< 연구 결과요약 >
소 속 학교 이름시흥매화고등학교책 임 지 도 교 사 강O화 공 동 지 도 교사
연 O
흠 참 여 학생 이름 김O혁 , 정O 원, 임O균, 박O혁 , 정O 희과 제 명 자소엽 추출물을 이용한 활성산소피해 최소화 연구
연구목표
주변에서 흔히 구할 수 있는 항산화물질인 자소엽을 이용하여 활성산소에 의한 DNA 길이 손상과 더불어 카페인에 의한 DNA 손상을 막을 수 있는 항산화능 측정과 독성 ,항균성을 측정하여 실생활에 이용할 수 있을지 가능성을 연구하는 것이 목표이다.
연구개요 및 내용
1. 이론적 배경 및 선행연구
가. 에탄올 추출법을 이용한 자소엽 추출물 제작
자소엽이 가지고 있는 항산화 물질인phenolic compounds, rosmarinic acid, anthocyanin, caffeic acid, luteolin을 유기용매인 70% 에탄올을 이용해 추출해 내어 자소엽 추출물을 제작
나. 선행연구
1). 자소엽 추출물의 향장학적 활성 평가
자소엽 에탄올 추출물이 세포 독성이 없고 천연물 소재로서 항산화 활성과 항염활성에 효율적인 것으로 확인하였다.
2). 천연 색소 고정화 기술을 활용한 오미자와 자소엽 추출물 함유 음료의 항산화 활성 연구 오미자와 자소엽, 오미자+자소엽 추출물을 이용한 DPPH실험에서 자소엽 추출물에서 흡광도가 매우 낮게 변하였다. 또한 오미자와 자소엽의 페놀성 함량은 7557.85 mg/mL , 8790.97 mg/mL로 자소엽이 더 많이 함유되어 있다는 것을 확인하였다.
2. 연구 방법
가. 청무의 DNA 추출
1) 각각 과산화수소 농도가 0.001M, 0.005M, 0.01M인 용매에서 청무를 발아시킨다.
2) 발아시킨 무씨를 취합하여 세제물에서 세포막을 파괴한다.
3) 무씨와 세제의 혼합물을 거즈를 이용해 거른다.
4) 거른 용액에서 1ml를 1.5ml 에펜튜브에 옮겨 담아 13,000rpm에서 1분간 원심분리한다.
5) 원심 분리가 끝난 후 상층액 500μL를 새로운 튜브에 옮긴다.
6) 상층액이 담긴 1.5ml 튜브에 NaCl 20μL를 넣고 10초간 vortex한다.
7) vortex를 마친 튜브에 100% 에탄올 1ml를 넣고 10회 inversion한다.
8) 13,000rpm에서 1분간 원심분리 한다.
9) 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 Washing buffer 700μL를 넣고 5회 inversion한다.
10) 13,000rpm에서 1분간 원심분리 하여 세척한다.
11) 원심분리후 상층액을 버리고 튜브 안의 DNA pellet을 건조시킨다.
나. 자소엽 추출물 제작 1) 자소엽을 건조, 분쇄한다.
2) 분쇄한 자소엽을 5g씩 3개의 비커에 담는다.
3) 각각의 비커에 자소엽 중량 5배, 10배, 15배 분량의 95%에탄올을 넣는다.
4) ultrasonic cleaner을 이용해 1분간 자소엽 추출물을 교반한다.
다. 독성 테스트(동물성 독성의 확인)
1) 페트리디쉬에 수돗물 30ml, 알테미어 1.2g을 투입 후 고르게 해준 뒤 30℃인큐베이터에 배양한 다.
2) 1일 배양한 알테미어에 아세트산과 자소엽 추출물을 농도별로 투입한다.
3) 매일 산소를 공급해주며 일주일간 24시간 간격으로 부화 개체수를 측정한다.
라. 독성 테스트(식물성 독성의 확인)
1) 좀개구리밥을 암실 속 30℃수돗물에 24시간동안 배양한다.
2) 배양한 좀개구리밥 4개체당 수돗물 50ml에 자소엽 추출물, 아세트산을 투입한다.
3) 24시간 간격으로 좀개구리밥의 뿌리 이탈율을 확인한다.
마. 자소엽 추출물의 항균성 확인
1) Agar 배지를 압력밥솥으로 제작한 뒤 페트리 디쉬에 부어 굳힌다.
