Effects of Astragali Radix (AR) on Chronic Renal Injury in Rats

․교신저자: 김용성 전남 목포시 상동 834번지 동신대학교 한의과대학 내과학교실 TEL: 061-280-7700 FAX: 061-330-7788 E-mail: [email protected]

황기가 흰쥐의 만성 신손상에 미치는 영향

이권호, 한양희, 김용성 동신대학교 한의과대학 신계내과학교실

Effects of Astragali Radix (AR) on Chronic Renal Injury in Rats

Kwun-ho Lee, Yang-hee Han, Young-seung Kim

Dept. of Internal Medicine. College of Oriental Medicine, Dong-Shin University ABSTRACT

Objective :

This study was designed to investigate the possibility of AR for chronic renal injury.

Methods :

The author first investigated the expression levels of DNA by inducing of chronic renal injury. Then, the author investigated the effects of AR on chronic renal injury induced by combination treatment with Adriamycin and cisplatin in terms of changes in body weights and renal tissues, urine volume, BUN and creatinine levels, creatinine clearance and histopathological changes in renal tissues. Total expression levels of 546 genes were elevated or lowered by induction of chronic renal injury. Genes of which whose expression levels were elevated by induction of chronic renal injury were related to the PPAR signaling pathway and fatty acid mechanism, etc. Genes of which expression levels were lowered by induction of chronic renal injury were related to the neuroactive ligand-receptor signaling pathway.

Results :

Oral administration of AR restored renal mass which was reduced by induction of chronic renal injury. AR also restored creatinine clearance and lowered serum BUN level. In histopathological observation, the AR group has a tendency to prevent tissue damages as shown in the chronic renal injury group.

Conclusions :

AR can be used to treat patients with chronic renal injury although further study will be needed to elucidate the exact mechanisms in the efficacy of AR on chronic renal injury.

Key words : Chronic renal injury, Astragali Radix (AR), Creatinie, Creatinine cleareance

Ⅰ. 서 론

만성 신손상(chronic renal injury)은 여러 가지 원인에 의해 신원(nephron)의 수와 기능이 지속적 으로 소멸되어 말기 신부전(end-stage renal failure, ESRF)으로 이행되는 질환으로, 치명적인 요독증 을 방지하기 위하여 신대체요법(투석요법 및 신장 이식)에 의존해야 하는 임상상태 또는 임상증상을

말한다

.

만성 신손상을 동양의학에서는 浮腫, 關格, 虛勞,

六極, 腎風, 虛損 등의 범주에 속하는 병증으로 보

고 辨證治療 하고 있다

. 동물실험 보고에 의하면

大黃, 芍藥, 麻黃, 黃蓮 등은 BUN 저하작용이 있

으며 人蔘은 신기능 항진작용이 있다고 보고되고

있다

. 이

, 최

등의 연구에서 만성 신부전에 六味

地黃湯加人蔘黃芪을 사용해 유효한 효과를 거둔

보고가 있으며 안

, 이

등 六味地黃湯이 신기능에

미치는 영향에 대한 연구들이 있다. 黃芪에 대한

연구로 전

의 백혈병에 황기를 사용한 연구가 있

고, 한

의 항암제로 인한 백혈구 감소증에 사용하

여 유효한 효과를 거둔 예가 있으나, 만성 虛症 증 상이 나타나는 만성 신손상에 補氣藥인 黃芪를 이 용한 연구는 부족한 실정이다

.

아드리아마이신(adriamycin, ADR) 신병증 흰쥐 는 단백뇨와 신기능의 관계를 연구하는데 많이 사 용되어온 모델로서 ADR 투여 2주 후부터 사구체 여과율의 감소가 관찰된다

. 또한 신부전을 일으 키는 약물 중 하나인 시스플라틴(cisplatin, Cis-P)은 난소암 등 다양한 종양의 치료에 효과를 나타내는 항암제지만 신장 독성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이러한 신장 독성을 이용하여 신부전 모델 로 사용되고 있다

.

