Abstract
Scanning electron microscope/energy-dispersive X-ray spectroscopy (SEM/EDX) is a rapid, non-destructive, and multi-elemental analytical technique used for the elemental analysis and chemical characterization of the selected surface of the sample. In this study, the elemental concentration ratios of four cicada's exuviae including Cicadidae Periostracum [Cryptotympana atrata (Fabricius, 1775), Hyalessa maculaticollis (Motschulsky, 1866), Meimuna opalifera (Walker, 1850), and Platypleura kaempferi (Fabricius, 1794)] were analyzed using SEM/EDX for the first time. C, O, Cl, and K were found in all studied species. However, S and Mg were only found in H. maculaticollis and P. kaempferi, respectively. The results imply that this SEM/EDX technique could be used and applied as a crucial potential tool, analyze both microstructure and element, and manage the quality of the distributed medicinal medicines.
이용한 선퇴 기원종 및 근연 분류군의 조성 분석 연구
송준호 선임연구원, 양선규 기술연구원, 김욱진 기술연구원, 최고야 선임연구원, 문병철 책임연구원*
한국한의학연구원 한약자원연구센터
Studies on element analysis of the original species, Cryptotympana atrata as a Cicadidae Periostracum and related species using scanning electron microscope/
energy-dispersive X-ray spectroscopy (SEM/EDX)
Jun-Ho Song, Sungyu Yang, Wook Jin Kim, Goya Choi, Byeong Cheol Moon*
Herbal Medicine Resources Research Center, Korean Institute of Oriental Medicine
Keywords: Cicadidae Periostracum, energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX), element analysis,
Cryptotympana atrata, scanning electron microscope (SEM), X-ray mapping
서론
주사전자현미경/에너지분산형 엑스선분광기[Scanning Electron Microscope/Energy-dispersive X-ray spectroscopy (SEM/EDX)]는 대표적인 표면 분석 장비로, 전자빔에서 생성된 전자가 해당 시 료 표면에 도달하였을 때 나오는 2 차 전자를 검출하여 이미지를 형성함으로써, 표면의 미세구조, 형태, 크기 등의 물리학적 정보를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 해당 표면의 구성 성분을 관측하여 화학적 정보를 함께 획득할 수 있는 비파괴 분석법이다1,2). SEM/EDX 검출법은 생물시료에서부터 광물, 입자, 금속, 미네랄 등 다양한 형태의 시료를 분석할 수 있으며, 전처리 시간이 짧고 간편한 장점으로, 최근 들어 생물학뿐만 아니라 분석학(analytics)3), 금속학(metallurgy)4), 문화재과학(science of cultural heritage)5), 화석학(paleotology)6), 과학수사학(scientific criminal investigation)7,8) 등 다양한 분야에 서 형태 및 조성 분석을 위해 사용되고 있다.
특히, 인도의 polyherbal formulation 인 Avipattikar churna 제제의 표준화9), 인도 전통의약인 Naga bhasma 의 물리·화학적 특성 분석10), Samagandhak Kajjali 입자 분석을 통한 품질관리11) 등 SEM/EDX 검출법을 이용하여 전통의약품 및 생약제제의 조성 확인과 품질관리, 표준화 시도가 꾸준히 이루어지고 있다. 하지만, 현재까지 국내 한의·본초학 분야에서는 SEM/EDX 검출법을 이용한 유통 한약재 및 한약재 기원종 분석 접근이 이루어진 바 없다. 이에 본 연구에서는 동의보감 충부약재 중 한 품목인 선퇴(蟬退, Cicadidae Periostracum)의 기원종 말매미[Cryptotympana atrata (Fabricius, 1775)]와 근연 분류군의 분석을 시도하여, 향후 식물, 광물 등 다른 본초 소재로의 연구 확장뿐만 아니라 유통 약재의 표준화 및 안정성 검증 등을 위한 추가적 접근의 가능성을 확인하고자 하였다.