2) 마이크로피펫으로 대장균 100μL을 고체배지위에 뿌린다.
3) 고체배지에 자소엽 추출물과 증류수, 구연산이 적셔진 디스크를 배치한다.
4) 뚜껑을 덮고 incubator에서 24시간 배양한다.
5) 배지 표면의 항균 정도를 디스크로부터 항균된 거리를 측정함으로써 확인한다.
연구성과
1. 연구 결과
가. 과산화수소 농도 차이에 따른 청무의 생장 비교
실험을 진행하며 무씨의 생장을 외관적으로 확인한 결과, 과산화수소수의 농도가 짙을수록, 즉 0.01mol, 0.005mol, 0.001mol 순으로 발아율 및 생장률이 좋지 않았다. 생장률 외에도 외관적 인 차이가 있었는데, 과산화수소수의 농도가 높을수록 잎의 크기가 크지만 얇은 편이라 아래로 처지는 모습을 관찰할 수 있었고, 잎의 색이 짙지 못하며 줄기가 얇아 바로 서있지 못하고 옆으로 꺾이는 현상을 확인하였다. 그 외에도 줄기 표면의 잔털이 듬성듬성한 것을 보아 초기 발아 상태가 불안정한 것을 확인할 수 있었다.
나. 자소엽 추출물과 구연산, 아스코르브산을 첨가한 청무의 생장 비교
구연산, 아스코르브산과 같은 대조군의 경우 항산화 작용에 의해 과산화수소수 0.005몰 대조 군에 비해 생장 정도가 강화하였다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 자소엽 추출물이 두 대조군 대비 생장 정도가 강화하였으며, 가장 많이 생장 정도가 개선된 경우는 10%의 자소엽 추출물이 포함된 증류수 희석을 거친 용매였다. 20%의 자소엽 추출물은 농도가 너무 짙어서 농도 차에 의한 삼투압에 의해 무씨가 고사하였다.
다. 자소엽 추출물의 독성 테스트 결과 1) 동물성 독성
발아한 알테미어의 수는 아세트산의 경우 40~50개체로 추산하였다. 이는 아세트산의 독성에 영향을 받은 것으로, 대조군의 자료로 사용할 수 있다. 자소엽 추출물 1%, 10%, 20% 각각의 경우 농도가 증가할수록 독성에 의해 발아 개체수가 미량 감소하였다. 각 경우의 발아한 알테미 어의 수는 1% 80~85마리 추정, 10% 70~80마리 추정, 20% 55~60마리 추정으로 모든 경우가 아세트산 대비 발아율이 높으므로 독성이 아세트산 대비 훨씬 적음을 추론할 수 있었다.
2) 식물성 독성
한 실험군 당 사용한 개구리밥의 수는 5개체로, 셀 수 있을 정도의 길이 및 두께를 가진 뿌리의 개수의 합이 15가 되도록 조정했다. 아세트산의 경우 뿌리 이탈율이 45.8% 정도로 상당히 높은 수준이었으며 역시 독성에 의한 것으로, 대조군의 자료로써 사용하였다. 자소엽 추출물의 경우 1%, 10%, 20% 각각의 경우 농도가 증가할수록 뿌리 이탈율이 증가하였다.
각 경우의 뿌리이탈율은 1%의 경우 15.7%, 10% 경우 18.9%, 20% 19.7%로 모든 경우가 아세트산 대비 뿌리 이탈율이 낮으며 식물에 대해 독성을 심하게 갖지 않는다는 것을 알 수 있었다.
라. 자소엽 추출물의 항균성 테스트 결과(배지 제작을 통한 항균능력 측정
각각의 배지는 총 무균 배지, 멸균 증류수 배지와 대장균을 도말한 배지이며 무균 배지와 멸균 배지에는 세균이 자라지 않았다. 이로써 실험 환경의 전제 조건이 충족되어 실험 결과의 신뢰도를 높여줄 수 있다. 대장균을 도말한 배지는 대장균 도말 배지와 디스크 확산법을 사용하 여 멸균 디스크, 증류수 디스크, 멸균 구연산 디스크, 자소엽 추출물 1% 디스크, 자소엽 추출물 10% 디스크, 자소엽 추출물 20% 디스크로 실험을 진행하였으며 멸균 디스크와 증류수 디스크 에서 항균에 의한 세균 번식 저해가 나타나지 않았다. 구연산 디스크의 경우 디스크에 의한 세균 번식 저해는 디스크의 중심으로부터 2.7cm를 지름으로 하였다. 이로써 항균성을 측정할 수 있었고 1% 자소엽 추출물의 경우 디스크 중심 기준 2.8, 10% 자소엽 추출물은 3.1, 20%
자소엽 추출물은 3.5로 점점 항균력이 증가함을 확인할 수 있었다.