본 연구에서는 신장독성을 유발한다고 알려져 있는 ADR과 Cis-P의 복합투여를 통하여 흰쥐에 경미한 만성 신손상을 유발하고 黃芪 추출물(AR) 을 투여한 후, 흰쥐로부터 혈액과 뇨를 얻어 BUN, creatinine 함량을 측정하고 creatinine 제거율을 계 산하며 체중 및 신장 무게 측정과 신장 조직을 현 미경적으로 관찰함과 동시에 microarray 기법을 통 하여 만성 신손상 유발에 의한 유전자 변화를 관찰 한 결과, 유의한 변화가 관찰되어 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재 료 1) 동 물

6 주령된 수컷 Wistar 흰쥐를 샘타코 (서울, 한 국)에서 구입하여, 일주일간 실험실환경에 적응시 킨 후 온도와 습도가 조절되는 환경 (24 ± 3℃, 12-hr light-dark cycle) 에서 고형사료와 물을 마음 껏 섭취하게 하며 실험에 사용하였다.

2) 약재의 준비

본 실험에 사용된 약재인 黃芪 (AR, Astragali Radix )는 콩과에 속한 다년생 초목인 黃芪 ( Astragalus membranaceus Bunge)의 周皮를 거의 벗긴 根으로 동신대학교 목포 한방병원을 통하여 구입하여 사 용하였다.

3) 시약 및 기기

만성 신손상 유발을 위하여 Sigma (St. Louis, USA)로부터 아드리아마이신(ADR, Adriamycin, doxorubicin hydrochloride, D1515, Sigma)과 시스 플라틴(Cisplatin, cis-platinum(Ⅱ)diammine dichloride, P4394, Sigma)을 구입하여 사용하였다. 전해질 분 석을 위하여 easy Electrolyte (Medica, USA), Optical Density (OD) 값의 측정을 위하여 spectrophotometer (Hitachi, Japan)을 사용하였고, 신장 조직의 조직병 리학적 소견 관찰을 위하여 광학 현미경(Olympus, Japan)을 사용하였다.

2. 방 법

1) 약물의 준비

세척된 상태로 구입된 黃芪 200 g을 증류수 1,500 ml과 함께 전기약탕기(대웅, 한국)를 이용하 여 3시간 동안 전탕하여 한 후, 거즈로 걸러 전탕 액을 얻었다. 얻어진 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다 음, 加溫減壓乾燥法으로 70 ℃를 유지하면서 건조 분말을 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 추출물은 35.5 g이었다.

2) 만성 신손상 유발

실험실 환경에 1주일 이상 적응된 흰쥐에 Cis-P 과 ADR을 병용 투여함으로써 만성 신손상을 유발

하였다

. 먼저 실험 첫날 (day 1), Cis-P를 2.5

㎎/㎏ 용량으로 복강투여 하였고, 1주일 후 (day 8)에 동일한 용량으로 복강투여를 재차 시행하였 다. 2회에 걸친 Cis-P의 복강투여가 끝난 1주일 후 (day 15), ADR을 5 ㎎/㎏ 용량으로 흰쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주사 하였다. Cis-p와 ADR의 투여 2주 후, 만성 신손상이 적절히 유발되었음을 확인 하고 약물을 투여하였다.

黃芪 추출물의 구강 투여를 위하여 일반 고형사

료에 黃芪 추출물을 1 g/kg 분량으로 섞어 黃芪 식

이를 제작하여 동물로 하여금 자유로이 섭취케 하였

으며, 약물이 함유된 사료의 투여기간은 총 2주였다.

3) 실험군 선정

실험군은 정상군, 만성 신손상 대조군, 약물 투여 군으로 분류하였으며 자세한 내용은 아래와 같다.

(1) 정상군(Normal group) : 만성 신손상을 유 발하지 않고 일반 사료를 투여한 군 (n=8).

(2) 만성 신손상 대조군(Control(CTL) group) : 만성 신손상을 유발시키고, 일반 사료를 투여한 군 (n=8).

(3) 黃芪 투여군 ( Astragali Radix (AR) group) : 만성 신손상을 유발시키고 黃芪 추출물을 함유 한 사료를 투여한 군 (n=8).

4) 체중 및 신장 무게 측정

실험 첫날, 전자저울 (Tanita, Japan)을 이용하 여 체중을 측정하여 기준으로 삼고, 이후 실험 21 일째 및 실험 마지막 날 동일한 조건에서 체중을 측정하였다. 실험 마지막 날, 체중 측정이 끝난 후 생쥐를 희생시켜 복강으로부터 우측 신장을 적출 하였다. 편측 신장의 무게는 미량 저울을 이용하여 측정하였다.

