이엽마두령(Aristolochia tagala Champ.)추출물로부터 균핵병 병원균(Sclerotinia sclerotiorum)에 대한
항균 활성물질 탐색*
1)
김현상
**․손진한
***․최용화
****Isolation of Antimicrobial Active Substance from Aristolochia tagala Champ. against Sclerotial Rot
( Sclerotinia sclerotiorum)
Kim, Hyun-Sang․Shon, Jinhan․Choi, Yong-Hwa
To develop environment-friendly agricultural products with anti-microbial activity against Sclerotinia sclerotiorum as a pathogen of sclerotium disease, Aristolochia tagala Champ. was extracted by methanol and its extract was fractionated into several solvent fractions. The chloroform fraction, which showed the highest antimicrobial activity, was separated by column chromatography and obtained forty three subfractions. The forty three fractions were searched the anti-fungal activities by bioassay. The most active No. 26 subfraction was analyzed by GC-MS. Each mass spectra, corresponding to each peak of chromatogram, was compared to MS database of Wiley library. As a result, 2,4-di-tetra-butyl-phenol, 2-mono-palmitin, 1-mono-stearin were profiled as maine compounds in No. 26 subfraction. Bioassay using commercial 1-mono-stearin to test for the anti-microbial activity conformed the antimicrobial active compound. In conclusion, 1-mono-stearin identified from Aristolochia tagala Champ. was antimicrobial chemical against Sclerotinia sclerotiorum.
Key words : antifungal active substance, aristolochia tagala champ., sclerotinia sclerotiorum, 1-mono-stearin
*
이 논문은 2014학년도 농촌진흥청 농업과학기술개발사업(과제번호 : PJ00941102)의 지원에 의해
이루어졌습니다.
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경북대학교 대학원 생태환경시스템학과
***
한국한방산업진흥원 한방제품개발팀
****
Corresponding author, 경북대학교 생태환경대학 생태환경시스템학부([email protected])
Ⅰ. 서 론
균핵병 중 Sclerotinia 속에 의한 병은 기주의 감염부위 또는 환경조건에 따라 솜털썩음 병, 흰곰팡이병, 물렁썩음병, 줄기썩음병, 초관썩음병, 꽃썩음병 등으로 나타나고 기주범위 는 매우 넓어서 채소류, 화훼류 등 여러 종류의 식물에 큰 병을 일으키며, 유묘, 성숙한 식물 체, 수확물 등 생육 전반에 걸쳐서 침입을 한다(Agrios, 1998). 그 중 Sclerotinia sclerotiorum 은 식물병원균 중에서 가장 비특이적이고 전 세계적으로 존재하는 토양 서식균으로서(Purdy, 1979), 75과 278속 408종의 폭넓은 기주를 가지고 있는 경제적으로 중요한 식물 병원균이다 (Boland et al., 1994).
S. sclerotiorum은 토양전염 혹은 공기전염을 하는 병원균으로 일반적으로 자낭포자를 통 해 전염을 하고 포장 간 전반에 중요한 역할을 하며 균핵 형태 혹은 감염된 기주 식물체 조직 내의 균사체에 의한 전염이 이루어지고, 균핵 밀도의 증가는 병 발생 증가의 원인이 된다(Abawi & Grogan, 1979; Schwartz & Steadman, 1978; Kora et al., 2003).
우리나라의 경우 고랭지 채소재배지, 십자화과 채소재배지, 시설재배지에서 주로 발병된 다고 보고되어 있다(Cho, 1976; Kim et al., 1999, 2003, 2006; Shin et al., 1987).