주요어
(Key words) 항산화능, 비용절감, 활성산소
< 연구 결과보고서 >
1. 개요
□ 연구목적
○ 항산화 물질의 안전성 및 실용화 가능성에 대한 정보의 수요
우리는 자주 접하는 커피의 카페인 성분이 세포의 DNA의 길이를 손상시킨다는 것을 알게 되었다.
그래서 세포뿐만이 아닌 다른 요인으로 인해 DNA가 복합적으로 변화하지는 않을까 자료를 찾아본 결과 세포 내 활성산소에 의해서도 DNA가 손상된다는 것을 알게 되었다. 이를 통해 조사를 진행한 결과 활성산소를 억제하는 성분이 항산화능이고, 일반적으로 문제를 해결할 수 있는 항산화제는 일반적으로 희소성이 높은 재료들로 제작하여 적은 양임에도 비싼 가격으로 판매되는 제품들이 많은 것으로 보인다. 이 때문에 주변에서 자주 볼 수 있고 저가의 천연물질로 항산화제를 제작하려는 시도가 이루어지고 있는 것을 알 수 있었다. 그래서 우리는 학교 근처에서 흔히 재배되는 자소엽의 항산화능에 착안하여 산화 스트레스에 영향을 받은, 즉 활성산소가 있는 환경에 노출된 식물의 생장을 관찰하고 복합적인 DNA의 활성산소에 의한 손상을 분석하고 자소엽 추출물의 독성, 항균성, 집적적 인 항산화능의 수치를 측정하여 실용 가능성을 확인할 것이다.
□ 연구범위
가. 활성산소에 의한 DNA의 산화 스트레스성 길이 감축 확인 1) 카페인을 통한 강낭콩 DNA의 길이 감축 확인
2) 과산화수소를 통한 무씨 DNA의 길이 감축 확인 나. 자소엽 추출물의 항산화능 확인
1) 자소엽 추출물의 제작
2) 자소엽 추출물과 과한화수소수를 통한 DNA 길이 감축 비교 3) 자소엽 추출물의 DPPH법을 통한 항산화능 측정
다. 자소엽 추출물의 독성 확인
1) 개구리밥 뿌리 이탈율을 통한 식물성 독성 측정 2) 알테미어의 생존을 통한 동물성 독성 측정 라. 자소엽 추출물의 항균성 확인
- 디스크 확산법을 통한 대장균 살상능 비교
2. 연구 수행 내용
□ 이론적 배경 및 선행 연구
가. 자소엽 에탄올 추출물의 향장학적 활성 평가, 전남대 화학공학부
1) 자소엽 에탄올 추출물이 세포 독성이 없고 천연물 유래의 소재로서 항산화 활성과 항염활성에 효율적인 것으로 확인하였다.
2) LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 macrophage에 에탄올을 이용하여 추출한 경우 모든 추출물에 서 NO생성을 감소시키는 것을 확인하였으며 특히 50%와 70%로 추출했을 때 가장 효율이 좋았다는 것을 확인하였다.
3) 하지만 90%나 70%일 때는 고유한 추출물의 성분 효율이 떨어질 것으로 판단하였고 에탄올 농도에 너무 의존할 것만 같아 본 실험에선 가장 적절한 것 같은 50%에탄올을 이용하여 자소엽을
추출하기로 하였다.
나. 천연 색소 고정화 기술을 활용한 오미자와 자소엽 추출물 함유 음료의 항산화 활성 연구, 대구 한의대 한방신약개발연구팀
1) 오미자와 자소엽, 오미자 + 자소엽 추출물을 이용하여 DPPH 실험을 진행한 결과, 자소엽 추출물 에서 흡광도가 매우 낮게 변하는 것을 확인하였고 오미자와 오미자 + 자소엽 추출물은 비슷한 성향을 보이는 것을 확인하였다. 또한 농도가 높아질수록 radical 소거활성기능이 증가하는 것도 확인하였다.