5) 검체의 채취 및 처리

실험 종료 2일 전 (day 40), metabolic cage (진 텍, 한국)를 이용하여 24시간 뇨를 채취하였다. 실 험 39일째 날 저녁 6시에 metabolic cage 안에 흰쥐 를 1마리씩 넣은 다음, 사료와 음용수를 마음껏 섭 취하게 한 상태에서 뇨를 채취하여 뇨량을 측정한 다음, 5,000 g에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 분석에 사용하였다.

실험 마지막 날, 흰쥐를 에테르로 가볍게 마취시 키고 심장천자법으로 혈액을 얻었다. 얻어진 혈액 은 5,000 g에서 15분간 원심분리하여 상청액을 취 함으로써 혈청(serum)을 얻었다.

6) RNA 분리

Microarray 분석을 위한 RNA 분리는 Florell 등

20

의 방법을 변형하여 시행했다. 2주간의 약물 투여 가 끝난 후, 흰쥐를 희생시키고 좌우측의 신장을 적출하여 좌측은 microarray 분석을 위한 RNA 분 리에 사용하였고, 우측은 현미경적 관찰을 위해 사

용하였다. 적출된 편측 신장 조직은 피막을 벗겨낸 후에 인산완충액으로 수세하고 그 중, 피질과 수질 의 구분 없이 1/4을 취하여 각 군별로 따로 모은 다음, 소량의 인산완충액과 함께 급속 냉동했다.

냉동된 조직으로부터 total RNA의 분리는 Qiagen 에서 제시한 절차에 따라 진행 되었다.

7) RNA 추출 정도 관리

Total RNA를 아가로스겔 상에서 전기영동한 후 28S/18S RNA의 비율을 측정하여 정도 관리하여 분석 적합 판정을 확인한 후 실험을 진행하였다.

Microarray 실험에 있어서 결과에 영향을 주는 여 러 가지 factor들 중 가장 중요한 것이 RNA이며

, 이 RNA 상태를 확인하기 위해 Agilent사의 Bioanalyzer2100을 사용하여 rRNA ratio (28S/18S ribosomal RNA)를 확인함으로써 판정하였다.

8) DNA 칩을 이용한 실험

45K oligo-chip

을 이용하여 실험을 수행하였다.

탐침 준비와 혼성화 반응은 3DNA array detection system을 이용하여 수행하였다 (Genisphere, PA).

형광 표지된 cDNA 제작시 20 ug total RNA를 사 용하였다. Array를 씻어낸 후 ScanArray scanner (Perkin-Elmer, Boston, MA)로 스캔하였다. 정상 RNA를 reference로 사용하여 DNA 칩상의 대다수 cDNA spots (85% 이상)이 검출됨을 확인하였다.

9) Data 분석

이미지파일에서 IMAGENE 4.0 (Bio-discovery, Marina del Rey, CA)를 사용하여 1차 데이터를 얻 은 후 lowess method

를 사용하여 표준화하였다.

모든 칩상의 spot에서, 각 채널의 형광 강도가 배

경의 형광 강도보다 1.4배 더 큰 경우에 한해 제대

로 측정된 것으로 판단하여 선별하였고, 시료에서

제대로 측정되지 않은 것은 제외시켰다. 발현 비율

은 CLUSTER를 이용하여 순차적 클러스터링한

후 TREEVIEW (M.B. Eisen, http://rabam.lbl.gov)

를 이용하여 시각화하였다. 유전자 기능분석은

FatiGo algorithms (Http://.babelomics.bioinfo.cipf.es)

를 이용하여 수행하였다. 클래스간 비교분석을 통

해 얻어진 결과는 False Discovery Rate (FDR) 값이 0.05 이하일 때 의미있는 것으로 판단하였다.

단백질 결합은 BOND 데이터베이스 (http://bond.

unleashedinformatics.com)에서 얻어진 인간단백질 데이터베이스로 cytoscape program (버전 2.4)을 이용하여 분석하였다.

10) BUN, creatinine 함량 측정

2주간의 약물 투여가 끝난 후, 흰쥐로부터 얻어 진 혈청에서 BUN 및 creatinine 함량 측정은 전용 Kit (아산제약, 한국)를 이용하였다.

