녹차(-)-Epigallocatechin-3-gallate 섭취가 고강도 운동시 흰쥐의 대장에서 HO-1발현에 미치는 영향
원광보건대학 의무부사관과
1, 간호과
2최 석 준1∙이 경 완2
Combined Effect of High Intensity Exercise and (-) Epigallocatechin-3-gallate of Green Tea Supplementation on Heme Oxygenase-1 in the Large Intestine of SD Rats
Suck Jun Choi, Ph.D.
1, Gyoung Wan Lee, Ph.D.
21
Department of Medical Non-Commissioned Officer, Wonkwang Health Science University, IkSan, Korea
2
Department of Nursing, Wonkwang Health Science University, IkSan, Korea
The purpose of this study was to investigate effects of combined treatment with high intensity exercise and (-) epigallo- catechin-3 gallate (EGCG), a potent free radical scavenger on a transcriptional level of hemoxygenase-1 gene in the large intestine. Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (CON, n=7), high intensity exercise group (HIE, n=7), EGCG group (EGCG, n=7), and EGCG plus high intensity exercise group (HIE + EGCG, n=7). Animals were given an intraperitoneal injection of EGCG with 50 mg of dosage per kg for four weeks 30 minutes before exercise. In order to induce HIE animals were allowed to ran on a treadmill with 0 degree of slope at speed of 28 m/min for 30 minutes. The exercise was performed four times a week for four week. The results of this study were as following; The expression level of hemoxygenase-1 mRNA of the high intensity exercise group was 15.21 times higher than that of the control group. The EGCG plus high intensity exercise group showed 5.98 times increased expression level of hemoxygenase-1 mRNA than control group. These results suggest that treatment of EGCG decrease the expression level of HO-1 mRNA through the removal of oxygen radicals produced by a high intensity exercise.
Key Words: Epigallocatechin-3-gallate, Exercise, Hemoxygenase-1
접수: 2010-03-02
수정: 1차-2010-05-12 2차-2010-05-26 승인: 2010-05-26 책임저자: 최 석 준
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본 논문은 2010년도 원광보건대학 연구비에 의하여 연구됨.
서 론
최근에는 건강 증진 및 유지를 위하여 운동, 건강보조 식품
섭취, 식생활 개선, 유해환경에서의 노출 억제 등을 통하여
생활의 질들을 향상시키어 수명을 연장하여 보고자 노력을
하고 있다. 이 중 운동을 하다 격렬한 운동을 하는 경우도
종종 있다. 격렬한 운동은 신체적인 스트레스와 산화스트레스,
근 부상, 염증반응, 근피로 유발, 각 조직에 허혈을 발생시키기
때문에
1), 이로 인하여 대장에서 항염증 단백질인 heme oxy- genase (HO)의 변화를 보일 수 있을 것이다.
HO-1 (heme oxygenase-1, HO-1)은 운동 시 또는 스트레스에 의하여 유발되는 염증성 사이토카인 및 운동 중 발생되는 체온의 상승에 의하여 주로 반응하는 항산화 스트레스 단백질 이다. 이에 대한 연구를 살펴보면 인간을 대상으로 운동과 연관된 선행 연구에서 Thompson et al
2)은 단시간 격렬한 달리 기 혹은 신장성 운동에서는 변화가 없었지만, 하프 마라톤 에서는 유의한 증가를 보였다고 하였다
3). 또한 Markovitch et al
4)은 일회성 걷는 운동에서는 변화가 없다고 하였다. 또한 장거리 달리기나 고강도 운동은 복통, 설사, 출혈 등의 하부 장관 증상과 흉통, 오심, 구토 등 상부 위 장관 증상, 빈혈 등이 유발된다
5,6). 즉 오랜 기간의 과도한 운동은 하부장관의 기능 및 흡수 장애를 유발할 수 있는 가능성들이 있기 때문에 고강도 운동은 염증성 장 질환 자체에서 발생하는 복통, 설사, 혈변, 빈혈 등의 증상을 더욱 악화 시킬 수 있기에 주의해야 할 것이다.