2) 오미자와 자소엽의 페놀성 함량은 7557.85 mg/mL , 8790.97 mg/mL로 자소엽이 더 많이 함유되어 있다는 것을 확인하였다.
3) 이 연구를 통해 본 연구에서도 대조군으로 다른 항산화 물질이 필요하다고 생각하여 자료를 조사한 결과, 과일에는 대부분 항산화효과가 있다는 것을 보고 대표적인 항산화 효과를 보이는 성분인 구연산 분말을 이용하기로 하였다.
□ 연구주제의 선정
○ 카페인이 DNA에 야기하는 부작용을 확인하게 되면서 이 부작용의 여파가 활성산소가 생명체에 일으키는 작용과 유사하다는 것을 알 수 있었다. 카페인은 DNA를 파괴함으로써 길이를 수축시키 고, 그 외 심혈계 질환에도 널리 영향을 미치는 물질이다. 활성산소에 의한 산화 스트레스는 전자와 비슷한 작용으로, 세포 내 DNA에 영향을 미쳐 DNA의 길이를 수축시켜 결과적으로는 노화, 즉 생명의 단축을 일으키는 문제점이 있다는 것을 확인하였다. 이를 위와 같이 선행 연구 자료에서도 항산화능이 간접적으로 증명된 자소엽을 중점적으로 이의 독성과 항균성, 수치적 항산화능, 적용적인 항산화능을 확인하여 자소엽의 실제 항산화제로써의 가능성을 파악하는 것을 목적으로 삼아 이 연구를 진행하였다.
□ 연구 방법
가. 청무의 과산화수소수에서의 발아
- 과산화수소수의 농도를 다르게 한 수용액을 제작하고, 수경재배 방식으로 발아를 유도한다.
이에 따라 농도가 높아질수록 발아한 무씨의 수와 생장 정도가 확연하게 차이가 날 것이다.
나. 청무의 DNA 추출
1) 각 실험군에서의 무씨를 전부 취합하여 빻고, 세포막을 파괴하기 위해 세제와 소금의 혼합물을 제작하여 교반한다. 이때 거품이 나지 않도록 한다.
2) 혼합이 완료된 용액을 에펜튜브에 보관하고, 잠시 후에 층이 분리된 것을 확인했다.
3) 마이크로피펫을 이용해 분리된 DNA층을 추출하여 다른 에펜튜브에 보관한다.
4) 에펜튜브에 99% 에탄올을 첨가하고 원심분리기에서 층을 분리한다. 이후 상등액을 따라낸다.
5) 상등액을 따라내고, 70% 에탄올을 첨가하고 다시 원심분리기에 층을 분리한다.
다시 상등액을 따라내고 건조하여 DNA를 획득할 수 있다. 획득한 DNA는 추후 사용을 위해 에펜튜브에 밀봉하여 냉동보관한다.
다. 자소엽 수확 및 추출
1) 수확한 자소엽을 건조, 분쇄하여 두가지 방법으로 추출하였다.
2) 에탄올 추출법을 이용하여 자소엽 추출물을 만든다.
3) 열수추출법을 이용하여 자소엽 추출물을 만든다.
라. 독성 테스트
1) 자소엽 추출물의 항산화능이 일부 독성을 가질 수 있고 에탄올 추출과정에서 에탄올 의 독성이 포함되기 때문에 자소엽 추출물을 안전하게 사용할 수 있는 농도를 확인하 기 위해 개구리밥의 뿌리 이탈율을 이용하여 독성테스트를 진행하고 적정 농도를 찾는다.
2) 또한 동물성 독성을 확인하기 위해 알테미어를 사용한 독성 테스트를 진행한다.
마. 자소엽 추출물의 항균성 확인
일반적으로 항산화능을 가지고 있다면 항균성도 보이는 것을 확인할 수 있다. 이 때문에 우리는 자소엽의 항산화능 뿐만 아니라 항균성도 확인하기 위해 균 콜로니 측정 실험을 진행하기로 하였다. 균 콜로니 측정 실험을 이용하여 항균성을 확인함으로써 추출물의 항산화능을 효율적으 로 활용할 수 있을 것이다.
