蘇子藥鍼이 Type 1 Hypersensitivity에 미치는 영향
송세훈1⋅송춘호1
1동의대학교 한의과대학 경혈학교실
Effect of Semen Perillae herbal acupuncture on the type 1 hypersensitivity
Se-Hoon Song1, Choon-Ho Song1
1Dept. of Meridian & Acupoint, College of Oriental Medicine, Dong-Eui University Abstract
Objectives : We studied on anti-allergic effects of Semen Perillae Herbal Acupuncture(SPHA) and Semen Perillae Herbal Acupuncture Solution(SP).
Methods : In vivo, Animals were herbal-acupunctured SPHA at both ST36 three times for 5 days. Then, we investigated compound 48/80-induced active systemic anaphylaxis (ASA) using ICR mice and anti-DNP IgE-induced passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using Sprague Dawley rat. In vitro, we measured cell viability, b-hexosaminidase release, IL-4 and TNF-a from RBL-2H3 cells after treatment of SP of various concentrations.
Results : In vivo, SPHA pretreatments at both ST36 inhibited compound 48/80-induced ASA.
PCA was inhibited by SPHA pretreatments at both ST36 and optional points. In vitro, SP treatments were not affect on cell viability and inhibited b-hexosaminidase release, IL-4 and TNF-a.
Conclusions : These results suggest that SPHA and SP may be beneficial in the inhibition of allergic inflammatory response.
Key words : Semen Perillae, herbal acupuncture, allergy, RBL-2H3 cell
Ⅰ. 緖 論
알러지 疾患은 環境的, 遺傳的 問題가 複 雜하게 聯關되어 發病되며, 人體에 無害한 外部環境에 대해 敏感한 反應을 보이면서 持續的인 呼吸器系 또는 皮膚 症狀 등으로 日常生活의 불편함은 물론 情緖的인 면에도
惡影響을 미치지만 아직까지 明確한 治療法 이 提示되지 못하고 있다1).
藥鍼療法은 鍼灸, 經絡과 本草理論에 의하 여 各種의 韓藥材를 일정한 방법으로 調製한 후 經穴 등에 注入하여 刺鍼과 藥物效果를 바탕으로 疾病을 치료하는 新鍼療法이다2,3).
蘇子는 꿀풀과(Labiate)에 속한 1년생 草 木인 차조기의 成熟한 種子로, 性味는 辛溫 無毒하고 降氣消痰, 定喘活腸하는 效能이 있 어 慢性氣管支炎과 氣管支喘息 등의 呼吸器 疾患에 應用되고 있다4).
⋅교신저자 : 송춘호, 부산시 부산진구 양정2동 산45 동의대학교 한의과대학 경혈학교실, Tel. 051-850-8643, Fax.
051-853-4036, E-mail: [email protected]
․ 이 논문은 2007학년도 동의대학교 교내연구비에 의해 연구되었음 (과제번호 2007AA123).
․ 투고 : 2008/03/03 심사 : 2008/03/07 채택 : 2008/03/21
足三里(ST36)는 足陽明胃經의 合土穴로 理脾胃, 調中氣, 疏風化濕, 通調經絡, 調和氣 血, 扶正培元, 祛邪防病하는 效能이 있어 주 로 消化, 循環, 呼吸, 泌尿生殖系統疾患 등에 효과를 나타내며, 또한 全身强壯의 要穴로 臨床的으로 가장 많이 活用되는 穴 중의 하 나이다5).
蘇子를 이용한 실험적 硏究로 강 등6)의 가미소자강기탕이 알레르기 천식의 호흡양 상 및 기관조직의 호산구침윤에 미치는 영 향, 김 등7)의 소자강기탕 및 소자도담강기 탕이 1형 및 4형 알러지 반응과 폐혈전색전 에 미치는 영향 등에서 蘇子가 君藥인 蘇子 降氣湯 및 蘇子導痰降氣湯의 抗알러지 效果 가 報告되었으며, 백 등8)은 胡桃藥鍼의 抗 알러지 效果를 報告하였고 김 등9)은 黃芩藥 鍼의 type 1 hypersensitivity 억제효과를 報 告하였으나 抗알러지에 蘇子藥鍼을 이용한 硏究는 아직 활발하지 못한 실정이다.
이에 알러지 疾患에 대한 蘇子藥鍼의 活 用 可能性을 살펴보고 蘇子의 效能에 대한 根據를 마련하고자 알러지 疾患모델을 이용 하여 蘇子藥鍼의 足三里(ST36) 處置에 대한 效果를 살펴보고, 蘇子抽出物의 rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3)에 서 b-hexosaminidase, interleukin (IL)-4와 tumor necrosis factor-alpha (TNF-a)에 대 한 影響을 照査하여 有意한 結果를 얻었기 에 報告하는 바이다.
Ⅱ. 材料 및 方法 1. 材料
1) 蘇子 藥鍼液 (SP)
본 실험에 사용된 蘇子는 (주)광명제약에 서 구입하여 사용하였으며, 약침액은 대한약 침학회의 약침조제방법에 따라 조제하였다.
간략히 설명하면 다음과 같다. 소자 300g을 증류수로 水洗하여 1L의 25% ethanol을 加 하여 10시간 동안 실온에서 추출하였다. 추 출된 용액을 원심분리를 통하여 상층액을 분리하고, 0.2mm 여과지에서 여과하여 rotary evaporator로 200㎖가 되도록 減壓濃 縮하였다. 실온에서 냉각시킨 뒤 감압필터를 사용하여 불순물을 제거하고 고압멸균하여 -20℃에 보관하였다가 실험직전 생리식염수 나 배지에 희석하여 사용하였다.