본론
1. 재료 및 방법
1) 연구 재료
본 연구를 위해 선퇴의 기원종인 말매미[C. atrata (Fabricius, 1775)]와 모두 매미아과(Cicadinae Latreille, 1802)에 속해 근연종으로 분류되는 참매미[Hyalessa maculaticollis (Motschulsky, 1866)], 애매미[Meimuna opalifera (Walker, 1850)], 털매미[Platypleura kaempferi (Fabricius, 1794)]의 탈 피각을 각각 대전 유성구 지족동, 경기 광명시 철산동, 전북 정읍시, 대전 유성구 지족동에서 직접 채집하여 관찰하였다. 실험에 사용된 재료는 다음의 관리번호를 부여하고, 약재 증거표본으로 한국한 의학연구원 한약표준표본관(Herbarium code KIOM)에 보관하였다: 말매미(2-19-0006), 참매미 (2-19-0007), 애매미(2-19-0131), 털매미(2-19-0130). 연구에는 형태학적 형질 분석 및 유전자 분 석12)을 통해 정확히 동정된 개체를 사용하였다.
Instruments Ltd., UK)를 이용하여 백금(Pt)으로 2 분간 이온 증착 후 관찰하였다. 관찰 기기로는 에너 지분산형 엑스선 분광기(EDX; Oxford Instruments, 80 mm2 X-ManN Silicon Drift Detector)가 부착 된 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM; JSM-7600F, JEOL, Japan)으로 가속전력 15kV, 작동 거리 (working distance) 8~10mm 에서 검경하였다.
2. 결과
국내에 서식하는 말매미와 근연 분류군인 참매미, 애매미, 털매미 총 4 종 탈피각 표면의 조성 분석을 시도하였다(Figs. 1-2; Table 1).
Table 1. Comparison of elemental concentration obtained by EDX in four Cicada exuvia surface (weight %) Element Cryptotympana
atrata
Hyalessa maculaticollis
Meimuna opalifera
Platypleura kaempferi
C 73.65 78.15 76.42 74.54
O 24.61 21.19 22.78 24.00
Na 0.14 - - 0.27
Al 0.37 - 0.09 0.19
Si 0.43 - 0.10 0.23
Cl 0.18 0.12 0.14 0.17
K 0.31 0.32 0.30 0.19
Ca 0.14 0.22 - 0.19
Fe 0.16 - 0.13 0.16
S - 0.04 - -
Mg - - - 0.06
연구된 매미아과 탈피각 4 종의 정성적 조성 분석 결과, 총 11 개의 원소가 검출되었다(Table 1).
말매미 탈피각에서는 주요 검출 원소인 C 와 O 를 비롯하여 총 9 개 원소가 검출되었고, 참매미에서는 6 개 원소, 애매미 7 개 원소, 털매미에서 10 개 원소가 검출되었다. Pt 의 경우, 모든 종에서 검출되어 스펙트럼 그래프에 표현되었으나(Fig. 1), 전자현미경 검경 시 2 차 전지 발생 빈도를 높이기 위한 수단으로 Pt 로 이온증착을 수행하는 바, 정량 분석 시 제외하였다. 이에, 연구된 모든 종에서 C 와 O 의 상대적 함량이 70%, 20% 이상으로 대부분을 차지하였으며, 나머지 원소의 경우 1% 이내의 비율 로 조성의 차이를 나타냈다. Cl 과 K 는 미량이지만 모든 종에서 검출되었으며, S 와 Mg 는 각각 참매미 와 털매미의 탈피각에서만 검출되었다. 특히, 선퇴의 기원종인 말매미의 경우 X-ray maps 를 통해
Fig. 1. Electron images of exuvium surface and the spectra graphs of the present trace elements. A-B.
Cryptotympana atrata. C-D. Hyalessa maculaticollis. E-F. Meimuna opalifera. G-H. Platypleura kaempferi.
3. 고찰
본 연구 결과, 선퇴(蟬退, Cicadidae Periostracum)의 기원종인 말매미와 근연 분류군인 참매미, 애매 미, 털매미 총 4 종 탈피각 표면의 주요 조성 및 비율을 확인하였으며, 중금속을 포함한 원소 성분의 함유 여부를 파악하였다.