바. DPPH법을 이용한 항산화능 확인
자소엽 추출물의 항산화능을 확인하기 위하여 DPPH법을 이용해 효율을 검증한다. DPPH 법은 시료에 함유된 항산화물질에 반응하여 변색되는 DPPH의 성질을 이용하며 항산화능력이 매우 강한 경우 확연한 노란색이 되지만 비슷한 경우 거의 육안구분이 되지 않고 정확하지 않으므로 흡광도를 이용하여 측정할 것이다.
사. 청무의 항산화 물질의 종류 및 첨가 유무에 따른 DNA 변화 확인
추출한 물질의 항산화능이 실제 어느 정도의 효용가능성이 있는지에 대한 부분은 알 수 없으므 로, 과산화수소수 용매에 희석한 자소엽 에탄올 추출물, 자소엽 열수 추출물, 아스코르브산을 각각 투여하여 생장의 정도를 비교할 것이다. 생장의 차이를 비교한 후에는 DNA 분석을 통해 직접적인 길이 수축과 DNA의 보호가 어느 정도로 이루어졌는지 확인할 것이다.
□ 연구 활동 및 과정
가. 자소엽 수확 및 추출1) 자소엽을 세척하고 건조기로 건조시켜 분쇄한다.
2) 분쇄된 자소엽을 5배의 50% 에탄올 용매로 2시간동안 초음파 추출을 진행한다.
3) 추출액은 여과시킨 뒤 감압농축기로 농축하여 순수한 추출물을 얻는다.
나. 청무의 과산화수소수에서의 발아 1) 시행착오
기존 실험에서는 강낭콩을 사용하였으나, 강낭콩의 생장 속도가 비교적 느리고 종자의 크기 대비 싹이 많이 나오지 않아 효율적이지 않다고 판단할 수 있었다. 또한 디엔에이 추출 시 양 대비 많은 DNA가 추출되지 않았다. 이는 식물체 내 수분 함량에 따라 좌우되는 것으로 보인다. 따라서 종자의 크기가 비교적 작고, 식물체 내에 수분을 많이 함유하고 있으며 생장속도가 빠른 청무로 항산화능에 대한 생장의 비교를 진행하기로 했다. 또한 항산화능을 확인하려면 ‘타감작용’이 아닌 ‘산화 스트레스’
를 확인해야 하는 것이므로, 기존에 사용하던 카페인 대신 산화 스트레스를 유발하는데 일반적으로 사용되는 과산화수소를 이용하여 무씨에게 산화 스트레스에 의한 생장 차를 일으키고 디엔에이 파괴를 일으키는 것을 확실히 할 수 있게 했다.
2) 실험 과정
가) 청무를 취합한다.
나) 크기가 다른 플라스틱 비커 두 개 각각을 이용하여 수경 재배가 가능하도록 배치하고, 거즈 위에 무씨를 올려 항상 젖어 있게 한다.
다) 청무를 실온에서 각각 다른 농도(0.01M, 0.005M, 0.001M)의 과산화수소수에서 생장하도록 배치한다.
다. 청무의 DNA 추출 1) 시행착오
기존 실험에서는 실험을 실린더에서 진행하였으나, 중간 피드백 결과 실린더는 DNA를 추출 후 샘플링하기에 적당하지 않다는 것을 알 수 있었다. 이에 따라, 실험 방법을 변경하였다.
2) 실험 과정
가) 발아가 일어난 각 실험군의 청무를 막자사발과 막지를 이용하여 빻는다.
나) 증류수 200mL에 세제 6g, 소금 6g을 넣고 거품이 나지 않도록 잘 저어준 뒤 10분간 방치한다.
다) 차가운 에탄올을 추출물의 2배만큼 에펜튜브에 넣어 유리막대로 잘 저어준다.
라) 청무 추출물과 에탄올의 경계에서 DNA를 확인할 수 있다.
마) DNA를 마이크로피펫을 사용해서 다른 에펜튜브로 옮긴 뒤 100% 에탄올 400㎕를 넣어 층이 생기도록 한다.
바) 원심분리기를 13000 RPM에서 1분간 원심분리 후 투명한 pellet을 확인한다.
사) 상층액을 버리고 70% 에탄올 400㎕를 넣어 다시 한 번 원심 분리한다.