11) creatinine 제거율 계산

흰쥐의 혈청으로 부터 creatinine의 함량을 측정하 고, 24시간 뇨의 양을 측정하여, 이로부터 creatinine 제거율을 계산 하였다. 계산 공식은 다음과 같다.

creatinine clearance (ℓ/day/㎏)

= U

× V / S

× 1000

U

: urine 중 creatinine 함량 (㎎/㎗) V : 24시간 urine volume (㎖)

S

: serum 중 creatinine 함량 (㎎/㎗) 12) 신장 조직의 현미경적 관찰

2주간의 약물 투여가 끝난 후, 흰쥐를 희생시키 고 편측 신장조직을 적출하였다. 적출된 신장조직 은 질긴 피막을 벗겨 내고 4등분 하여 10% 포르말 린에 3일 동안 담가둔 후, xylen을 이용하여 탈수 시켰다. 탈수된 조직으로 파라핀 블록을 만들고, 다시 박절하여 슬라이드 글라스에 부착 시키고 hematoxylin 과 eosin으로 염색 한 후 광학 현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다(x200).

3. 통계 처리

실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot (Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차 (mean±S.D.)로 나타내었으며, 발현 증가 및 감소 된 유전자 간의 유의성 검증에는 Chi-square test 를 사용하여 p값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였으며, 실험군 간 평균의 차이

를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p값 이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판 정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 신장 무게에 미치는 영향

정상군에 비하여 대조군에서 유의한 수준 (P<0.05)의 신장 무게 감소가 관찰 되었다. 정상군 은 1.11±0.08 g, 대조군은 0.89±0.09 g, 黃芪 투여군 은 1.12±0.08 g 이었다(Fig. 1). 黃芪 투여군에서는 대조군에 비하여 신장 무게 감소를 유의성(P<0.05) 있게 억제하였다.

Fig. 1. Effects of AR on changes in renal mass.

Renal mass was measured at the end of experiment (day 42) using microbalance. Normal group : naive group, CTL group : chronic renal injury induced group, AR group : AR treated chronic renal injury group. Values are represented as mean±S.D.

#P < 0.05 compared to Normal.

*P < 0.05 compared to CTL (n=8).

2. 만성 신손상 유발에 의하여 발현이 증가된 유전 자들과 관련된 기전 분석

신장 조직에서 RNA를 추출하여 변화된 유전자

를 살펴본 결과, 정상 대조군에 비하여 총 546개의

유전자가 만성 신손상 유발에 의하여 발현이 변화

되었다. 이 중, 발현이 증가한 유전자가 어떤 기전

에 주로 관여하는지 분석한 결과, PPAR signalling

pathway, Fatty acid metabolism, Glycine serine

and treonine metabolism 등에 주로 관여하는 것으

로 나타났다(Fig. 2).

Fig. 2. Pathway analysis on up-regulated DNA by chronic renal injury induction using combination treatment with adriamycin and cisplatin.

3. PPAR signalling pathway 관련 유전자 분석

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) signalling pathway에 관여하는 유전자들 중에서 어떤 유전자가 발현이 증가되었는지 더욱 세밀하 게 관찰한 결과, 지방산의 산화와 관련 있는 CYP4A1, CPT-1, ACO, MCAD 유전자 위주로 발 현이 증가되었다(Fig. 3).

4. Fatty acid metabolism 관련 유전자 분석 Fatty acid metabolism에 관여하는 유전자들 중 에서 어떤 유전자가 발현이 증가되었는지 더욱 세 밀하게 관찰한 결과, 지방산의 대사 또는 산화와 관련 있는 2.3.1.16, 1.3.3.6, 1.3.99.3 등의 유전자 위 주로 발현이 증가되었다(Fig. 4).

5. Glycine serine and treonine metabolism 관련 유전자 분석

Glycine serine and treonine metabolism에 관여 하는 유전자들 중에서 어떤 유전자가 발현이 증가 되었는지 더욱 세밀하게 관찰한 결과, 2.6.1.44, 1.4.3.3, 1.1.1.95, 1.1.99.1, 2.1.1.5, 1.5.99.2, 2.1.1.20등의 유전자 위주로 발현이 증가되었다(Fig. 5).

Fig. 3. DNA profile analysis related in PPAR signalling pathway.

Fig. 4. DNA profile analysis related in Fatty acid metabolism.

Fig. 5. DNA profile analysis related in Glycine, serine and treonine metabolism

6. 만성 신손상 유발에 의하여 발현이 감소된 유전 자들과 관련된 기전 분석

만성 신손상 유발에 의하여 변화된 546개의 유 전자 중, 발현이 감소한 유전자가 어떤 기전에 주 로 관여하는지 분석한 결과, neuroactive ligand- receptor interaction, wnt signalling pathway 등과 관련된 유전자의 발현이 주로 감소한 것으로 나타 났다(Fig. 6).