Table 1. Sem en Perillae
韓藥名 生藥名 重 量(g)
蘇 子 Semen Perillae 300 g
2) 실험동물
실험에 사용한 동물은 ICR계 mouse (male, 30 ± 2 g)와 Sprague Dawley계 rat (male, 200 ± 20 g)을 (주)샘타코 바이오 코리아에서 구입해서 사용했으며, 사육은 온 도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 5%, dark/light(12 시간) 조건 하에서 고형 pellet 사료와 물은 자유 섭취하도록 하였으며, 구입 후 2주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하 였다.
3) 세포주
RBL-2H3 cell은 한국세포주은행(Korea
Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양 하였다.
4) 藥鍼器
藥鍼器는 30 gauge insulin syringe (Becton Dickinson, USA)를 사용하였다.
5) 시약
본 실험에 사용된 compound 48/80, anti- deoxynucleoprotein (DNP) immunoglobulin E (IgE), DNP-HSA, Evans blue, KOH, acetone, phosphoric acid, acetic acid, PMA (phorbol-12-myristate-13 acetate), A23187 (calcium ionophore) 및 LPS (Lipopolysaccharide) 는 Sigma로부터, FBS (fetal bovine serum), penicillin, streptomycin, DMEM (Dulbecco's modification Eagle medium) 및 trypsin-EDTA solution은 Gibco BRL로부터, tetrazolium bromide salt (MTT) 및 dimethylsulfoxide (DMSO)는 Amresco로부터, Interleukin (IL)-4 와 Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-a) kit는 BD Biosciences Pharmingen으로부터 구입하여 사용하였다.
2. 方法
1) 검액의 처치
검액은 前脛骨筋과 長趾伸筋과의 사이인 인체 外膝眼의 下方 3寸 부위에 相應하는 양쪽 足三里(ST36) 부위와 임의의 부위인 둔부(OP)에 각각 처치하였다.
2) 실험군의 구성
실험군은 대조군(CON), 생리식염수군 (SS36), 蘇子藥鍼群(SPS36)과 蘇子藥鍼任意 穴群(SPOP)으로 구분하였다. CON은 아무 런 처치를 하지 않은 군, SS36은 양쪽 足三 里에 각각 25㎕의 생리식염수를, SPS36은 양쪽 足三里에 각각 25㎕의 蘇子藥鍼을, SPOP는 둔부 任意穴에 동량의 蘇子藥鍼을 격일로 3회 처치하였다.
3) Active systemic anaphylaxis (ASA)
ICR mouse 10마리를 1군으로 하여 실험 군 별로 약침 처치 부위를 제모한 후 격일 로 3회의 약침을 처치하였다. 마지막 처치 1 시간 경과 후 compound 48/80(8mg/kg, Sigma)을 복강 내에 투여하고 mouse의 치 사율을 60분 동안 관찰하였다.
4) Passive cutaneous anaphylaxis (PCA)
IgE 의존형 피부과민반응에 대한 영향을 알아보기 위하여 Katayama 등10)의 방법에 준하여 Sprague Dawley 계 rat 3마리를 1군 으로 하고 실험군 별로 5일간 격일로 총3회 의 藥鍼을 처치하였다. 실험 3일째 되는 날 rat의 다리 부위를 제모하고 0.5mg의 anti-DNP IgE를 네 군데 피하주사한 후 감 작된 부위를 표시하였다. 48시간 경과 후 DNP-HSA 0.5mg과 4% evans blue를 1:1로 혼합하여 mouse의 미정맥에 주사하였다. 30 분 후 mouse를 도살하고 청색으로 착색된 등 부위의 피부를 채취하여 1 N KOH용액 100 ㎕에 침적시켜 37℃에서 24시간 방치하
였다. Acetone과 phosphoric acid(5:13) 혼합 액 900 ㎕를 첨가하여 원심분리한 후 상층 액을 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5) 세포 배양
RBL-2H3과 Raw264.7 cell은 한국세포주 은행(KCLB)에서 분양받았으며 세포의 배 양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (Gibco BRL, USA) 배양액에서 배 양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현 상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-EDTA solution (Gibco BRL, USA)을 처리하여 세 포를 부유시킨 다음 계대 배양하였다.
6) MTT assay
RBL-2H3 cell을 24 well plate(Corning, USA)에 2 × 105 cell/㎖의 세포수가 되도록 DMEM 배양액에 분주하여 24시간동안 안 정화시킨 후, 蘇子藥鍼液을 농도 (0%, 0.5%, 1% 및 5%)별로 처리한 후 1시간 동 안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5㎎/㎖
의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 최대 4시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO 를 300㎕ 씩 분주하여 well에 생성된 formazin 이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹 인 후 96 well plate에 150㎕ 씩 옮긴 후 ELISA (Molecular Devices, USA)를 사용하 여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회
의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 오차 를 구하였다.
7) b-Hexosaminidase release
b-Hexosaminidase의 release는 Dastych 등
11)과 Schwartz 등12)의 방법에 의해 측정하 였다. 간략히 요약하면 RBL-2H3을 10%
FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 24 well plate에 각 well당 2 x 105개의 세포가 들어가도록 한 다음 37℃ 5% CO2 incubator 에서 하룻밤 배양한다. 각 well의 세포들을 extracellular buffer (5mM KCl, 12.5mM NaCl, 20mM HEPES, 1.5mM MgCl, 1.5 mM CaCl2, 1mM dextros, pH7.4) 로 2 번 세척한 다음 각 well 당 extracellular buffer 와 蘇子藥鍼液(0%, 1%, 및 2%)을 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 이후 PMA (50 nM)와 A23187 (1mM)을 사용하여 세포를 37℃ 5% CO2 incubator에 1시간 반응시키 고 ice bath에서 10분 동안 배양한 후 반응 을 종결시켰다. Supernatant 20㎕를 96 well plate에 옮기고, pellet은 Triton X-100 (0.1%) 1㎖을 24 well에 넣고 녹인 후 96 well에 20㎕ 넣는다. supernatant와 pellet이 담긴 96 well에 substrate buffer (4-p- Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide 1 mM, sodium citrate 0.05M, pH4.5) 100㎕을 넣고 37℃ 에서 1시간 배양시킨 다음 각 well 당 stop solution 200㎕을 첨가하여 반 응을 종결시켰다. ELISA를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료와 대조 구의 흡광도 값으로 다음 식에 의해 net percent release (%)를 산출하였다.