최근에는 건강증진을 위하여 웰빙식품 및 차의 개발이 활기 차게 이루어지고 있다. 이 중 녹차는 강력한 항암, 항염증, 항산화의 효과가 있는 것으로 알려져 있다
7-9). 녹차의 성분 중 epigallocatechin gallate (EGCG)섭취는 인슐린 민감도와 당 부하능력, 지방산화력을 증가시키고
10), 체지방량, 복부지방 량, 심박수 감소 등
11)으로 건강 증진에 도움을 줄 수 있다고 하였다. 특히 동맥 경화는 고지혈증과 혈관에서의 염증 등으로 과정이 복합적으로 진행되어 발병이 되는데, EGCG 섭취는 염증 과정 및 고지혈증을 완화 시키는 이점이 있다
12). 또한 고혈당의 경우도 EGCG가 포함된 플라보노이드의 섭취는 항 염증에 반응한다
13).
위의 연구들을 살펴본 결과 과도한 운동은 하부 장관 기능에 영향을 미치고, 이를 보호하기 위한 항상성 과정 중 항염증 단백질의 발현을 증가시킬 수 있으며, 녹차는 우리 생활의 필수 식품으로 자리 매김하고 있으며, 항염증의 효과가 있다.
그러나 운동, EGCG 섭취, HO-1과의 상호작용에 대해서는 아직 명확하게 밝혀지지 않고 있는 실정이다. 때문에 연구자는 장기간의 고강도 운동시 EGCG의 섭취가 항 염증 단백질인 HO-1의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 기초 자료를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
대상 및 방법
1. 연구대상
본 연구에서 사용된 실험동물은 출생시기가 비슷한 Sprague- Dawley계 흰쥐 수컷 7주령(195±10 g) 28마리를 무작위로 선정 하여 사용하였다. 실험동물들은 통제그룹(control, CON; n=7), EGCG 섭취그룹(EGCG, n=7), 고강도 운동 그룹(high exercise intensity, HIE; n=7), EGCG 섭취와 고강도 운동을 병행한 그룹 (EGCG + HIE, n=7)배분하였다. 운동그룹 14마리는 1주간의 예비운동을 실시하여 적응기를 거친 후에 운동을 실시하였다.
실험동물의 먹이는 전 실험기간을 통하여 시판되는 샘타코 마우스사료(단백질 22.5%, 지방 3.5%, 저섬유 7.0%, 회분 9.0%, 칼슘 0.7%, 인 0.5%)와 충분한 물을 공급하고 조명의 소등 및 점등은 각각 12시간씩 하고, 온도는 22±2℃, 습도는 70-80%
의 사육실에서 사육케이스를 이용하여 동일한 환경에서 사육 하였다.
2. 운동방법
운동부하 방법은 1주일간은 적응기간으로 5-20 m/min의 속도로 10-15분 동안 트레드밀에서 예비운동을 실시하였다.
이 후 28 m/min의 속도로 30분간, 4회/주(월, 수, 금, 토), 4주간 트레드밀 운동을 실시하였다
14). EGCG (sigma, Milano, Italy) 섭취량은 50 mg/kg/day을 매 운동 실시하기 30분 전에 경구투 여로 섭취하게 하였다
15). 실험동물은 마지막 운동 직후 경추탈 골을 실시하여 대장을 적출한 후 즉시 -80°C의 액체 질소탱크 에 보관하였다.
3. 분석방법
1) 면역조직화학염색 방법에 의한 HO-1의 관찰
방법파라핀 포매 조직을 probe-on plus slide에 3 μm 두께로 자른
후 xylene으로 파라핀을 제거하고, phosphated buffered saline으
로 함수시킨 후, Digest-All 3 (Zymed Lab, South San Francisco,
CA, USA) 처리 후 Hydrogen peroxide Block (Lab Vision Corpo-
ration, Fremont, CA, USA)를 이용하여 endogenous peroxidase를
제거하였다. 일차항체는 anti-goat HO-1 (sc-1796; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 1:200으로 희석하여 4℃에서 overnight하였다. Phosphated buffered saline (PBS)으로 세척한 후 superpicture kit (Zymed Lab)를 이용하여 2차 항체반 응을 유발시켰으며, AEC single solution (Zymed Lab)으로 발색 시킨 후, Gill's hematoxylin으로 대조염색을 시행하고, universal mount로 봉입하여 광학현미경으로 판독하였다.