S. sclerotiorum에 의한 균핵병 중 상추균핵병은 미국에서 1890년에 보고되었고(Subbarao, 1998), 우리나라에서는 1976년에 처음 보고되었다(Kim, 1976). 미국과 유럽에서는 S. sclero- tiorum이 자낭포자를 통해 주로 감염되는 것으로 보고되었다(Abawi & Grogan, 1975; Whipps et al., 2002). 상추를 생산하는 주요 국가에서는 상추 균핵병이 수량손실을 야기하는 중요한 병으로 알려져 있으며, 미국에서는 매년 1-75%의 작물손실을 일으키는 병으로 알려져 있다 (Purdy, 1979). 국내에서 연중 생산되는 상추는 주로 시설 내에서 재배되며, 연작과 늦가을 부터 초봄에 이르는 겨울철의 저온다습한 시설내의 환경은 균핵병의 발생을 조장하여 농 가에 경제적 피해를 주고 있다(Chang & Kim, 2003; Kim & Cho, 2002). 국내외적으로 균핵 병의 방제를 위해 다양한 농약을 이용한 방제 연구가 많이 이루어져 왔으나, 잔류농약 문 제와 친환경농산물에 대한 수요가 급증함에 따라 화학적 방제를 대신할 다양한 방법들이 연구되고 있다. 이와 관련하여 생물학적 방제에 대한 관심과 연구가 증가하고 있는 추세이 다(Bardin & Huang, 2001). 국내에서도 상추 균핵병의 방제를 위한 길항세균의 선발과 방제효 과에 대한 보고가 있었다(Kim et al., 2004; Hwang et al., 2006). 또한 과수에서 S. sclerotiorum 에 의한 포도나무 균핵병에 대한 발생보고가 되어 있으나(Boland & Hall, 1994; Hall et al., 2002; Latorre & Guerrero, 2001), 우리나라에는 아직까지 발생보고가 없다(KSPP, 2004).
또한 과수 오디나무에서 오디 균핵병은 S. sclerotiorum균이 야기 시키는 것으로 보고되었 으나, 실제 우리나라에서 균핵병의 병원균은 자낭반의 형태에 따라 컵모양의 자낭반을 가 진 Ciboria shiraiana, 곤봉 모양의 자낭반을 가진 Scleromitrula shiraiana로 동정되었고, 지역 에 따라서도 다소 차이가 있는 것으로 보고되었다(Hong et al., 2007).
과채류 균핵병 방제방법에는 화학적인 방법으로 지오판 수화제, 지오판 리프졸수화제 등 과 같은 보호살균제를 토양에 처리하여 균핵병 원인균을 억제하여 과채류의 감염률을 억 제하나, 토양에 토착되어 있는 병원균을 근본적으로 방제하지 못할 뿐만 아니라 주로 침투 성 살균제로서 식물 내에서 잔류 문제를 야기시킬 가능성이 높으므로, 잔류독성의 우려가 낮은 친환경농자재의 개발이 필요하다.
마두령과(쥐방울덩굴과; Aristolochiaceae) 식물인 이엽마두령은 6속 500종의 식물이 중국, 미얀마, 인도네시아, 인도차이나, 태국, 오세아니아의 숲과 저지대 덤불에서 주로 서식하며 우리나라에는 3속 4종 1변종이 있다. 이엽마두령 추출물은 항산화특성을 보이는 것으로 보 고되었으며(Thirugnanasampandan et al., 2008), 밤나방과 애벌레의 생육조절에 영향을 미치 는 것으로 보고되었다(Baskar et al., 2011).
따라서 이엽마두령(Aristolochia tagala Champ.)으로부터 Sclerotinia sclerotiorum에 항균활 성을 갖는 항균물질을 탐색하여 추후 친환경 농자재 개발에 이용하고자 본 연구를 수행하였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험재료
본 연구에 사용된 균핵병 병원균인 Sclerotinia sclerotiorum은 전북대학교 생명공학부 (Prof. 이귀재)에서 분양받아 경북대학교 대학원 생태환경시스템학과 식물자원환경전공 천 연물화학연구실에 보관하면서 배양하여 사용하였고, 식물재료인 이엽마두령(Aristolochia tagala Champ.)은 미얀마 약재상에서 구매하였다.
2. 시약 및 기기
용매분획과 silica gel column chromatography를 위한 MeOH, n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 등은 덕산약품공업(주)회사의 extra pure grade를 사용하였다. Bioassay에 사용된 PDA배지는 Becton, Dickinson & Co., paper disc는 Advantec사, Petri dish는 SPL사, silica gel (7734)은 Merck사 제품이었다. Gas chromatography-Mass spectrometry (GC-MS)는 Agilent의 7890A 기종을 사용하였고, column은 HP-5MS capillary를, detector는 Agilent 5975C를, library 는 Wiley (W9N08.L)를 사용하였다.
3. 실험 병원균의 배양조건
균핵병균의 배양 배지는 B.D사의 PDA를 1 L 조건으로 petri dish에 조제하였다. 병원균
(Sclerotinia sclerotiorum)은 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지의 중앙에 치상 시킨 후 18℃
로 배양 후 사용하였다.