net percent release(%) = [S/(S+P)-Scontrol/ (Scontrol+Pcontrol)]×100
S : supernatant, P : pellet
Scontrol/(Scontrol+Pcontrol)(%) is spontaneous release of mediator without a stimulus
8) IL-4 assay
RBL-2H3 cell을 6 well plate에 5 × 105 cell/well의 농도로 분주한 후 24시간 배양한 다음 새로운 DMEM 배지에 蘇子藥鍼液 (0%, 1% 및 2%)을 처리하였다. 1시간동안 배양한 후 A23187 (1 μM)을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 처리하고 8시 간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 상층 액을 분리하여 5,000rpm에서 2분 동안 원심 분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하 였다가 IL-4 kit (BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다.
ELISA를 사용하여 450㎚에서 흡광도를 측 정하여 누출된 IL-4의 양을 계산하였다.
9) TNF-a assay
RBL-2H3 cell을 6 well plate에 5 × 105 cell/well의 농도로 분주한 후 24시간동안 배양한 다음 새로운 DMEM배지에 蘇子藥 鍼液(0%, 1% 및 2%)을 처리하였다. 1시간 동안 배양한 후 자극제 A23187 (1 μM)를 처리하고 8시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 TNF-a kit (BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여
측정하였다. ELISA를 사용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하여 누출된 TNF-a의 양을 계산하였다.
10) 統計 분석
成績은 SPSS 12.0K for Windows 통계 프 로그램 패키지를 사용하여 평균치 ± 표준오 차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였 다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Scheffe test 검정을 실시하 였다.
Ⅲ. 結 果
1. ASA에 미치는 영향
Compound 48/80에 의한 ASA에서 CON 은 100%의 치사율을 보인데 비해, SS36은 90%의 치사율을 보였으며, SPS36은 50%의 치사율을 보였으며, SPOP는 80%의 치사율 을 보였다(Table 2).
Table 2. Effects of SPHA on the active systemic anaphylaxis (ASA) in mice
Group Treatment Acupoints Lethal rate (%)
CON – – 100
SS36 Saline ST36 90 SPS36 SPHA ST36 50
SPOP SPHA OP 80
SPHA: Semen Perillae herbal acupuncture CON: Untreated group
SS36: Group treated at both sides of ST36 with saline 1 hour before compound 48/80 injection (8mg/kg, i.p.) SPS36: Group treated at both sides of ST36 with 100% SP herbal acupuncture 1 hour before compound 48/80 injection
SPOP: Group treated at optional points (OPs) with 100% SP herbal acupuncture 1 hour before compound 48/80 injection
2. PCA에 미치는 영향
Anti-DNP IgE를 이용한 PCA에서 청색 반의 누출량은 CON은 88.67 ± ㎍/㎖으로 나타났다. 반면 SS36은 84.80 ± 2.07㎍/㎖, SPS36은 67.75 ± 3.93 ㎍/㎖, SPOP는 68.00
± 2.05㎍/㎖로 SPS36과 SPOP는 CON에 비 해 유의성 있는 감소를 보였다(Fig. 1).
Fig. 1. Effects of SPHA on the passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in rats. Rats were acupunctured at both sides of ST36 or OPs with saline or SP herbal acupuncture 3 times for 5 days every other days. On day3, Rats were passively sensitized by i.d. injection of anti-DNP IgE (0.5mg), and challenged by DNP-HSA (0.5mg, i.v.) containing 4% Evans blue after 48 hours.
The areas of dye were measured after sacrificing the animals later 30 minutes from antigen challenge. Each column represents the mean ± S.E.
* P<0.05: Significant as compared to the CON SPHA: Semen Perillae herbal acupuncture CON: Untreated group
SS36: Group treated at both sides of ST36 with saline 1 hour before compound 48/80 injection (8 mg/kg, i.p.)
SPS36: Group treated at both sides of ST36 with 100% SP herbal acupuncture 1 hour before compound 48/80 injection
SPOP: Group treated at optional points (OPs) with 100% SP herbal acupuncture 1 hour before compound 48/80 injection
3. MTT assay
RBL-2H3 cell의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다.
아무런 처리를 하지 않은 RBL-2H3 cell에 서 3.32 ± 0.14의 흡광도를 나타내었으며, 蘇 子藥鍼液을 0.5%, 1% 및 5%의 농도로 처 리한 세포에서 각각 3.74 ± 0.18, 3.69 ± 0.02 및 3.77 ± 0.22의 흡광도를 나타내어 모 든 농도에서 정상세포에 비해 유의한 영향 을 보이지 않았다(Fig. 2).
Fig. 2. Effects of SP on the cell viability of RBL-2H3 cells. Each column represents the mean ± S.E. of 3 independent experiments.
The absorbance was measured at 540 nm using ELISA reader.
Each column represents the mean ± S.E.
*, P<0.05: Significant as compared to the untreated group
SP: Semen Perillae herbal acupuncture solution
4. b-Hexosaminidase release
RBL-2H3 cell에서 누출된 b-hexosaminidase 의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 23.57 ± 0.64 %이었으며, PMA 와 A23187로 자극한 세포에서 40.41 ± 1.29%로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한
(p<0.05) 증가를 나타내었다. 반면 蘇子藥鍼 液을 1% 및 2%의 농도로 처리한 후 PMA 와 A23187로 자극한 세포에서 각각 26.28
± 0.63% 및 24.86 ± 1.16%로 蘇子藥鍼液을 처리한 각 농도에서 PMA와 A23187로 자극 한 세포에 비해 유의한(p<0.05) 감소를 보였 다(Fig. 3).