아) 투명한 pellet을 확인한 후 상층액을 버리고 에탄올이 증발되도록 에펜튜브를 뒤집어 놓는다.
자) E-tube에 증류수 30㎕를 넣고 손톱으로 치며 DNA를 녹인다.
라. 독성 테스트
1) 실험 과정 (동물성 독성의 확인)
가) 수돗물, 자소엽 추출물, 아세트산을 준비한다.
나) 실험군과 대조군 수만큼 1회용 페트리디쉬에 수돗물 30ml, 알테미어 1.2g을 투입 후 가볍게 흔든 후 30℃ 인큐베이터에 배양한다.
다) 1일 배양 한 알테미어에 처리용액인 아세트산과 자소엽 추출물을 농도별로 투입한 다. 이때 대조군의 독성을 대체하기 위해 아세트산을 투입하다.
라) 매일 하루 한번 스포이트로 공기를 주입하여 산소를 공급해준다.
마) 24시간 간격으로 부화 개체수를 측정한다. 약 일주일간 진행한다.
바) 의 농도와 AF값을 구하고 해석한 뒤 그래프화 시킨다.
2) 실험 과정 (식물성 독성의 확인)
가) 수돗물, 자소엽 추출물, 아세트산을 준비한다.
나) 좀개구리밥을 수돗물에 암실 24시간 30℃배양한다.
다) 배양한 좀개구리밥 4개체 당 수돗물 50mL에 자소엽 추출물, 아세트산을 투입한다. 이때 아세트산을 투입하는 이유는 대조군의 독성을 대체하기 위함이다.
라) 24시간 간격으로 좀개구리밥의 뿌리 이탈율을 확인한다.
마. 자소엽 추출물의 항균성 확인
1) Agar 배지를 압력밥솥으로 제작한 뒤 페트리디쉬에 부어 굳힌다.
2) 마이크로피펫으로 대장균 100㎕를 고체배지위에 뿌린다.
3) 고체배지에 자소엽 추출물과 증류수, 구연산 1mL를 각각 넣고 스프레더로 도말한다.
4) 뚜껑을 덮고 incubator에서 24시간 배양한다.
5) 배지 표면의 colonies를 육안으로 측정한다.
바. DPPH법을 이용한 항산화능 확인
1) 95% ethanol에 용해시킨 0.1 mM DPPH 800㎕와 각 실험군(자소엽, 구연산, 증류수) 200㎕을 에펜tube에 넣고 3분간 교반하여 암실에서 30분간 반응 시킨다.
2) 남아있는 radical의 농도를 Lab junior를 이용하여 517nm로 측정한다.
3) 30초씩 3분 동안 파장의 감소치를 확인한다.
사. 청무의 항산화 물질의 종류 및 첨가 유무에 따른 DNA 변화 확인
1) 과산화수소수 0.005M 수용액에 열수추출물, 에탄올추출물, 아스코르브산을 희석하여 청무를 발아시킨다.
2) 발아가 일어난 각 실험군의 청무를 막자사발과 막지를 이용하여 빻는다.
3) 증류수 200mL에 세제 6g, 소금 6g을 넣고 거품이 나지 않도록 잘 저어준 뒤 10분간 방치한다.
4) 차가운 에탄올을 추출물의 2배만큼 에펜튜브에 넣어 유리막대로 잘 저어준다.
5) 청무 추출물과 에탄올의 경계에서 DNA를 확인할 수 있다.
6) DNA를 마이크로피펫을 사용해서 다른 에펜튜브로 옮긴 뒤 100% 에탄올 400㎕를 넣어 층이 생기도록 한다.
7) 원심분리기를 13000 RPM에서 1분간 원심분리 후 투명한 pellet을 확인한다.
8) 상층액을 버리고 70% 에탄올 400㎕를 넣어 다시 한 번 원심 분리한다.
9) 투명한 pellet을 확인한 후 상층액을 버리고 에탄올이 증발되도록 에펜튜브를 뒤집어 놓는다.
10) E-tube에 증류수 30㎕를 넣고 손톱으로 치며 DNA를 녹인다.