SEM/EDX 검출법은 해당 시료의 미세형태와 구성 성분, 즉 물리·화학적 정보를 동시에 획득할 수 있다는 장점으로, 쉽고 빠르게 시료 표면 구조와 조성을 스크리닝할 수 있다. 선퇴의 기원종인 말매미 를 포함한 4 종의 탈피각 분석을 통해 곤충시료 표면의 미세형태를 확인할 수 있었고, 구성 조성에 대한 정성적, 정량적 분석의 가능성을 확인하였다. 탈피각은 주로 키틴질(chitin)로 구성된 유기체13) 로, 연구된 시료 모두에서 대부분 C 와 O 가 검출됨을 확인하였다. 한편, Mg 을 제외한 전체 조성에서
성분과 비율이 유사하게 검출된 말매미와 털매미의 경우, 대전광역시 유성구 지족동 인근의 동일지역 에서 채집된 분류군으로 확인되어, 해당 서식 지역의 환경조건이 표면 성분 조성에 영향을 끼칠 수 있음을 확인하였다. 매미는 미성숙한 유충으로 땅 속에서 생활하는 기간이 1~6 년, 길게는 13 년 또는 17 년으로 전 생활사 중 가장 길어14,15), 탈피각 표면의 조성이 해당 서식지의 토양 환경에 큰 영향을 받을 것으로 판단된다. 특히, 미량이지만 중금속으로 분류되는 Al 과 Fe 가 참매미를 제외한 3 종에서 검출되어 SEM/EDX 검출법이 중금속 여부의 판단에도 효과적인 것으로 판단되었다. 추후 중국에서 재배되어 국내에 유통되고 있는 약재에 대한 분석과 모니터링을 통해 해당 약재의 중금속 오염도를 파악할 필요가 있겠다. 또한, 다양한 지역별 탈피각 표면 비교·분석뿐만 아니라 해당 지역 토양시료
Fig. 2. X-ray maps of elemental distribution of the exuvium surface in Cryptotympana atrata. C, Carbon; Si,
Silicon; Pt, Platinum; O, Oxygen; Al, Aluminium; Cl, Chlorine; K, Potassium; Na, Sodium; Ca, Calcium.
로 지닌 성분으로 인한 독성 문제뿐만 아니라 재배토양, 수질 등 환경오염이나 제조과정에서 축적되는 유해중금속에 인해 발생하기도 한다. 이에 국내에서는 중금속을 비롯한 유통 한약재의 유해물질 모니 터링이 지속적으로 수행되고 있다.16-18) SEM/EDX 검출법은 다양한 중금속을 경제적이고 간편하게 검출 할 수 있어, 품질 관리를 위한 스크리닝에 적극 활용될 수 있을 것으로 판단하였다. 다만, 본 검출법은 시료 표면의 조성 검출에 최적화된 기법으로 표면에 전자빔의 주사력에 따라 차이를 나타낼 수 있으며, 시료 내부에 함유된 성분을 검출하기에는 어려움이 있다. 이에, 유도 결합 플라즈마 질량분 석기[Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (ICP-MS)], 에너지분산형 형광엑스선분석기 [Energy Dispersive X-Ray Florescence (ED-XRF)] 등을 이용한 추가 분석을 통해 보다 정확한 성분 규명이 수반되어야 할 것이다. 또한, 해당 소재의 해당 목적에 따라 가장 경제적이고, 효과적인 분석·검 출법을 이용해야 할 것이다.
본 연구 결과, 매미류 탈피각 표면에서 총 11 개의 원소가 검출되었으며, 중금속 일부가 검출되었다.
SEM/EDX 검출법은 간단하고, 경제적인 비파괴적 기법으로 단시간에 해당 시료 내 중금속과 성분 조성의 정량·정성 분석이 가능하다. 본 연구를 통해 추후 유통 한약재의 품질 관리, 원산지 판별 등에 SEM/EDX 검출법이 활용될 수 있을 것으로 판단하였다.
결론
주사전자현미경/에너지분산형 엑스선분광기(SEM/EDX)를 이용하여 충부약재 선퇴의 기원종, 말매 미와 근연 분류군을 포함한 총 4 종의 탈피각 표면 조성 분석을 시도하였다.