Fig. 3. Effects of SP on the b-Hexosaminidase release from RBL-2H3 cells. Each column represents the mean ± S.E. of 3 independent experiments.
The absorbance was measured at 405 nm using ELISA reader.
Release (%) = S/(S+P) x 100, S : supernant, P : pellet
#, P<0.05: Significant as compared to the untreated group
*, P<0.05: Significant as compared to the PMA+A23187-stimulated group
SP: Semen Perillae herbal acupuncture solution
5. IL-4 assay
RBL-2H3 cell에서 분비된 IL-4의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 4.50 ± 0.29pg/ml이었으며, A23187로 자극한 세포에 서 1043.89 ± 20.14pg/㎖로 아무런 처리를
하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.005) 증 가를 나타내었다. 반면 蘇子藥鍼液을 1% 및 2%의 농도로 처리한 후 A23187로 자극한 세포에서 각각 900.77± 21.11pg/㎖, 및 28.65
± 1.65pg/㎖로 2%의 농도에서 A23187로 자 극한 세포에 비해 유의한(p<0.05) 감소를 보 였다(Fig. 4).
Fig. 4. Effects of SP on the IL-4 release from RBL-2H3 cells. Each column represents the mean
± S.E. of 3 independent experiments.
The absorbance was measured at 450 nm using ELISA reader.
#, P<0.05: Significant as compared to the untreated group
*, P<0.05: Significant as compared to the A23187-stimulated group
SP: Semen Perillae herbal acupuncture solution
6. TNF-a assay
RBL-2H3 cell에서 분비된 TNF-a의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 7.25 ± 0.48pg/ml이었으며, A23187로 자극한 세포에 서 999.48 ± 30.50pg/㎖로 아무런 처리를 하 지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.05) 증가를 나타내었다. 반면 蘇子藥鍼液을 1% 및 2%
의 농도로 처리한 후 A23187로 자극한 세포
에서 각각 224.20 ± 3.81pg/㎖ 및 58.21 ± 1.23pg/㎖로 蘇子藥鍼液 각 농도에서 A23187로 자극한 세포에 비해 유의한 (p<0.05) 감소를 보였다(Fig. 5).
Fig. 5. Effects of SP on the TNF-a release from RBL-2H3 cells. Each column represents the mean
± S.E. of 3 independent experiments.
The absorbance was measured at 450 nm using ELISA reader.
#, P<0.05: Significant as compared to the untreated group
*, P<0.05: Significant as compared to the A23187-stimulated group
SP: Semen Perillae herbal acupuncture solution
Ⅳ. 考 察
알러지(Allergy)란 그리스어인 ‘allos’에서 由來되었다고 하며 이는 ‘變形된 것’을 意味 한다. 1906년 프랑스 학자 폰 피케르가 처음 으로 알러지란 用語를 使用하였으며 이는 보통 대부분의 사람에게서는 아무런 문제도 일으키지 않는 물질이 어떤 사람에게만 두 드러기, 鼻炎, 喘息 등 異常 過敏反應을 일 으키는 것을 말한다. 過敏免疫反應 또는 알 러지란 用語는 外部로부터 들어온 抗原이
體內에서 免疫反應에 의해 除去되는 과정에 서 正常的인 反應과는 달리 宿主에 오히려 해로운 影響을 미치게 될 때 일컫는 것이다.
최근 室內生活의 증가, 室內吸煙, 자동차 排 氣가스 증가, 新素材의 개발, 外國으로부터 의 異物質 流入 등과 같은 알러지 誘發 物 質의 急增으로 인해, 우리나라도 아토피 皮 膚炎, 알러지 鼻炎, 氣管支 喘息 患者의 수 가 급격히 증가하고 있다13).
蘇子는 꿀풀과(Labiate)에 속한 1년생 草 木인 차조기의 成熟한 種子이다. 蘇子는 黃 褐色 또는 暗褐色의 粒子인데 直徑이 약 1.5mm이며, 그 100粒의 重量은 대략 0.2g에 不過하고 主性分은 精油, 灰分, 糖分과 비타 민 B2 등이다. 性은 溫하고 潤하여 下降하 는 性質이 있고 味는 辛하며 肺經에 歸經한 다. 蘇子는 降氣消痰, 下氣定喘, 寬胸解鬱, 滑腸의 效能이 있어 주로 呼吸困難, 胸膈滿 悶, 痰喘, 氣滯痰壅을 隨伴하는 咳嗽 같은 肺氣上逆의 症狀을 다스리며, 臨床에서 알러 지와 관련된 氣管支喘息, 氣管支炎, 鼻炎 등 의 肺疾患에 活用된다4-17).
蘇子는 上氣咳逆을 主하고 中焦를 調節하 며 五臟을 이롭게 하고 氣를 내리며 霍亂과 反胃를 멈추게 하고 大小便을 순조롭게 하 며 기침을 멈추게 하고 心, 肺를 윤택하게 하며 痰氣를 삭히고 肺氣喘急을 治療한다고 하였으며, 蘇子는 蘇葉과 더불어 효과가 같 은데 風氣를 發散하는데는 마땅히 葉을 사 용하고 上下를 淸利하는데는 마땅히 子를 사용한다고 하였다,18,19). 이로써 蘇子는 降氣 또는 下氣하는 작용이 있어 上氣咳逆, 肺氣 喘急 등의 上氣되는 症狀을 다스리고 上下
를 淸利하는 작용이 있으므로 氣管支喘息, 呼吸困難, 皮膚發赤, 搔癢 등의 알러지 疾患 症狀에 응용할 수 있음을 文獻的으로 살필 수 있다.