7. Neuroactive ligand-receptor interaction 관련 유 전자 분석

Neuroactive ligand-receptor interaction에 관여하 는 유전자들 중에서 어떤 유전자가 발현이 감소되 었는지 더욱 세밀하게 관찰한 결과, 2.6.1.44, 1.4.3.3, 1.1.1.95, 1.1.99.1, 2.1.1.5, 1.5.99.2, 2.1.1.20등의 유전

자 위주로 발현이 감소되었다(Fig. 7). Fig. 6. Pathway analysis on down-regulated DNA by chronic renal injury induction using combination treatment with adriamycin and cisplatin.

Fig. 7. DNA profile analysis related in neuroactive ligand-receptor interaction.

8. 혈청 내 BUN 함량에 미치는 영향

만성 신손상이 유발된 생쥐의 혈청에서 blood urea nitrogen (BUN) 함량 변화를 관찰한 결과, 대 조군에서 정상군에 비하여 유의한 증가(P<0.05)가 관찰되었다. 이러한 증가는 黃芪 투여군은 대조군 에 비하여 유의하게 억제(P<0.05)되었다. 이때, 정 상군은 11.16±1.98 ㎎/㎗, 대조군은 18.70±1.14 ㎎/

㎗, 黃芪 투여군은 12.40±7.20 ㎎/㎗이었다(Fig. 8)

Fig. 8. Effects of AR on serum BUN levels in chronic renal injury induced rats.

BUN levels in serum were measured using spectrophotometry. Normal group : naive group, CTL group : chronic renal injury induced group, AR group : AR treated chronic renal injury group. Values are represented as mean±S.D.

#P < 0.05 compared to Normal

*P < 0.05 compared to CTL (n=8).

9. 혈청 내 creatinine 함량에 미치는 영향

만성 신손상이 유발된 생쥐의 혈청 중에서 creatinine 함량 변화를 관찰한 결과, 대조군에서 정상군에 비하여 유의한 증가(P<0.05)가 관찰되었 다. 이러한 증가는 黃芪 투여군에서 감소하는 경향 을 보였으나 유의성은 없었다(Fig. 9).

10. creatinine 제거율에 미치는 영향

대조군에서 정상군과 비교하여 유의한 creatinine 제거율의 감소(P<0.05)가 관찰되었고, 黃芪 투여군 에서는 이러한 제거율 감소가 효과적으로 억제 (P<0.05)되었다. 이때, 정상군은 45.3±1.4 ℓ/day/

㎏, 대조군은 29.1±6.2 ℓ/day/㎏, 黃芪 투여군은 43.5±8.3 ℓ/day/㎏ 이었다(Fig. 10).

Fig. 9. Effects of AR on serum creatinine levels in chronic renal injury induced rats.

creatinine levels in serum were measured using spectrophotometry. Normal group : naive group, CTL group: chronic renal injury induced group, AR group : AR treated chronic renal injury group. Values are represented as mean±S.D.

#P < 0.05 compared to Normal.

Fig. 10. Effects of AR on creatinine clearance in chronic renal injury induced rats.

creatinine clearance was calculated by creatinine levels in serum and urine, urine volume and body weight. Normal group : naive group, CTL group : chronic renal injuryinduced group, AR group : AR treated chronic renal injury group. Values are represented as mean±S.D.

#P < 0.05 compared to Normal, *P < 0.05 compared to CTL (n=8).

11. 신장 조직의 조직병리학적 소견에 미치는 영향

정상군에서는 특별한 조직병리학적 이상 소견을 발견할 수 없었다(Fig. 11A). 대조군에서 사구체 변연 부분이 거칠게 보이는 등의 신조직 손상 소 견이 관찰 되었으나, 그 차이는 미미하였다(Fig.

11B). 黃芪 투여군의 신장 소견은 대조군에서 보이 던 신조직 손상 소견이 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 11C).

Fig. 11. Effects of AR on histopathological changes of renal tissue in chronic renal injury induced rats.

Renal tissues were obtained on day 42, then were imbedded in paraffin. The tissues were stained with hematoxylin and eosin. Sections were examined under the optical microscope at the magnifications of 200 as shown in materials and methods. (A) Normal (naive) group, (B) chronic renal injury group, (C) AR treated chronic renal injury group.

indicates the site of tissue damage.