2) RNA isolation
전체 RNA를 추출하기 위하여 대장조직을 RNase가 제거된 수술기구와 페트리디쉬를 이용해 각각 100 mg 이하를 채취하 여 DEPC Water로 수세한 뒤 1.5 mL eppendrop tube에서 Trizol reagent (JBI, Daegu, Korea)를 1 mL을 넣어 조직분쇄기로 조직 을 완전히 분쇄한 후 바로 chlorform을 첨가하여 vortex를 20-30 초 해준 후 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리 하였다.
이때 용액이 세 부분으로 나누어지는데 가장 위의 RNA가 있는 isopropyl alcohol을 넣고 10분간 정치시키고, 4℃에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리를 하였다. 상층액을 버리고 diethypyrocarbonate 물에 75% ethanol을 혼합하여 수세한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리를 한 후 상층액은 버리고, 펠렛을 DEPC물을 이용하여 녹였다. 이렇게 추출된 RNA는 -80℃에 보관하였다. 전체 RNA농도 측정은 RNase가 처리된 0.1% diethypyrocarbonate 물로 용해시켜 UV spectropho- tometer로 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 총 RNA 양을 정량화 하였다.
3) 역전사 반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)
(1) RT-PCR
각 실험동물로부터 대장조직을 분리하여 semiquantitative RT-PCR법을 이용하여 mRNA에 대한 PCR 산물을 정량하였다.
역전사반응은 추출된 전체 RNA (1 μg/mL)와 oligonucleotide dT primer (100 pmol)을 Accupower
®RT PreMix (Bioneer Co, Daejeon, Korea) tube에 혼합한 후, 반응 전체 용량을 20 μL로 하여 70℃에서 5분 동안 전처리 하였다. cDNA합성은 42℃에 서 1시간동안 반응시켰고, 역전사 효소를 불활성화하기 위해
80℃에서 15분 동안 열처리 하였다. PCR은 Accupower
®PCR PreMix (Bioneer Co.) tube에 역전사된 cDNA 1 μg과 각각 forward와 reverse primer 10 pmol을 사용하여 중합반응 하였다.
(2) 중합반응 조건
① 중합반응 조건은 초기 94℃에서 5분 동안 열처리하여 cDNA를 변성시킨 후 다음과 같이 시행하였다. HO-1은 denat- ure는 94℃에서 30 s, annealing은 58℃에서 20 s, 그리고 primer extension은 72℃에서 40 s로 총 30 cycles로 실시하였다.
② Primer 제작은 다음과 같다.
HO-1 (316 bp) Left 5'-CATCTCCTTCCATTCCAGAG-3' Right 5'-CTGCTAGCCTGGTTCAAGATA-3' GAPDH (516 bp) Left 5'-AATGCATCCTGCACCACCAA-3' Right 5'-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3'
4) PCR
실시간 정량 RT-PCR: total RNA를 분리하고 cDNA를 합성 한 후, DyNAmo SYBR Green qPCR kit와 DNA Engine Opticon (MJ Research, Watertown, MA, USA)를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. cDNA 주형 및 각각의 특이적인 primer를 2× PCR master mix에 가하여 PCR 조건에 맞추어 반응을 수행하였다.
GAPDH로 정량화시킨 후, 처리군의 관심 있는 유전자의 mRNA 수준을 대조군과 비교하여 유전자 발현 증가 정도는 다음의 등식을 이용하였다: fold change = 2
-△△CT, 여기서 △△
C
T=(C
T,Target-C
T,GAPDH)
time x- (C
T,Target-C
T,GAPDH)
time 0, time x는 임의 의 시간이며, time 0는 GAPDH로 정량한 값이 대조군에 대한 관심 있는 유전자 발현이 1배가 되는 시간을 나타내었다.
Real-time PCR의 조건은 denature는 95℃에서 30 s, annealing은 58℃에서 20 s 총 30 cycles로 실시하였다.
4. 통계처리
본 연구의 자료처리는 SAS version 9.1 (SAS Institute Inc.,
Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 즉 real-time
PCR의 결과는 One Way ANOVA를 실시하고, Duncan의 사후
검증을 실시하였다. 유의수준은 p<0.05 수준 이하에서 유의성
을 검증하였다.
Fig. 1. mRNA expression of heme oxygenase-1 of large intestine in each group. Arrow is stained strongly in the group of high intensity exercise (HIE) and HIE + epigallocatechin gallate (EGCG) than control (CON) (×400). Expression of heme oxygenase -1 in the large intestine by Immunohistachemistary.
