The scavenging effect on nitric oxide (NO) in juglandis semen herbal<br /> acupunture solution

호도약침액의 Nitric Oxide (NO)에 대한 소거효과

손창완

ㆍ이경민

ㆍ이봉효

ㆍ임성철

ㆍ정태영

ㆍ서정철

1대구한의대학교 한의과대학 침구경혈학교실

The scavenging effect on nitric oxide (NO) in juglandis semen herbal acupunture solution

Chang-Wan Son

, Kyung-Min Lee

, Bong-Hyo Lee

, Seong-Chul Lim

, Tae-Young Jung

, Jung-Chul Seo

1

Dept. of Acupuncture & Moxibustion, College of Oriental Medicine, Daeguhaany University Abstract

Objectives : Free radical metabolism seems to occupy a remarkably common position in the mechanisms of aging and aging related disease. This study was designed to find out whether Juglandis Semen herbal acupuncture solution (JSHAS) can scavenge Nitric Oxide (NO) or not.

Methods : SNAP was used as NO generator. NO concentration was estimated after 2, 6, 12 and 24 hrs in no treatment group, after treatment with Vitamin C or 1, 10, 100 ㎍/㎖ of JSHAS.

Results : There was no significant scavenging effect of JSHAS on NO after 2, 6 hrs but significant effect on NO in 10, 100 ㎍/㎖ group after 12hrs. After 24 hrs, there was a significant scavenging effect of JSHAS on NO in 1, 10, 100 ㎍/㎖ group.

Conclusions : These results suggest that JSHAS has scavenging effect on NO. This study shows that JSHAS can be used for aging related disease and further studies are required to investigate the antioxidative effects of it.

Key words ： Scavenging, Juglandis Semen, Herbal Acupunture, Nitric Oxide (NO)

Ⅰ. 緖 論

老化는 인간의 成長 및 成熟 과정 후 시 간이 흐름에 따라 나타나는 形態的, 機能的 인 衰退로 死亡에 歸着되는 生理的인 현상 으로, 인류의 수명이 연장되고 노령화 사회 로 발전됨에 따라 성인병과 노화에 대한 현

대인들의 관심이 증가되고 있다 ¹⁾ .

老化에 관한 학설로 DNA설, 내분비설, 화학 반응설, 면역설 등 여러 가지 제시되고 있는데 이 중 1956년 Harman ²⁾ 에 의해 제안 된 free radical 이론은 reactive oxygen(예컨 대 O 2 -

, HO, H 2 O 2 , O 2 , Nitric Oxide(NO) 등)의 인체의 내적 환경 변화를 일으키는 것이 老化의 촉진과 밀접한 관계가 있다는 점에서 최근 주목받고 있다. 이에 의해서 유 도되는 지질의 과산화 반응이 인체의 질병,

⋅교신저자 : 서정철, 대구시 수성구 상동 165번지 대구한의대학교 한의과대학 침구경혈학교실, Tel. 054-450-7707, Fax. 0505-245-9279, E-mail:

[email protected]

⋅투고 : 2007/03/03 심사 : 2007/03/07 채택 : 2007/03/12

노화현상과 밀접한 관계가 있는 것으로 보 고되고 있다 ^3,4) .

韓醫學에서 老化는 生, 長, 壯, 老, 死라는 인체의 생리적인 과정의 하나로 인식하고 있으며 虞 ⁵⁾ 가 “腎元盛則壽延 腎元衰則壽夭”

라고 하여 長壽하는 것이 腎氣의 盛衰與否 에 의해 결정된다고 하여 그 병리기전을 腎 虛의 관점에서 연구가 활발히 진행되고 있 다 ^6,7) .

胡桃(Juglandis Semen)는 胡桃科에 속한 호도나무의 種仁으로, 性味가 甘溫하고 腎․

肺經에 歸經하여 抗老衰, 滋腎固精, 滋養强 壯, 健腦, 溫肺定喘, 補氣養血 등의 효능이 있다. ^8,9) 胡桃에 대한 抗酸化 硏究로 김 등 ¹⁰⁾ 은 胡桃藥鍼液이 농도에 비례하여 腎臟組織 에서 oxidant에 의한 細胞損傷과 脂質의 過 酸化를 防止한다고 報告하였고, 김 등 ¹¹⁾ 은 胡桃藥鍼液이 H 2 O 2 의 생성을 방지 및 제거 하고 지질과산화를 방지한다고 報告하였으 나, 胡桃藥鍼液의 NO 消去를 통한 抗酸化 效果에 대한 報告는 미비한 실정이다.