Ⅳ. 고 찰

만성 신손상(chronic renal injury)이란 장기간에 걸쳐 계속적인 콩팥단위질량(nephron mass)의 감 소로 인하여 사구체여과율이 비가역적으로 감소한 상태를 말한다. 신장 이식이나 투석을 받지 않으면 생명을 유지할 수 없는 상태의 만성 신손상을 말 기 신부전(end stage renal disease; ESRD)이라 한 다. 만성 신손상은 ① 혈청 creatinine 상승 ② 혈중 요소질소(BUN)수치 상승 ③ 사구체 여과율 저하

④ 요검사(요비중의 저하, 단백뇨, 혈뇨, 농뇨, 원 주뇨) ⑤ 혈액학적 검사(빈혈, 백혈구감소, 간혹 혈소판 감소) ⑥ 혈청전해질 검사(저나트륨 혈증, 고칼륨 혈증, 저칼슘 혈증, 고인혈증, 대사성 산증)

⑦ 골의 방사선 검사 또는 골 스캔(신성골 이영양 증) ⑧ 신장초음파검사(양쪽 신장의 크기가 현저 히 위축) ⑨ 흉부방사선 검사 및 심전도(심부전, 심낭염, 허혈성 질환) 검사를 통해서 진단할 수 있 는데 그중 사구체여과율이 가장 중요한 임상지표 이다

.

대부분의 환자들은 콩팥단위의 약 80%이상이 소실되거나 사구체 여과율이 약 25㎖/min 이하로 감소될 때까지는 증상이 없다. 사구체여과율이 30

㎖/mim 이하면 전해질 이상이 나타나 대사성 산 증이 나타나며, 사구체여과율이 5㎖/min 이하면 고 칼륨혈증이 나타난다. 그밖에도 조혈계 이상으로 허혈성심장병, 고혈압, 신성골이형성장애, 신경계․

피부․내분비이상 등으로 인한 전신증상이 나타날 수 있다. 증상은 다양하여 가려움, 전신쇠약증, 기 억력 감퇴, 피곤등이 나타난다

.

동양의학에서는 만성 신손상을 浮腫, 關格, 虛勞, 六極, 腎風, 虛損 등의 범주에 속하는 병증으로 보 고 辨證治療 하고 있다

. 만성 신손상은 전신쇠약, 기억력 감퇴, 피곤 등의 증상이 많아 虛症으로 辨 證되는 경우가 많다.

黃芪는 補氣藥類 중 하나로 生用하면 補氣固表

하여 止汗하는 작용이 있고 溫運陽氣하여 利水消

腫하는 효능이 있으며 正氣를 고무시켜 托毒生肌

한다. 炙用하면 補脾益氣하여 陽氣를 升擧시키고

補氣하면서도 生血하는 효능이 있다

. 비뇨기에도

작용하여 氣虛로 인해 발생한 尿血, 沙淋, 白濁, 소

아의 尿閉등을 치료 한다

. 이

의 논문은 만성신부

전 환자 5례에 대하여 六味地黃湯加氣虛藥類로 辨

證治療하여 전반적인 증상 경감 및 creatinine 수치

의 호전을 볼 수 있었는데 5례 중 3례에 黃芪를 투

여했다. 최

의 논문에 의하면 六味地黃湯加人蔘黃

芪를 Cis-P으로 신장손상을 유발한 흰쥐에 투여한

결과, creatinine, BUN 수치가 유의하게 감소되었 고, 신장 피질 조직 내 microsome의 Na-K-ATPase 활성이 증가되었다는 보고가 있었다. 만성 신손상 은 虛症 증상을 동반하는데 六味地黃湯加人蔘黃芪 이 만성 신손상에 유의한 결과가 있었지만 인삼에 대한 연구

는 있으나 黃芪에 대한 연구가 부족하여 黃芪를 만성 신손상을 유발한 rat에 사용하게 되었다.

ADR 신병증 흰쥐는 단백뇨와 신기능의 관계를 연구하는데 많이 사용되어온 모델로서, ADR 투여 후 1～2주부터 심한 단백뇨를 보이고, 단백뇨가 정 점에 달한 후부터 사구체 여과율의 감소와 같은 신부전의 증상이 나타난다. 단백뇨 출현은 사구체 내장 상피세포 손상과 연관이 있고, 이후 발생하는 사구체 여과율 감소는 광범위한 신세관 간질 손상 과 관련이 있다고 알려져 있다

.