蘇子에 대한 實驗的 硏究를 보면 강 등6) 의 가미소자강기탕이 알레르기 천식의 호흡 양상 및 기관조직의 호산구침윤에 미치는 영향, 김 등7)의 소자강기탕 및 소자도담강 기탕이 1형 및 4형 알러지 반응과 폐혈전색 전에 미치는 영향 등에서 蘇子를 君藥으로 하는 蘇子降氣湯 및 蘇子導痰降氣湯의 抗알 러지 效果가 報告되었으며, 백 등8)은 胡桃 藥鍼의 抗알러지 效果를 報告하였고 김 등9) 은 黃芩藥鍼의 type 1 hypersensitivity 억제 효과를 報告하였으나 蘇子藥鍼의 抗알러지 效果에 대한 硏究報告는 활발하지 못한 실 정이다.
최근의 鍼灸治療는 다양한 방법으로 개발 되어 여러 가지 新鍼療法들이 응용되고 있 는데, 특히 藥鍼療法은 經穴에 刺鍼하여 經 絡의 기능을 조절함으로써 精神氣血, 五臟六 腑의 疾病을 치료하는 鍼灸, 經絡經穴學의 이론과 韓藥의 氣味, 性狀, 作用을 살펴 임 상 치료효율을 극대화시키고 藥物을 인체의 기관이나 병소에 접근, 작용시키는 기전을 연구하는 本草學의 이론을 결합시킨 療法으 로, 이는 選用된 藥物을 經絡學說의 原理에 의거하여 穴位나 壓痛點 혹은 體表의 觸診 으로 얻어진 陽性反應點에 注入함으로써 生 體의 機能을 調節하고 病理狀態를 改善시켜 疾病治療의 목적을 달성하려는 방법으로 藥 效의 발생이 빠르고 藥物의 胃腸管 破壞를 방지하며 內服이 힘든 환자에게도 사용이
가능한 장점이 있어, 최근 들어 그 臨床 應 用範圍가 擴大되고 있다2-22).
본 實驗에서 選擇한 足三里(ST36)는 免疫 機能을 强化시킬 수 있는 經穴 中의 하나23) 로 足陽明胃經에 屬하며 穴位는 膝下三寸 脛骨外廉大筋 兩筋肉分間이고, 回陽九鍼穴, 六腑下合穴, 四總穴, 中風七處穴 中의 하나 이며, 調氣血, 理脾胃, 補虛弱하는 機能이 있 어 알러지 疾患, 皮膚가려움증, 消化器系疾 患, 膝關節痛, 乳房痛, 虛弱體質, 貧血, 眞氣 不足, 産後血暈 등에 應用되고, 五行에서 陽 土에 해당하는 胃經의 合土穴로 人體의 精 神氣血과 生理作用을 全體的으로 調節하여 臨床的으로 가장 많이 활용되는 穴 중의 하 나이다5-24).
楊25)은 “人年三十已上, 若不灸三里, 令人 氣上沖目.”, “氣在於腸胃者 取之足太陰陽明, 不下者取之三里.”, “氣逆上霍亂者, 取三里, 氣下乃止, 不下復治.”, “胃脘當心而痛, 上支 兩脇, 飮食不下, 取三里補之.” 라고 하여 足 三里가 下氣하는 作用이 있다고 하였다25). 本實驗에서는 足三里가 免疫을 强化시킬 수 있는 經穴 중의 하나이고, 下氣하는 作用과 中焦를 調節하여 上下不通을 治療하는 作用 이 있어 알러지 疾患의 症狀 改善에 效果的 일 것으로 보아 足三里를 選穴하였다.
過敏反應은 그 과정에서 생성되고 관여하 는 활성 분자에 따라 여러 가지 형태로 나 뉘는데 관련된 기전이나 세포 그리고 분자 요소 등에 따라 크게 4개의 그룹으로 나누 어 분류한 Gell과 Coombs에 의한 분류가 대표적이다. 제1형 과민반응은 가장 흔한 과 민성 질환으로 IgE 항체에 의해서 발생하
며, IgE 이외의 항체는 염증세포들을 불러 들이고 활성화시키며 또한 정상 세포 기능 을 방해함으로써 조직 손상을 일으킬 수 있 다. 이들 항체 중 일부는 특정 세포나 세포 외 바탕질에 존재하는 항원에 특이적이며, 이들 세포나 조직에 결합된 상태나 혈중에 서 자유 항체로 발견되는데 이러한 항체에 의해 야기되는 질환을 제2형 과민반응 질환 이라 한다. 다른 항체들은 혈중에서 면역 복 합체를 형성하여 혈관 같은 조직에 침착하 여 조직 손상을 일으키며, 이러한 면역 복합 체에 의해 야기되는 질환을 제3형 과민반응 질환이라 한다. 마지막으로 지연형 과민반응 의 작동 기전을 활성화시키는 T 림프구에 의해 조직 손상이 생기는 경우를 제4형 과 민반응 질환으로 분류한다26,27).
Type 1 hypersensitivity 또는 IgE-mediated hypersensitivity는 allergen이라 불리는 특이 항원에 의해 야기된다. 이 allergen에 의해 많은 양의 IgE가 생성되고, 이 항체는 조직 내의 mast cell이나 혈중의 basophil의 표면 에 있는 Fc receptor와 강한 결합을 한다.
이렇게 감작된 mast cell이나 basophil은 이 차적으로 체내에 들어온 allergen과 항원-항 체반응을 일으켜 세포의 탈과립을 일으키게 된다. 이들 과립으로부터 분비된 활성화 분 자들은 여러 가지 생물학적 또는 약리학적 작용으로 체내에서 여러 반응을 일으키는데, 그 활성화 분자들의 분비량이나 상황에 따 라 국소적 또는 전신적 반응을 일으키게 된 다28).