이에 著者는 抗老衰, 滋腎固精 등의 效能 이 있는 胡桃藥鍼液의 抗酸化 作用을 관찰 하기 위해 NO 消去 실험을 한 結果를 다음 과 같이 報告하는 바이다.

II. 材料 및 方法

1. 材 料 1) 藥 材

本 實驗에서 사용한 胡桃 (Juglandis Semen, Juglans Sinensis Dode)는 영남약업

사(한국)에서 국산(충북 영동)을 구입하여 大邱韓醫大學校 本草學敎室에서 감정한 것 을 사용하였다.

2. 方 法

1) 胡桃藥鍼液의 製造

實驗에 사용한 胡桃藥鍼液은 胡桃 350 g 을 取해 粗末하여 圓底 flask에 넣고, 蒸溜 水 2,000 ㎖를 加한 後, 3時間 煎湯하여 抽 出하고 濾過하였다. 濾液은 rotary evapo- rator로 減壓濃縮하고 濃縮液에 蒸溜水를 加 하여 全量을 200 ㎖이 되도록 한 다음, 室溫 까지 冷却하고 ethanol을 加하여 75% etha- nol 溶液으로 되게 한 다음, 攪拌하고 低溫 에서 放置하여 生成된 沈澱物을 濾別하였다.

濾液을 다시 rotary evaporator로 減壓濃縮

한 濃縮液에 蒸溜水 100 ㎖를 加하고 溶解

시킨 後, ethanol을 加하여 85% ethanol 溶

液으로 되게 한 다음 攪拌하고 低溫에서 放

置하여 生成된 沈澱物을 濾別하였다. 濾液을

다시 rotary evaporator로 減壓濃縮한 濃縮

液에 蒸溜水 100 ㎖를 加하고 溶解시킨 後,

ethanol을 加하여 95% ethanol 溶液으로 되

게 한 다음 攪拌하고 低溫에서 放置하여 生

成된 沈澱物을 濾別하였다. 濾液을 다시 ro-

tary evaporator로 減壓濃縮하여 生成된 濃

縮液에 生理食鹽水를 加하고 1 N NaOH로

pH 6∼7로 調節하여 全量이 1,000 ㎖가 되

게 한 다음, 低溫에서 24時間 放置한 後 nu-

clepore filter(0.45 ㎛, 직경 25 ㎜, Millipore

Corp, Pleasanton, California, U.S.A.)로 濾

過하고 加壓滅菌하여 試料의 원액으로 使用

하였다.

2) Nitric Oxide(NO) 消去效果 測定

(1) NO 생성화합물

NO generator로는 S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP)를 사용하였다. 먼저 NaNO 2 1.63 g 을 증류수 20 ㎖에 녹였다. 20 ㎖의 methanol과 20 ㎖의 HCl을 섞어 1.91 g의 N-acetylpenicillamine를 녹였다. 후드 안에 서 NaNO 2 용액을 N-acetyl-penicillamine용 액에 2-3 ㎖씩 첨가하면서 dull green이 나 타나는지를 확인하면서 천천히 반응시켰다.

반응이 다 끝나면 濾過를 하여 濾過紙에 2-3일 동안 호일을 덮어 공기 중에서 건조 시켰다. 濾過紙에 남아 있는 분말을 수거하 여 다음 實驗에 사용하였다.

(2) NO 측정

Phosphate-buffered saline(PBS) 1 ㎖에 SNAP 500 uM를 첨가 한 후 비타민 C(Vit.