1. 연구된 매미류 탈피각 4 종의 정성적 조성 분석 결과, 중금속으로 분류되는 Al 과 Fe 을 포함한 총 11 개의 원소가 검출되었다.
2. SEM/EDX 검출법은 중금속을 비롯한 시료 표면 조성의 정량·정성 분석이 가능한 간단하고 경제 적인 기법이다.
3. 한의·본초학 분야에서 SEM/EDX 검출법을 최초로 시도하였으며, 추후 유통 한약재의 품질 관리, 원산지 판별 등에 추가적인 기법으로 활용될 수 있을 것이다.
감사의 글
본 연구는 한국한의학연구원 주요사업 「동의보감 충부약재 활용기반 구축」 과제(KSN1812410)의 지원으로 수행되었습니다.
참고문헌
1. Heslop-Harrison JS. Energy Dispersive X-Ray Analysis. In: Linskens HF and Jackson JF (ed s.), Physical Methods in Plant Sciences. Modern Methods of Plant Analysis. Vol. 11. Heidelber g:Springer. 1990:244-77.
2. Garratt-Reed AJ and Bell DC. Energy-Dispersive X-ray Analysis in the Electron Microscope.
Oxford:BIOS Scientific Publisher. 2003.
Savary V, Setyan A and Wenger JC Scanning electron microscopy-energy dispersive X-ray spectrometry (SEM-EDX) and aerosol time-of-flight mass spectrometry (ATOFMS) single par ticle analysis of metallurgy plant emissions. Environmental Pollution. 2016;210:9-17.
5. Choi SC, Kim SD, Yi YH, Ko SR and Ham SW. Studies on analysis of Joseon lacquer layer.
Journal of Conservation Science. 2011;27(4):71-380.
6. Hartl C, Schmidt AR, Heinrichs J, Seyfullah LJ, Schäfer N, Gröhn C, Rikkinen J and Kaasalaine n U. Lichen preservation in amber: morphology, ultrastructure, chemofossils, and taphonomic alteration. Fossil Record. 2015;18(2):127-35.
7. Williams KS and Simon C. The ecology, behavior, and evolution of periodical cicadas. Annual Review of Entomology. 1995;40(1):269–95.
8. 박원석, 김형승, 전충현. 주사전자 현미경/에너지 분산형 X-선 검출 분광기(SEM/EDS)를 이용한 뇌관화약 잔사분석법의 유효성 확인. 과학수사학회지. 2013;7:185-94.
9. Kumar KJ and Nandi M. Energy dispersive X-ray spectroscopy in quality control of powdered herbal formulation-avipattikar churna. Research and Education in Indian Medicine. 2012;18 (1):7-11.
10. Nagarajan S, Pemiah B, Krishnan UM, Rajan KS, Krishnaswamy S and Sethuraman S. Physico -chemical characterization of lead based Indian traditional medicine—Naga bhasma. Internat ional Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2012;4(2):69-74.
11. Thakur KS, Vahalia MK, Jonnalagadda VG, Rashmi K, Nadkarni SD, Gudi RV and Shitut SS.
Evaluation of structural, chemical characterisation and safety studies of Samagandhak Kajjal i, an Indian traditional ayurvedic drug. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. 2014;
2(6):57-67.
12. Song JH, Kim WJ, Cha JM, Yang S, Choi G and Moon BC. Comparative morphological, ultrastr uctural, and molecular studies of four Cicadinae species using exuvial legs. Insects. 2019;10 (7):199.
13. Tada T, Ohnishi K, Suzuki K, Tomita H, Okamori M, Katuzaki H, Komiya T, Imai K. Potential Cosmetic Whitening Agents from Insect Cuticle: Tyrosinase Inhibitory Activity of N-Acetyld opamine Dimers from Exuviae of Cicada, Cryptotympana tustulata Fabr. Journal of Oleo Scie nce. 2002;51(5):355-8.
14. Lee YJ. Cicada of Korea. Seoul: Geobook (in Korean with some English text). 2005.
15. Williams KS and Simon C. The ecology, behavior, and evolution of periodical cicadas. Annual Review of Entomology. 1995;40(1):269–95.
약재의 약용부위에 따른 유해중금속 분포. 분석과학 2009;22(6):504-13.
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