3. 연구 결과 및 시사점
□ 연구 결과
가. 시행착오 개선처음에 사용한 실험 대상 식물은 강낭콩이었으며, 카페인으로 인한 DNA 파괴 현상을 관찰하고자 하였다. 하지만 강낭콩은 생장이 좋지 않고 또한 DNA 수득률이 좋지 않았으므로 사용할 수 없었다.
또한 취한 DNA를 메스실린더를 이용하여 획득했는데, 이 과정에서 메스실린더의 지름 때문에 DNA 층을 분리하는데 상당히 어려움을 겪었다. 그 외에도 용매로 카페인을 사용하였었는데, 문헌조사를 진행한 결과 카페인이 DNA에 미치는 영향은 분분한 면이 많았다. 그리하여 사용하는 용매를 활성산 소를 대표적으로 발생시키는 물질인 과산화수소로 변경하였으며, 식물체는 수분을 많이 함유하여
용매의 영향을 많이 받고, 생장속도와 DNA 수득률이 좋은 청무를 채택하게 되었다. 뿐만 아니라, DNA를 취할 때 안정하게 취하기 위해 에펜튜브에서 DNA 층을 형성하고 추출하였다.
나. 실험 결과 1) 청무 발아
0.01mol, 0.05mol, 0.1mol이 들어간 과산화수소 용액에서 청무를 키웠을 때 과산화수소의 활성산소 생성으로 인한 청무의 산화스트레스 작용으로 인하여 발아가 잘 일어나지 않았다. 솜과 휴지를 사용했 을 때 용액이 금방 증발하여 습기를 머금고 있기 어려워 비커에 직접 용액을 담아 싹을 틔운 결과, 증류수에서는 발아가 많이 일어났으며 나머지는 청무가 증류수에 비해 적게 발아가 일어났다. 또한 과산화수소의 농도가 높을수록 청무의 발아가 적게 일어났고 잎의 크기와 줄기의 굵기를 미루어 보았을 때 생장도 좋지 않았다.
2) 청무의 항산화물질의 첨가 유무에 따른 DNA변화 확인
에탄올과 순수 추출물의 중량비가 총 5:1, 10:1, 15:1 일 때 과산화수소수 0.005mol 용액이 들어간 과산화수소 용액의 청무 생장은 순수 추출물의 농도가 높을수록(에탄올의 첨가 정도가 적을수록) 발아가 잘 일어났다. 발아한 개체 수 및 생장의 지표(길이, 줄기, 잎의 색 등)를 관찰하였을 때 자소엽 추출물이 아스코르브산보다 우수하였으며, 이는 곧 자소엽의 항산화능이 우수함을 나타낸다.
3) DNA 전기영동을 통한 DNA 감축 확인
각 청무의 DNA를 추출하여 전기영동을 통해 DNA 감축을 확인한 결과 거의 뚜렷한 차이를 확인하 기 힘들었다. 따라서 추후 DNA를 추출 후 곧장 정밀 검사를 통해 파괴된 DNA의 부분과 길이 감축을 확인할 예정이다. 이 때 사용할 방법은 Plasmid DNA 분석 등 특정 세균의 DNA 감축 및 파괴된 부분을 정확히 파악할 수 있는 방법을 전문 기관에 의뢰할 예정이다.
4) 자소엽 추출물의 독성 확인 – 식물성 독성
자소엽 추출물의 독성을 확인하기 위하여 좀개구리밥 뿌리의 이탈율을 측정한 결과는 아래와 같다.
(자소엽 : 에탄올의 중량비로 표기함.)
이탈정도 용액 아세트산 1:5 1:10 1:15
이탈율(%) 45.8 15.7 18.9 19.7
[표 1, 각 자소엽 추출물의 중량비에 따른 뿌리의 이탈율]
[그래프 1, 각 자소엽 추출물의 중량비에 따른 뿌리의 이탈율]
이 결과를 통해 자소엽 추출물의 중량비에 따른 뿌리의 이탈율이 최대 4%가량 증가하나, 아세트산에 비해 이탈율이 2배 가까이 낮다는 것을 통해 독성이 거의 없음으로 판단할 수 있었다.
5) 자소엽 추출물의 독성 확인 – 동물성 독성
동물의 독성을 확인하기 위하여 알테미어의 부화율을 측정한 결과는 아래와 같다.
(자소엽 : 에탄올의 중량비로 표기함.)