Fig. 2. (A) mRNA expression of heme oxygenase-1 (HO-I) in intestine. (B) Real-time polymerase chain reaction in group of high intensity exercise (HIE) + epigallocatechin gallate (EGCG) was significantly lower than the HIE group. The data are
결 과
1. 면역조직화학적 방법에 의한 그룹별 대장조직
에서 HO-1의 발현운동 후 각 그룹별 대장조직에서 HO-1의 발현은 Fig. 1과 같다. 즉 HO-1 발현은 통제그룹에 비해 HIE, HIE + EGCG 그룹에 서 강하게 염색되었고, 처치그룹 내에서는 HIE그룹(×400)이 EGCG 및 HIE + EGCG 그룹에 비해 강하게 염색되었다.
2. 고강도 운동 시 EGCG로 인한 HO-1의 mRNA의
발현HO-1의 생성량은 통제그룹에 비해 고강도 운동 그룹에서 증가 하였으며, 이를 EGCG에 의해 억제해 주는 것을 PCR의 결과로 알 수 있었다(Fig. 2A). 정확한 수치를 얻고자 RT-PCR을 실시하였고, 그 결과 고강도 운동에 의해 증가한 차이를 EGCG 를 섭취함으로써 감소하는 경향을 보였다(p<0.05) (Fig. 2B).
통제 그룹(CON)에 비해 고강도 운동 그룹(HIE)에서 운동 시
HO-1의 발현이 증가하였으며, EGCG에 의해 고강도 운동시
발현되었던 HO-1의 발현이 감소하는 것을 볼 수 있었다(Fig.
2A). Real-time PCR 결과 운동 직후에 HO-1의 mRNA 발현이 통제그룹에 비해 고강도 운동그룹에서 15.21배의 발현이 증가 하였으며, 고강도운동과 EGCG를 병행한 그룹에서는 통제 그룹 비해 5.89배가 증가하였다(p<0.05) (Fig. 2B).
고 찰
운동 시에는 골격근에서 신진대사를 위한 산소소비량은 안정 시보다 몇 배로 증가하게 되어 흥분된 근육에서 증가된 산소 소비량과 대사는 미토콘드리아에서 산소 유리라디칼 생성을 증가시키어 활성산소를 발생하게 된다
16). 활성산소는 몸 속에서 산화작용을 일으켜 세포막 및 DNA를 손상시켜 여러 가지 질병, 부상, 염증 등의 원인이 되는 것 이 외에도 운동시 지구력을 저하시킨다. 운동을 하면 유해산소가 발생하 지만 여기에 대항하기 위하여 항산화 방어 체계를 갖추고 있지만
17), 운동 중에는 이러한 평형 상태가 이루어지지 않으면 세포와 조직이 손상될 수 있다. 그러므로 운동 시 활성산소를 소거할 수 있는 항산화제의 보조물 섭취가 운동능력 향상과 건강 증진에 유용할 것으로 생각되어 진다. 항산화제의 보조물 인 녹차의 주성분인 카테킨류는 (+) catechin (+C), (-) epitcatechin (-EC), epitcatechingallate (-ECG), (-) epigallocatechin gallate (-EGCG) 이 외에 theanine, carotenoid, caffeine, mineral 등이 미량 포함되어 있는 polyphenol인데
18), EGCG가 50% 이상, ECG가 13-16%로 구성되어 있다. 이 중 EGGC는 Mukhtar와 Ahmad
19)에 의하면 녹차 1컵에(240 mL) 200 mg 이하를 함유하 고 있으며, Intra와 Kuo
20)는 대장세포에서 EGCG 섭취가 비타 민 C, 비타민 E 섭취보다 항산화 능력 및 항암 효과가 강력하다 고 하였다
21). 특히 이는 대장암, 전립선암, 자궁암 등의 증식억 제와 과산화수소의 생성과 전사인자의 활성화로 인하여 세포 사멸 작용을 유도하여 암 치료제
22,23)신생혈관 억제 작용에 효과가 있다고 하였다
24). 그리고 Maki et al
25)은 625 mg 카테킨 과 39 mg 카페인의 녹차를 섭취시키고, 1회 60분간의 운동으로 3회/주 운동을 12주간 실시한 결과 체중감소와 혈청 중성지방, 복부 지방이 감소하였고, Call et al
26)은 영양 실조된 수컷 생쥐를 대상으로 3주간의 달리기를 시킨 결과 128%의 지구력 능력이 향상되었고, 항산화 능력도 향상되었다고 하였다. Kim et al
27)은 인슐린 조절 단백질인 GLUT-4 발현 증가를 보고하고
있다. 또한 Venables et al
10)은 890 mg 폴리페놀과 366 mg EGCG를 섭취시키고 최대산소섭취량 60%의 수준으로 30분간 운동 시킨 결과 약 17%의 지방산화 능력이 향상되었다고 하였다. 이러한 결과들은 운동시 녹차 섭취는 지구력 향상 및 지방산화를 개선시키고 항산화 효과를 입증하여 주었고, 항염증 단백질 또는 HO-1의 유도에 관여할 수 있음을 암시해 주고 있다. 하지만 녹차와 HO-1의 직접적인 연관성을 연구한 연구 보고는 발표되지 않고 있다.