C)와 胡桃藥鍼液을 농도별로 添加한 후 CO 2 incuvator 37℃, 5% CO 2 , 95% O 2 조건 하에서 24시간 동안 培養하였다. 각 조건별 로 100 ㎕씩 3개씩 96-well plate를 사용하여 분주한 후 100 ㎕의 Griess용액을 添加하여 550 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다 ¹²⁾ . 이 때 NaNO 2 용액을 표준으로 하여 농도를 계 산하였다.

3) 統計處理

統計分析은 Statistical Package for Social Science Software SAS(version 8.2)를 사용하

였으며, DATA 분석은 Student's t-test를 이용하였고, 통계적인 유의성은 P<0.05로 하 였다. 모든 실험은 독립적으로 3번 이상 반 복하였고 mean± standard errors of means (SEM)로 나타내었다.

III. 結 果 1. NO 농도의 표준곡선

NO 농도의 표준곡선을 도출하기 위하여 다양한 농도(0.25, 0.125, 0.063, 0.031 uM) NaNO 2 용액을 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측 정하였다. 그 결과 NO 2 -

의 농도(y)는 흡광 도(x)에 비례하며 다음과 같은 식으로 나타 났다

y = 290.72x - 12.557

2. 2시간 경과 후 NO 消去效果

胡桃藥鍼液에 대하여 2시간 경과 후 NO 농도는 無處置群이 100.0±2.80%, Vit. C 處 置群은 65.7±4.20%로 無處置群에 비하여 유 의성있게 감소하였다(P<0.01). 그러나 胡桃 藥鍼液 1, 10, 100 ㎍/㎖ 處置群은 각각 98.6±2.16, 87.5±4.48, 93.6±5.05%로 나타나 無處置群에 비하여 유의성은 없었다(Fig.

1).

3. 6시간 경과 후 NO 消去效果

胡桃藥鍼液에 대하여 6시간 경과 후 NO

농도는 無處置群이 100.0±7.10%, Vit. C 處

置群은 51.8±3.30%로 無處置群에 비하여 유

의성있게 감소하였다(P<0.01). 그러나 胡桃

藥鍼液 1, 10, 100㎍/㎖ 處置群은 각각 101.3±1.24, 92.7±2.57, 87.0±2.90%로 나타나 無處置群에 비하여 유의성은 없었다(Fig. 2).

0 20 40 60 80 100 120

Control Vit. C JSD

100 ug/ml 10 ug/ml 1 ug/ml

**

Fig. 1. Nitrite ratio at 2 hours after 1 mM SNAP and herbal acupuncture solution treatment.

JSD(Juglans Sinensis Dode) herbal acu- puncture solution were treated at 100, 10 and 1 ㎍/㎖ of concentration. Each bar represents the mean (±SEM). (n=3).

These data were obtained from at least 3 time repetition. Significant differences cal- culated via student's t-test are marked with asterisks. **p<0.01 vs. control group.

Fig. 2. Nitrite ratio at 6 hours after 1 mM SNAP and herbal acupuncture solution treatment.

JSD(Juglans Sinensis Dode) herbal acu- puncture solution were treated at 100, 10 and 1 ㎍/㎖ of concentration. Each bar represents the mean (±SEM). (n=3).

These data were obtained from at least 3 time repetition. Significant differences cal- culated via student's t-test are marked with asterisks. **p<0.01 vs. control group.

0 20 40 60 80 100 120

Control Vit. C JSD

100 ug/ml 10 ug/ml 1 ug/ml

**

4. 12시간 경과 후 NO 消去效果

胡桃藥鍼液에 대하여 12시간 경과 후 NO 농도는 無處置群이 100.0±2.30%, Vit. C 處置 群은 45.3±2.20%로 無處置群에 비하여 유의성 있게 감소하였다(P<0.01). 胡桃藥鍼液 10, 100

㎍/㎖ 處置群은 각각 85.2±3.03, 81.4±2.02%로 無處置群에 비하여 유의성있게 감소하였다(각 각 P<0.05, P<0.01). 그러나 胡桃藥鍼液 1 ㎍/

㎖ 處置群은 각각 94.1±2.55%로 나타나 無處 置群에 비하여 유의성은 없었다(Fig. 3).

Fig. 3. Nitrite ratio at 12 hours after 1 mM SNAP and herbal acupuncture solution treatment.