발아 수 용액 아세트산 1:5 1:10 1:15
부화율(%) 40～50 55～60 70～80 80～85
[표 2, 각 자소엽 추출물의 중량비에 따른 알테미어 부화 개체 수]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
1:5 1:10 1:15
최소개최수 최대개최수
[그래프 2, 각 자소엽 추출물의 중량비에 따른 알테미어 부화 개체 수]
이 결과를 통해 자소엽 추출물의 중량비에 따른 알테미어의 부화 개체 수가 농도가 높을수록 25 마리 가량 감소하나, 아세트산에 비해 부화 개체 수가 2배 가까이 높은 것을 통해 독성이 거의 없음으로 판단할 수 있었다.
6) 자소엽 추출물의 항균성 확인
자소엽 추출물의 항균성을 확인하기 위하여 대장균의 소멸 정도를 확인한 결과는 아래와 같다.
(자소엽 : 에탄올의 중량비로 표기함.)
용액
향균범위 (cm) 구연산 1:5 1:10 1:15
클린 범위(㎝) 2.7 3.5 3.1 2.8
[표 3, 각 자소엽 추출물의 중량비에 따른 디스크의 클린 범위]
[그래프 3, 자소엽 추출물의 중량비에 따른 디스크의 클린 범위]
이 결과를 통해 자소엽 추출물의 중량 비에 따른 항균 범위는 농도가 높을수록 증가하며, 균 살상능이 우수함을 알 수 있었다. 또한, 자소엽 추출물의 항균성이 구연산보다 크게 우수함 을 나타냈기 때문에 이는 곧 자소엽 추출물의 항균성이 구연산보다 우수한 것을 나타낸다.
7) 자소엽 추출물의 DPPH법을 통한 항균능 대조
자소엽의 항균 능력을 확인하기 위하여 DPPH법을 사용하여 자소엽의 흡광도를 확인한 결과는 아래와 같다.
(자소엽 : 에탄올의 중량비로 표기함.) 용액
측정 흡광도 구연산 1:5 1:10 1:15
흡광도의 세기 1980 2170 2125 1975 [표 3, 각 자소엽 추출물의 중량비에 따른 517nm에서의 흡광도]
이 결과를 통해 자소엽 추출물의 중량 비에 따른 항산화능은 농도가 높을수록 증가하며, 대체로 구연산에 비해 우수한 것을 확인할 수 있었다. 항산화능 측정 수식(radical 소거능 측정법)의 식을 간단히 했을 때 함수 표현 시 변수에 대해 증가하므로, 이는 곧 흡광도의 증가가 실 항산화능의 증가인 것으로 파악할 수 있다.
4. 홍보 및 사후 활용
□ 유사한 식물에 대한 항산화능 검토
○ 자소엽은 가격이 상대적으로 가격이 높은 식물들 중 하나이다. 따라서 유사한 식물(같은 목의 식물)을 조사함으로써 생태계 교란종 혹은 그 외 영향이 좋지 않은 식물이나 주변에서 흔하게 확인할 수 있는 식물을 선택하여 그에 대한 항산화능을 검토하고, 항산화제로써의 가능성을 탐구할 수 있다.
□ 항산화제로써의 체내 흡수율 탐구
○ 항산화제의 궁극적 목적은 체내 사용이다. 따라서 위의 연구 결과를 바탕으로 효과적인 항산화제 의 체내 흡수 방법을 모색하고, 가장 효과적으로 작용하는 성분을 탐색하여 그의 화학적 특징을 연관지어 선택적인 성분의 인체 흡수를 연구할 수 있다.
5. 참고문헌
○ 박도영(2017). 자소엽 에탄올 추출물의 향장학적 활성 평가: 한국산학기술학회논문지
○ 최문희, 신현재 (2015). 국산 블루베리 착즙액의 항산화 활성 및 멜라닌생성 저해효과.
대한피부미용학회, pp.261-266
○ 커피티비. (2016). 커피는 우리의 DNA를 바꾼다? .
http://coffeetv.co.kr/article/article?sca=news&id=1517
○신인순 , 김성옥 , 황수정 , 김미려 , 허담 (2011). 천연 색소 고정화 기술을 활용한 오미자와 자소엽 추출물 함유 음료의 항산화 활성 연구. 대한본초학회지(본초분과학회지) 26권3호, 37-45(9pages)