Type 1 hypersensitivity에서 mast cell 및 basophil의 탈과립에 대한 蘇子藥鍼의 효과
를 관찰하기 위하여 ASA 반응과 PCA 반응 을 실시하였다.
ASA 반응은 즉시형 전신성 아나필락시스 반응으로 알러지 반응 개시 수 분 이내에 발생하여 심하면 사망에 까지 이르는 것으 로 알러지 실험모델로 많이 사용되고 있다.
ASA 반응은 때로는 치명적일 수도 있는데 type 1 hypersensitivity 반응 시작 후 수분 내에 일어나며, 벌에 쏘였거나 개미에 물렸 을 때나 페니실린이나 인슐린 등의 약제 또 는 해산물이나 견과류 등의 다양한 항원에 의해서 일어난다. 본 실험에서는 대표적인 mast cell degranulator인 compound 48/80을 이용해서 이 반응을 유도하였다.
PCA 반응은 수동피부면역반응으로 특정 원인물질에 대한 알러지 소인의 유무를 검 사하는 방법으로 임상에서 많이 사용되고 있는 방법이다. 이미 생성된 IgE 항체를 피 부에 주입하여 48시간동안 감작한 후 원인 물질에 노출시켜 알러지 증상의 발현 정도 를 살펴보는 방법이다. PCA 반응은 국소성 아나필락시스 반응으로 피부 감작성을 갖는 항체를 검출하는 극히 예민한 방법이다. 항 체의 양, 특이성, 항원의 구조, 즉시형 알러 지 반응의 발현이나 억제 기전 등 각각의 면역기구 검토에 응용되는 방법이다. 동물의 피부를 미리 항체로서 수동감작한 후 항원 을 투여하여 유발시킨 피부국소의 즉시형 알러지 반응으로 항원 투여 시에 Evans blue를 함께 정맥주사하고 알러지 반응에 의한 피부 미소혈관의 투과성 항진에 의한 누출 색소반으로 판정한다. 이 색소반은 항 체가 결합하고 있는 mast cell에서 항원 항
체 반응이 일어나 히스타민 등의 화학적 매 개물질 등이 유리되어 국소 아나필락시스가 초래된 결과이다. 따라서 본 연구에서는 이 두 가지 동물모델을 사용하여 알러지 반응 에 대한 억제효과를 조사하였다.
ASA를 유도하기 위해 사용된 compound 48/80은 혼합 다당체 성분으로 세포내 Ca2+
을 증가시키거나, 비만세포의 세포막 및 수 용체에 작용하여 세포내로의 Ca2+유입을 증 가시켜 비만세포의 탈과립을 유도한다29).
본 硏究는 알러지 疾患에 대한 蘇子의 效 能과 藥鍼應用의 可能性을 검증하고자 알러 지 動物모델과 RBL-2H3 cell을 使用하여 蘇子藥鍼의 處置와 蘇子抽出物이 알러지 反 應을 效果的으로 抑制할 수 있는지 조사하 였다.
Compound 48/80에 의한 ASA에서 CON 은 100%의 치사율을 보인데 비해, SS36은 90%의 치사율을 보였으며 SPS36과 SPOP 는 각각 50%와 80%의 치사율을 보였다 (Table 2).
Anti-DNP IgE를 이용한 PCA에서 청색 반의 누출량은 CON에 비해 SS36에서는 유의성 있는 변화를 보이지 않았으나 SPS36 과 SPOP에서는 유의성 있는 감소를 나타내 었다(Fig. 1).
이러한 결과는 足三里에 대한 蘇子藥鍼의 처치가 알러지 반응을 억제하는 효과가 다 른 군에 비해 우수하다는 것을 나타낸다. 또 한 OP가 CON에 비해 유의한 억제효과를 나타내는 것으로 볼 때 蘇子의 本草學的 약 리효과에 기인한 결과로 판단된다. 이러한 결과는 蘇子藥鍼이 compound 48/80과 IgE
면역반응에 의한 비만세포의 탈과립을 억제 하고 혈관 투과성을 억제한 결과라고 생각 된다.
알러지 반응의 유발에서 가장 핵심적인 역할을 하는 세포는 호염기구와 비만세포이 며 IgE항체가 세포막 표면에는 FceRI이 수 용체와 교차결합하고 비만세포의 활성화가 시작되면 세포질 내 과립의 팽창과 탈과립 이 발생한다. 이 외에 호염기구와 비만세포 를 활성화시키는 기전이 존재하는데 외부자 극과 약물 등에 의한 Ca2+의 세포내 유입에 의해 탈과립이 발생한다. 본 연구에서 in vitro 실험에 사용된 PMA 및 A23187는 비 만세포를 자극하여 세포내 Ca2+유입과 증가 를 유도하는데 증가된 Ca2+은 비만세포를 활성화시키는 필수적인 매개인자로 여겨지 고 있다30).
비만세포의 탈과립에 의해 유출되거나 세 포막지질에서 새로 합성되는 대표적인 물질 은 histamine, leukotriene, IL-3, IL-4, IL-5, TNF-a 등으로 IgE 항체생산, 기관지평활근 의 수축, 점막 표면에 대한 선세포의 분비 항진 작용 등을 나타내어 즉시형 알러지 및 염증반응을 일으켜 알러지 초기 반응을 유 도한다31).
RBL-2H3 cell은 mucosal type mast cell 과 유사한 특징들을 나타내고, 세포표면에 수십만 개의 IgE수용체가 존재한다. IgE에 감작된 후에 이 세포는 항원에 반응하고 histamine을 방출하는데 b-hexosaminidase는 비만세포의 분비과립에 저장되어 있다가, 비 만세포가 면역학적으로 활성화될때 histamine 과 함께 부수적으로 분비되므로 b-hexosaminidase
의 활성화는 비만세포 탈과립의 표지인자로
사용된다32,33). 따라서 RBL-2H3 cell은
histamine과 b-hexosaminidase 분비에 알려 지지 않은 약물의 효과를 연구하는데 좋은 실험모델로 알려져 있다.