JSD(Juglans Sinensis Dode) herbal acu- puncture solution were treated at 100, 10 and 1 ㎍/㎖ of concentration. Each bar represents the mean (±SEM). (n=3).

These data were obtained from at least 3 time repetition. Significant differences calculated via student's t-test are marked with asterisks. *p<0.05; **p<0.01 vs.

control group.

0 20 40 60 80 100 120

Control Vit. C JSD

100 ug/ml 10 ug/ml 1 ug/ml

**

** *

5. 24시간 경과 후 NO 消去效果

胡桃藥鍼液에 대하여 24시간 경과 후 NO

농도는 無處置群이 100.0±1.09%, Vit. C 處

置群은 24.8±2.27%로 無處置群에 비하여 유 의성있게 감소하였다(P<0.01). 胡桃藥鍼液 1, 10, 100 ㎍/㎖ 處置群은 각각 88.8±1.87, 80.1±2.32, 82.2±1.30%로 無處置群에 비하여 유의성있게 감소하였다(P<0.01)(Fig. 4).

Fig. 4. Nitrite ratio at 24 hours after 1 mM SNAP and herbal acupuncture solution treatment.

JSD(Juglans Sinensis Dode) herbal acupuncture solution were treated at 100, 10 and 1 ㎍/㎖ of concentration. Each bar represents the mean (± SEM). (n=3).

These data were obtained from at least 3 time repetition. Significant differences calculated via student's t-test are marked with asterisks. **p<0.01 vs. control group.

0 20 40 60 80 100 120

Control Vit. C JSD

100 ug/ml 10 ug/ml 1 ug/ml

**

**

**

**

IV. 考 察

인간은 생물이기 때문에 출생과 더불어 연령이 증가함에 따라 老化가 시작된다. 일 반적으로 老化란, 동물의 발육, 성장, 성숙과 노화의 생물학적 과정에서 형태적 기능적 퇴축, 예비력과 적응력의 저하로 사망에 귀 착되는 보편적인 생리적 현상으로 노화색소 의 침착, 지방구의 축적, 세포실질의 감소, 핵의 위축, Nissel's body의 감소, Golgi's body의 파괴, 효소의 활성 및 기능 저하, 혈 구세포의 감소, 혈청성분의 변화 등 신체의

퇴화적 변화를 나타낸다. ^1,13) 의학의 발달과 더불어 노인 인구의 증가로 인해 고령화 사 회로의 진입함으로써 파생되는 많은 성인병 과 노화 관련 문제들은 개인의 문제만이 아 닌 사회적인 문제로 부각되고 있으며 이에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다 ¹⁴⁾ .

韓醫學에서 老化를 整體觀에 의거한 有機 的 關係에서 生體衰退의 변화로 파악하였으 며, 그 원인을 陰陽의 不調和, 形身衰弱, 氣 血 및 腎氣衰弱 등으로 설명하고 있다 ¹⁵⁾ . 특 히 ≪素問≫ ¹⁶⁾ 에 “天壽過度其脈上通而腎氣 有餘也”라고 하였고 虞 ⁵⁾ 가 “腎元盛則壽延 腎元衰則壽夭”라고 하여 腎氣虛衰가 老化의 중요 원인이라고 하였다. 최근 老化에 대한 연구 중 서 등 ⁶⁾ 은 五子地黃飮子로 老化白鼠 에 대해 抗酸化 效果가 있음을 報告하였고, 윤 등 ⁷⁾ 은 左歸飮과 右歸飮이 뇌에서 xanthine oxidase와 aldehyde oxidase의 활성 을 억제시켜 활성 산소류의 생성을 저해하 므로써 過酸化脂質의 生成을 抑制시킨다고 報告하는 등 腎虛의 관점에서 연구가 활발 히 진행되고 있다.