신부전을 일으키는 약물 중 하나인 Cis-P는 난 소암등 다양한 종양의 치료에 효과를 나타내는 항 암제이나 몇몇 증거에 의해 반응성 산소기의 발생 으로 인한 신장 독성을 나타내는 것으로 밝혀지고

있다

. 반응성 산소기가 직접 작용하여 신장독성

을 일으키거나 또는 지질의 과산화를 통해서 세포 막 투과성을 증가시킴으로써 세포 사망을 일으켜 신증후군과 급성 사구체 신염 등을 일으키는 신장 손상의 원인 물질로 보고되고 있다

.

본 연구에서는 ADR과 Cis-P를 복합 투여하는 방식으로 만성 신손상을 유발하였다

. 만성 신손 상이 유발된 흰쥐의 신장 조직으로부터 total RNA 를 얻어 발현이 증가 또는 감소된 유전자에 대한 조 사를 행한 결과, 총 546개 유전자의 발현율이 변화 되었다. 이 중, 발현이 증가한 유전자는 peroxisome proliferator-activated receptors(PPAR) signalling pathway, fatty acid metabolism, glycine serine and treonine metabolism 등에 주로 관여하는 것으로 나타났다(Fig. 2).

Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs) signalling pathway는 전사인자 조절을 통하여 유 전자 발현을 조절한다. 주로 세포의 분화와 성장,

그리고 대사에 관여하는데 특히 지질이나 단백질 의 대사에 주로 관여한다

.

Fatty acid는 많은 생체 기관에서 에너지원으로 사용하고 있는 물질이며, 많은 기관에서 에너지 저 장형태로서 지방의 형태를 취한다

. 일반적으로 fatty acid metabolism에서 주요한 작용은 산화 (oxidation)이다

. 이러한 작용이 일어나는 과정을 지질과산화(lipid peroxidation) 과정이라고 하며, 지질과산화(lipid peroxidation) 과정 중에 발생하 는 유리라디칼은 세포를 손상시킬 수 있다

.

상기한 두 경로 분석을 통해서 만성 신손상이 유발된 신장 내에서 지질과산화가 일어나고, 이것 이 산화적 스트레스를 유발하여 신장 조직이 손상 될 수 있음을 짐작할 수 있다.

만성 신손상 유발에 의하여 변화된 546개의 유 전자 중, 발현이 감소한 유전자가 어떤 기전에 주 로 관여하는지 분석한 결과, 주로 neuroactive ligand-receptor interaction과 관련된 유전자의 발현 이 감소한 것으로 나타났다(Fig. 6).

Neuroactive ligand-receptor interaction pathway 는 생체 내에서 아세틸콜린, 도파민 등의 신경전달 물질을 포함한 각종 전달 물질이 신호를 주고받는 체계이다

. 이러한 결과는 neuroactive ligand- receptor interaction pathway이 만성 신손상 유발 에 따른 신장 기능의 감소와 연관이 있을 것으로 추정된다.

본 연구의 결과 중에 언급된 유전자들과 이 유 전자에 의해서 발현되는 단백질들은 추후 ADR 및 Cis-P를 이용한 만성 신손상 모델 연구에 중요한 요소가 될 것으로 생각된다.

만성 신손상 환자에 있어서, 비가역적이며 점진 적으로 신원이 감소한다. 신조직의 감소는, 초기에 는 남아 있는 신원의 구조적이고 기능적인 비대를 일으키나, 신장 손상이 진행되면 신 실질의 체적이 감소한다

. 본 연구의 결과에서 만성 신손상 유발 에 의하여 신 실질 무게는 유의하게 감소하였다.

이러한 신 실질 무게의 감소는 대조군에 비해 黃芪

투여에 의하여 효과적으로 억제(P<0.05)되었다(Fig. 1).

혈액 내의 BUN과 creatinine은 신장 기능평가의 중요한 지표가 된다. 이들은 신장의 기능저하에 의 하여 혈중 농도가 상승하는 경향을 가지고 있다.

만성 신손상은 뇨량 감소를 동반하는 경우도 있고 그렇지 않은 경우도 있지만, 항상 BUN과 creatinine 농도의 증가와 관련된 증상과 증후를 가지고 있다

.