본 실험에서 蘇子抽出物이 RBL-2H3 cell 의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하 여 MTT assay를 실시한 결과 아무런 처리 를 하지 않은 RBL-2H3 cell에서 3.32 ± 0.14의 흡광도를 나타내었으며, 蘇子抽出物 을 0.5%, 1% 및 5%의 농도를 처리한 세 포에서 각각 3.74 ± 0.18, 3.69 ± 0.02 및 3.77 ± 0.22의 흡광도를 나타내어 모든 농도 에서 정상세포에 비해 유의한 영향을 보이 지 않았다(Fig. 2).
RBL-2H3 cell에서 분비된 b-hexosaminidase 의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에 서 23.57 ± 0.64 %이었으며, PMA 와 A23187로 자극한 세포에서 40.41 ± 1.29%로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의 한(p<0.05) 증가를 나타내었다. 반면 PMA 와 A23187로 자극한 후 蘇子藥鍼液을 1%
및 2%의 농도로 처리한 세포에서 각각 26.28 ± 0.63% 및 24.86 ± 1.16%로 蘇子藥 鍼液을 처리한 각 농도에서 PMA와 A23187 로 자극한 세포에 비해 유의한(p<0.05) 감소 를 보였다(Fig. 3).
비만세포 및 알러지 면역반응과 관련된 세포에서 분비되는 cytokine의 조절을 통해 알러지 반응을 억제할 수 있다. IL-4는 즉시 형 과민반응의 매개자인 IgE와 비만세포 매 개성 면역반응의 조절자로 IL-4의 생산 증 가는 알러지의 발생에 중추적인 것으로 알
려져 있다. 또한 IL-4는 내피세포상에 있는 혈관세포부착분자(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) 등과 같은 일부 부착 분자의 발현을 자극하여 lymphocyte, 단핵 구, 그리고 호산구의 결합을 증가시켜 염증 반응을 유발한다34).
TNF-a는 면역반응의 초기에 분비되는 pro-inflammatory cytokine으로 천식이나 류 마티스관절염 등 여러 가지 질환에서의 염 증반응 조절에 관여하는 것으로 알려져 있 다35).
비만세포에서 유리된 TNF-a는 국소의 혈 관내피세포에 작용하여 ELAM-1의 발현 및 백혈구의 혈관외 유주를 유도하는 것으로 특히 알러지 국소의 염증반응에 중요한 역 할을 하고 있다36). 알러지 반응이 시작되면 비만세포가 탈과립되면서 내부의 TNF-a는 히스타민 및 다른 염증매개인자들과 함께 유출되어 증상을 더욱 악화시킨다.
RBL-2H3 cell에서 분비된 IL-4의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 4.50 ± 0.29pg/ml이었으며, A23187로 자극한 세포에 서 1043.89 ± 20.14pg/㎖로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.005) 증 가를 나타내었다. 반면 A23187로 자극한 후 蘇子藥鍼液을 1% 및 2%의 농도로 처리한 세포에서 각각 900.77 ± 21.11pg/㎖, 및 28.65 ± 1.65pg/㎖로 2%의 농도에서 A23187 로 자극한 세포에 비해 유의한(p<0.05) 감소 를 보였다(Fig 4).
RBL-2H3 cell에서 분비된 TNF-a의 양은 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 7.25 ± 0.48pg/ml이었으며, A23187로 자극한
세포에서 999.48 ± 30.50pg/㎖로 아무런 처 리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.05) 증가를 나타내었다. 반면 A23187로 자극한 후 蘇子藥鍼液을 1% 및 2%의 농도로 처 리한 세포에서 각각 224.20 ± 3.81pg/㎖ 및 58.21 ± 1.23pg/㎖로 蘇子藥鍼液 각 농도에 서 A23187로 자극한 세포에 비해 유의한 (p<0.05) 감소를 보였다(Fig. 5).
이러한 結果는 蘇子抽出物이 PMA 및 A23187로 자극한 RBL-2H3 cell에서 IL-4와 TNF-a의 발현을 억제하여 염증을 억제하는 기전을 가지고 있음을 보여 준다.
따라서 이번 硏究 結果에서 蘇子藥鍼의 足三里 처치와 蘇子抽出物의 RBL-2H3 cell 처치는 알러지 반응을 억제시킴을 알 수 있 었으며, 蘇子藥鍼이 알러지 疾患치료에 응용 가능할 것으로 생각된다.
Ⅴ. 結 論
蘇子藥鍼이 type 1 hypersensitivity에 미 치는 영향을 연구한 결과 다음과 같은 結論 을 얻었다.
1. 蘇子藥鍼의 처치는 compound 48/80 으로 유발된 ASA를 억제하는 효과가 관찰되었 다.
2. 蘇子藥鍼의 처치는 Anti-DNP IgE를 이 용한 PCA에서 유의성 있는 청색반의 누 출량 감소를 나타내었다.
3. 蘇子抽出物의 처치는 1%와 2%의 처리농 도에서 RBL-2H3 세포의 b-hexosaminidase 분비를 억제하는 효과를 나타내었다.
4. 蘇子抽出物의 처치는 1%와 2%의 처리농 도에서 RBL-2H3 세포의 IL-4 분비를 억 제하는 효과를 나타내었다.
5. 蘇子抽出物의 처치는 1%와 2%의 처리농 도에서 RBL-2H3 세포의 TNF-a 분비를 억제하는 효과를 나타내었다.