4. MeOH 용매추출
건조시킨 이엽마두령 시료 3 kg를 blender를 이용하여 잘게 분쇄하여 99.5% MeOH로 실 온에서 24시간 침지 후 추출하였으며 MeOH 침지와 추출과정을 3회 반복하였다. 상등액을 여과지(Sanyo 185 ㎜ Ø, No 2, Japan)를 사용하여 고형물을 걸러내고 40℃에서 rotary eva- porator로 감압 ․ 농축 건조하여 MeOH 추출물(35.47 g)을 얻었다.
5. MeOH 추출물 용매분획
MeOH 추출물(35.47 g)을 증류수(H2O)에 현탁시킨 후 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH을 사용하여 순차적으로 용매분획해서 Hexane fraction (6.12 g), CHCl3 fraction (13.95 g), EtOAc fraction (2.51 g), BuOH fraction (2.52 g), Aqueous fraction (10.37 g)을 얻었다.
6. 생물검정
항균 활성 탐색을 위해 Kang et al. (2013)의 방법을 응용하여 고압 멸균한 PDA배지를 Petri dish (90×15 mm)에 분주하여 평판배지를 만든 다음 완전히 굳히고, 추출물을 MeOH로 10,000 ppm 또는 1,000 ppm으로 만들어 Paper disc (∅8 mm)에 50 µl씩 점적하였다. MeOH 이 완전히 휘발된 다음 PDA 평판배지 가장자리에 Paper disc를 치상하였다. 시험 균주는 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지 중앙에 치상하고, 18℃ incubator에서 각각의 시험균주 가 다 자랄 때까지 배양하였다. 균이 다 자라면 clean zone의 형성유무를 확인하여 항균 활 성 여부를 조사하였다.
분리한 화합물의 균핵병 생육억제능을 평가하기 위해서는 고압멸균 한 PDA 배지에 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 0 ppm 농도로 화합물을 첨가하여 Petri dish (90×15 mm)에 분주 평판 배지를 만들었다. 평판배지를 완전히 굳히고 Cork borer (8 mm)로 채취한 시험 균주를 배지 중앙에 치상하여 18℃ incubator에서 균주의 생장속도를 보며 항균 활성 여부를 조사하였다.
7. Chloroform fraction의 정제
활성이 우수한 chloroform fraction의 활성물질을 탐색하기 위하여 Silica gel (Merck 7734, 700 g)을 glass column (50 mmØ × 860 mm)에 충진시킨 후 CHCl3 fraction (13.95 g)을
chloroform에 용해시켜 column chromatograph에 charge하였다. CHCl3 : Methanol (1, 10, 20, 30... 50% in CHCl3, v/v)의 용매계로 순차용출(step-wise) 시켜 43개의 subfractions (MYHS1, MYHS2, .... MYHS43)를 얻었다.
8. MYHS26 subfraction의 항균 활성물질 탐색
생물검정에서 활성을 나타낸 MYHS26 subfraction을 GC-MS로 분석하였다. Flow rate는 0.9 ml/min (He)이였으며 시료는 1,000 ppm 농도로 조제하여 auto sampler를 사용하여 1 µl 를 주입하여 분석하였다. GC-MS에서 얻어진 peak를 Wiley library Data base와 비교하였고 이를 통해 MYHS26 subfraction에 함유된 물질들의 화학구조를 동정하였다.
Ⅲ. 결과 및 고찰
균핵병의 원인균인 S. sclerotiorum에 대한 이엽마두령(Aristolochia tagala Champ.)추출물 의 용매분획의 항균활성을 조사한 결과, CHCl3 fraction에서 가장 강한 항균활성을 보였으 며 EtOAc fraction에서도 약하게 활성을 보였다(Fig. 1).
Fig. 1. Antibacterial activities of MeOH extract and solvent fractions of Aristolochia tagala Champ. extract against Sclerotinia sclerotiorum. (C) Control; (MeOH) methanol extract; (Hex) hexane fraction; (CHCl3) chloroform fraction; (EtOAc) ethylacetate fraction; (BuOH) butanol fraction; (AQ) aqueous layer.