본 연구결과를 살펴보면, 만성 신손상 유발에 의 하여 혈중 BUN 및 creatinine 농도가 유의한 수준 으로 상승하였고 黃芪 투여가 혈중 BUN 상승을 효율적으로 억제함(P<0.05)을 관찰할 수 있었다 (Fig. 8). 이러한 결과로 미루어 黃芪가 신장 손상 방지 작용이 있다고 생각된다.

creatinine은 골격근 대사과정의 부산물이어서 혈장에 비교적 일정한 농도로 존재하므로 환자의 정맥에 따로 투여할 필요가 없기 때문에 신장 기 능의 평가에 다양하게 이용되고 있다

. creatinine 청소율은 임상적으로 사구체 여과율을 측정하는데 가장 널리 쓰이는 방법이다.

세群의 혈중 creatinine 함량과 뇨량, 체중 등을 감안하여 단위 체중(㎏)에 대한 creatinine 청소율 을 계산한 결과, 대조군에서 유의한 creatinine 청 소율의 감소가 관찰되었고, 이러한 청소율 감소가 黃芪 투여군에서는 효과적으로 억제(P<0.05)되었 다(Fig. 10). 이러한 결과로 미루어 黃芪가 사구체 여과 기능의 손상을 방지하는 기능이 있는 것으로 생각된다.

만성 신손상 환자에서 신장의 조직병리학적 소 견은 그다지 명확하지 않으나, 신원과 같은 신장 조직의 손상이 만성 신손상을 유발할 수 있으며, 이미 유발된 신장 기능의 저하가 점진적으로 신장 조직의 손상을 가져오기도 한다. 신장 손상의 초기 에는 신원의 감소와 이를 보상하기 위한 기능적인 신원의 비대가 동시에 관찰 된다

.

본 연구의 결과에서 대조군의 신장 조직은 정상 군의 조직에 비하여 사구체 변연이 명확하게 유지 되지 않는 등의 신장 조직 손상 소견을 보였으며,

黃芪 투여군에서는 이러한 조직 손상이 억제되는 경향을 보였다(Fig. 11).

이상의 결과들을 정리하면, ADR과 Cis-P의 복 합투여로 유발된 만성 신손상 흰쥐에서는 신 실질 무게 감소, 전반적 체중 감소, 혈중 BUN, creatinine 의 함량 상승, creatinine 청소율의 감소 등이 나타 났다. 이러한 반응을 일으키는 주요한 기전은 peroxisome proliferator-activated receptors(PPAR) signalling pathway로 인해 fatty acid metabolism이 항진되어 지질과산화를 일으켜 신장을 손상시키는 것으로 생각된다. 이러한 만성 신손상 모델에 黃芪 를 투여한 결과, 신 실질 무게 감소가 억제되고, 혈 중 BUN 수치가 감소하며, creatinine 제거율이 향 상되고, 조직병리학적 소견에서 신 세뇨관 손상을 회복시키는 경향을 보이는 것을 확인 할 수 있었다.

Ⅴ. 결 론

ADR과 Cis-P의 복합 투여로 유발된 만성 신손 상 흰쥐에 黃芪 추출물을 투여한 후, microarray 기법을 통한 유전자 변화, 신장 무게, 혈액과 뇨의 BUN, creatinine 함량, creatinine 제거율, 신장 조 직 등을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 만성 신손상 유발에 의하여 총 546개의 유전자 발현이 증가 또는 감소되었다.

2. 만성 신손상 유발에 의하여 발현이 증가된 유전자 는 주로 peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) signalling pathway, fatty acid metabolism, glycine serine and treonine metabolism 등과 관 련 있었다.

3. 만성 신손상 유발에 의하여 발현이 감소한 유전 자는 주로 neuroactive ligand-receptor interaction pathway와 관련 있었다.

4. 黃芪 추출물 투여는 만성 신손상에 의하여 감소

된 신 실질 무게를 유의한 수준(P<0.05)으로 회

복시켰다.

5. 黃芪 추출물 투여는 만성 신손상 유발에 의하여 상승된 혈중 BUN 수치를 유의한 수준(P<0.05) 으로 감소시켰다.

6. 黃芪 추출물 투여는 만성 신손상 유발에 의하여 감소된 creatinine 제거율을 유의한 수준(P<0.05) 으로 상승시켰다.

7. 黃芪 추출물 투여는 만성 신손상에 의하여 발생 한 신장 조직의 손상을 방지하는 경향을 보였다.

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