參考文獻
1. 丁奎萬. 알레르기와 韓方. 서울 : 圖書出 版 第一路. 1993 : 59.
2. 대한약침학회. 약침요법 시술지침서. 서울 : 한성인쇄. 1999 : 13-4, 112-8, 138-203.
3. 邢玉瑞, 袁志敏, 烏桂文. 약침요법. 서울 : 일중사. 1999 : 17-9.
4. 신민교 편저. 원색임상본초학. 서울 : 도 서출판 남산당. 1986 : 566, 633, 645.
5. 최용태 외. 침구학(상). 서울 : 집문당.
1998 : 382-414.
6. 강락원, 박동일. 가미소자강기탕이 알레르 기천식의 호흡양상 및 기관조직의 호산구 침윤에 미치는 영향. 동의한의연. 2000 ; 4(1) : 5-17.
7. 김영태, 정승기, 이진구. 소자강기탕 및 소자도담강기탕이 1형 및 4형 알레르기 반응과 폐혈전색전에 미치는 영향. 경희 의학. 1988 ; 4(4) : 432-40.
8. 백승일, 이용태, 장경전. 폐수, 격수의 호 도약침자극이 알레르기 반응에 미치는 영향. 대한침구학회지. 2003 ; 20(4) : 180-91.
9. 김유승, 송춘호. 黃芩藥鍼이 Type 1 Hypersensitivity에 미치는 영향. 2006 ;
23(3) : 111-22.
10. Katayama S, Shionoya H, Ohtake S. A new method for extraction of extravasated dye in the skin and the influence of fasting stress on passive cutaneous allergy in guinea pigs and rats. Microbiol. Immunol. 1978 ; 22 : 89-101.
11. Dastych J, Walczak-Drzewiecka A, Wyczolkowska J, Metcalfe DD. Murine mast cells exposed to mercuric chloride release granule-associated N-acetyl-beta -d-hexosaminidase and secrete IL-4 and TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 1999 ; 103 : 1108-14.
12. Schwartz LB, Austen KF, Wasserman SI.
Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 1979 ; 123 : 1445-50.
13. 박승찬. 한방으로 끝내는 천식, 아토피, 알러지. 서울 : 매일건강신문사 출판부.
2003 : 15-7.
14. 신길구. 신씨본초학(각론). 서울 : 수문 사. 1988 : 484-5.
15. 이상인, 안덕균. 한약임상응용. 서울 : 성보사. 1986 : 478-9.
16. 전국한의과대학 본초학편찬위원회. 본초 학. 서울 : 영민사. 2004 : 520-1.
17. 黃宮繡. 本草求眞. 臺北. 宏業書局有限公 社. 1981 : 73-4.
18. 許浚. 東醫寶鑑. 서울 : 大星文化社.
1981 : 211-2.
19. 李時珍. 本草綱目. 北京 : 人民衛生出版 社. 1982 : 920-3.
20. 전국한의과대학침구경혈학교실 편. 침구 학. 서울 : 집문당. 1988 : 382-4, 489-90, 1457-61.
21. 제건홍, 하동매 편저. 혈위약물주사요법.
남창. 강서과학기술출판사. 1989 : 1-8.
22. 곽동경. 혈위주사료법. 香港 : 상무인서 관. 1975 : 27-31.
23. 서범석. 면역과 관련된 수혈 고찰. 대전 대 논문집. 1994 ; 2(2) : 133-61.
24. 안영기. 경혈학총서. 서울 : 성보사.
1995 : 196-7.
25. 楊繼洲. 『鍼灸大成』. 臺北. 啓業書局.
1987 : 767-71.
26. 강태숙, 김선희, 김영권, 김윤희, 김인환, 김충환 외. 임상면역학. 서울 : 청구문화 사. 2005 : 281-92.
27. Abbas AK, Lichtman AH. 세포분자면 역학. 5판. 서울 : 범문사. 2004 : 411-2.
28. Tharp MD. IgE and immediate hypersensitivity.
Dermatologic Clinics. 1990 ; 8(4) : 619-31.
29. Dainaka J, Ichikawa A, Koibuchi Y, Nakagawa M, Tomita K. Effect of the tridecamer of compound 48/80, a Ca2+-dependent histamine releaser, on phospholipid metabolism during the early stage of histamine release from rat mast cells. Biochem Pharmacol.
1986 ; 35(21) : 3739-44.
30. White DH, Pluzmik K, Ishizaka T.
Antigen-induced increase in protein
kinase C activity in plasma membrane of mast cells. Proc. Nati. Acad. Sci.
USA 1986 ; 82 : 8139-97.
31. 김형민. 면역과 알레르기. 서울 : 신일상 사. 1998 : 159-73.
32. Marquardt DL, Wasserman SI. Modulation of rat serosal mast cell biochemistry by in vivo dexamethasone administration. J Immunol. 1983 : 131(2) : 934-9.
33. Mastuda H, Morikawa T, Ueda K, Managi H, Yoshikawa M. Structural requirements of flavonoids for inhibition of antigen- Induced degranulation, TNF-alpha and IL-4 production from RBL-2H3 cells.
Bioorg Med Chem. 2002 ; 10(10) : 3123-8.
34. Ikura M, Yamaguchi M, Hirai K, Miyamasu M, Yamada H, Nakajima T et al. Regulation of surface FcepsilonRI expression on human eosinophils by IL-4 and IgE. Int Arch Allergy Immunol. 2001 ; 124(4) : 470-7.
35. Stankiewicz W, Dabrowski MP, Chcialowski A, Plusa T. Cellular and cytokine immunoregulation in patients with chronic obstructive pulmonary disease and bronchial asthma. Mediators Inflamm. 2002 ; 11(5) : 307-12.
36. 이중달. 그림으로 설명한 병리학. 서울 : 고려의학. 1991 : 29.