항염증 단백질인 HO-1은 열 뿐만 아니라, 허혈, 저산소증, 산화적 스트레스 등으로 인하여 유발되고, 조직 내 HO-1의 활성화는 산화작용에 의한 자극이나 사이토카인에 의한 독성 에 대하여 적응하고 세포보호 작용이 있다
28). 이러한 HO-1은 훈련되지 않은 사람들이 훈련된 사람보다 HO-1의 발현이 증가 된다고 하였다
29). 운동과의 관계는 Markovitch et al
4)은 중년남 성을 대상으로 최대산소섭취량 50%의 수준으로 1회에 30분간 의 운동은 영향을 미치지 않고 있으며, Thompson et al
2)은 장시간의 1회 운동에서는 증가한다고 하였다. Fehrenbach et al
3)은 1회성 신장성 운동과 하프마라톤을 시켜 본 결과 신장성 운동에서는 변화가 없었지만, 하프마라톤에서는 증가하여, 충 분한 자극을 주어야 변화된다고 하였다. Hildebranct et al
30)은 VO
2max 50% 강도로 180분간 운동을 실시한 후 회복기 1시간 후에 흰쥐에서 비복근내의 백색근섬유에서는 10배 증 가하였고, 적색근섬유에서 30배 증가하였는데, 이는 운동 강 도와 기간이 근섬유 형태에 따라 영향이 서로 다르다고 하였다.
Thompson et al
2)은 VO
2max 70%의 강도로 75분간 달리기를 실시한 후 운동 직후 6명이 2배 이상 증가하였으며, 평균적으 로 2.7배 증가하였고, 전반적으로 운동 2시간 후에도 증가하였 다고 하였다. 이는 1회성 운동의 형태, 강도, 기간 과 HO-1의 발현이 다르다며, 주로 이루어진 선행연구 들은 운동이 근육과 HO-1 연관성에 대한 연구가 대다수 이다. Wu et al
31)은 EGCG 섭취는 혈관 내피세포를 이용한 연구에서 phosphatidylinositol 3-kinase/Akt와 ERK의 경로로 HO-1의 유도를 할 수 있음을 보고하였다.
본 연구 결과 운동 직후에 HO-1의 발현이 통제그룹에 비해
고강도 운동그룹에서 15.21배, 고강도 운동과 EGCG를 병행하
였을 때에는 5.89배의 발현으로 고강도 운동시 EGCG를 병행
하였을 때 발현량이 감소하는 경향을 보였다. 즉 이러한 결과
는 고강도 운동시 HO-1의 발현은 Choi
32)는 대장에서 HO-1의
발현이 고강도 운동에서는 더 많이 발현되어진다고 하여 본 연구 결과와 유사하지만, EGCG 섭취와 운동을 병행한 그룹에 서는 감소하였다. 이러한 이유는 장기간 운동 시 EGCG 섭취는 과격한 운동에 의해 발생되는 산소 라디칼을 적절히 소거하여 주는 작용이 있는 것으로 생각되기에 HO-1의 유도를 감소시키 는데 영향을 미쳤을 것이라고 생각 된다. 따라서 고강도 운동 시 EGCG섭취가 활성산소 생성을 억제하여 산화적 손상을 예방 할 수 있을 것으로 시사되었다. 추후에는 다양한 운동형 태, 기간, 종류에 따라서 인체의 각 장기에서 어떻게 HO-1의 발현을 보이는지, 발현경로는 어떠한지에 대한 후속 연구가 진행 되어야 할 것이다.
참 고 문 헌
