출된 아미노산은 글루탐 산이었고 보리배지에 51.3 mg/g 이었다. 버섯발생 온도처

Fig. 4. Amino acid contents in the fruit bodies of Lentinula edodes, "Poongnyunko" according to different additives based on

리 조건에서 총아미노산 함량은 중온에서 38.2%, 저온에 서 32.5%, 고온에서 29.3% 순으로 나타났고, 중온과 저 온 조건에서 아미노산 함량 순위는 비슷한 경향을 나타냈 다. 본 연구 결과는 표고의 맛과 기능성을 갖는 아미노산 의 종류를 제시하는 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

감사의글

본 연구는 농림수산식품기술기획평가원(IPET) GSP원 예종자사업단 Golden Seed Project의 지원으로 수행된 - 품종보호 수입대체용 표고 신품종 개발과 시험포 운영- (213007-05-1-SBH 10)에 의해 이루어진 것으로 연구비 지원에 감사드립니다.

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