CHCl3 fraction을 silica gel column chromatography에 충진하고 용매계(CHCl3 : Methanol)로
step-wise 방법으로 용출하여 분획별 300 ml 씩 총 43개의 subfractions (MYHS1, MYHS2, ....
MYHS43)를 얻었다. 이들 43개의 subfractions를 대상으로 항균활성을 조사한 결과, MYHS26 subfraction에서 가장 강한 활성을 나타내었다.
MYHS26 subfraction의 주요화합물을 구명하고자 GC-MS로 분석한 결과 GC chromatogram 은 Fig. 2와 같았다.
Fig. 2. GC Chromatogram data of MYHS26 subfraction.
MYHS26 subfraction의 GC Chromatogram에서 검출된 peak들 중에서 활성물질로 추정되는 화합물의 화학적 구조를 구명하고자 peak들의 MS spectra와 Wiley library를 비교하는 방식 으로 profiling 하였다. 그 결과 MYHS26 subfraction의 GC Chromatogram에서 A peak (Rt 11.166 min)는 2,4-di-tetra-butyl-phenol 화합물로(Fig. 3), B peak (Rt 22.776 min)는 2-mono- palmitin 화합물로 (Fig. 4), C peak (Rt 24.367 min)는 1-mono-stearin 화합물로(Fig. 5) 동정되 었다.
Fig. 3. Mass spectra of A peak (ⓐ) and 2,4-di-tetra-butyl-phenol (ⓑ) in Wiley library.
Fig. 4. Mass spectra of B peak (ⓐ) and 2-mono-palmitin (ⓑ) in Wiley library.
Fig. 5. Mass spectra of C peak (ⓐ) and 1-mono-stearin (ⓑ) in Wiley library.
검출된 화합물(Fig. 6) 중에 1-mono-stearin이 항균활성물질로 추정되어 1-mono-stearin의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품 1-mono-stearin을 구매하여 PDA 배지에 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 0 ppm 농도로 화합물을 첨가한 배지에 시험균주를 배지 중앙에 치상하여 약 액배지혼합방법으로 항균활성을 검정하였다. 검정결과 100 ppm과 50 ppm 농도에서 균핵병 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum균이 완벽하게 생육억제됨을 관찰할 수 있었으며 25 ppm에 서도 생육억제능 활성을 나타내었다(Fig. 7). 따라서 본 연구에서는 이엽마두령으로부터 분 리한 1-mono-stearin 화합물이 활성물질인 것으로 추정되었으며, 항균력이 강한 이엽마두령 추출물 또는 1-mono-stearin 화합물을 주성분으로 하는 추출물을 채소류 균핵병에 대한 친 환경농자재의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Fig. 6. Chemical structures detected from Chloroform fraction of Aristolochia tagala Champ.
Ⅰ. 2,4-di-tetra-butyl-phenol, Ⅱ. 2-mono-palmitin, Ⅲ. 1-mono-stearin.
A
B
C
D
Fig. 7. Antibacterial activity of 1-mono-stearin against Sclerotinia sclerotiorum. (A) Control;
(B) 100 ppm 1-mono-stearin; (C) 50 ppm 1-mono-stearin; (D) 25 ppm 1-mono-stearin.
Ⅳ. 적 요
본 연구는 균핵병의 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum에 대해 항균활성을 갖는 친환경 유 기농자재를 개발할 목적으로 이엽마두령(Aristolochia tagala Champ.)으로부터 활성물질 분 리하였다. 이엽마두령을 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 가장 강한 활성을 나타낸 CHCl3 fraction을 column chromatography로 분리하여 43개의 subfraction을 얻 었다. 43개의 subfraction을 bioassay한 결과 MYHS26 subfraction에서 강한 활성을 나타내었 다. MYHS26 subfraction을 GC-MS로 분석하여 chromatogram 상의 주요 peak에 해당하는 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, 2,4-di-tetra-butyl-phenol, 2-mono- palmitin, 1-mono-stearin이 주요 물질로 검출되었다. 항균활성물질로 추정되는 1-mono-stearin 화합물의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품을 사용하여 생물검정한 결과 이 화합물이 강한 활성을 나타내었다. 따라서 이엽마두령으로부터 분리한 1-mono-stearin 화합물이 균핵 병의 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum에 대한 항균 활성물질인 것으로 추정되었다.
[Submitted, November. 6, 2015; Revised, November. 12, 2015; Accepted, November. 16, 2015]
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