老化에 관한 學說로는 크게 소모설(wear

and tear theory)과 유전자설(genome-based

theory)의 개념으로 나누어지며 이 중 소모

설의 대표적인 학설인 free radical설에 많은

관심이 집중되고 있다 ¹⁷⁾ . Free radical은 적

어도 한 쌍의 짝을 짓지 않은 전자를 포함

하는 것으로 세포구성 성분들인 지질, 단백

질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역

적인 파괴작용을 함으로써 老化는 물론 癌

을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌질환

과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소

화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등 의 각종 疾病을 일으키는 것으로 알려져 있 다 ^3,4,18) .

최근에 이르러 抗酸化劑를 통하여 이러한 疾病을 치료하려는 시도가 이루어지면서 抗 酸化劑의 연구개발은 식품 및 발효공업 및 의약품 분야, 농업 분야 등 多方面에서 이용 되고 있기 때문에 국가적 측면에서 매우 큰 경제적, 산업적 파급효과를 기대할 수 있다

19) .

NO는 혈압조절에서 항생 작용, 신경계의 정보와 기억에까지 넓은 범위에서 활성이 나타나는 생물학적 신호이다. 그러나 過量의 NO는 조직을 손상시키고 염증을 유발한다.

따라서 NO의 생성은 조절될 필요성이 있 다. 과학자들은 신경전달물질의 역할을 하는 활성산소의 하나인 NO의 억제제가 고혈압, 패혈증성 쇼크(septic shock), 뇌졸중, 癌, 성 교 불능과 같은 병들을 치료하는 데 유용할 것으로 생각하고 있다 ^20,21) .

胡桃(Juglandis Semen)는 胡桃科에 속한 호도나무의 種仁으로, ≪備急千金要方≫ ²²⁾ 에

“味甘冷滑無毒 不可多食 動痰飮 令人惡心吐 水吐食”이라 최초로 기재된 이후 현대에서 는 補陽藥類에 분류되어 사용된다. 性味가 甘溫하고 腎․肺經에 歸經하여 抗老衰, 滋腎 固精 滋養强壯, 健腦, 溫肺定喘, 補氣養血 등 의 효능이 있어 腎虛精虧腰痛, 筋骨無力, 虛 寒喘嗽, 腸燥便秘 등의 病症을 치료하는데 사용되어져 왔다 ^8,9) . 胡桃藥鍼에 대한 硏究 로 백 등 ²³⁾ 은 胡桃藥鍼이 egg albumine에 의한 알레르기성 염증반응을 억제한다고 報 告하였고, 노 등 ²⁴⁾ 은 慢性咳嗽환자 35명에

대해 胡桃藥鍼을 肺腧와 平喘穴에 시술하였 을 때 顯症緩和에 유효한 효과가 있음을 報 告하였다. 정 등 ²⁵⁾ 은 胡桃藥鍼이 급성신부전 白鼠에 대해 근위 세뇨관의 기능을 회복시 키는데 영향을 주어 급성신부전에 효과가 있음을 報告하였고, 이 등 ²⁶⁾ 은 胡桃藥鍼液이 수은에 의한 간세포 손상을 방지하는 효과 가 있음을 報告하였다. 그리고 胡桃藥鍼을 이용한 抗酸化 硏究로 김 등 ¹⁰⁾ 은 胡桃藥鍼 液이 농도에 비례하여 腎臟組織에서 oxidant 에 의한 細胞損傷과 脂質의 過酸化를 防止 한다고 報告하였고, 김 등 ¹¹⁾ 은 胡桃藥鍼液이 H 2 O 2 의 생성을 방지 및 제거하고 지질과산 화를 방지한다고 報告하였으나, 胡桃藥鍼液 의 NO 소거를 통한 抗酸化 效果에 대한 報 告는 미비한 실정이다.

이에 著者는 抗老衰, 滋腎固精 등의 效能 이 있는 胡桃藥鍼液의 free radical 消去效果 를 살피기 위해 NO 消去 실험을 한 結果 다음과 같이 報告하는 바이다.

本 實驗에서 NO generator로는 SNAP를 사용하였다. NO generator로 SNAP를 사용 한 연구로 한 등 ²⁷⁾ , 서 등 ²⁸⁾ , 김 등 ²⁹⁾ 이 각각 數種의 藥鍼液, 蜂藥鍼液, 白何首烏藥鍼液에 대해 NO 소거 효과를 보고한 바 있다.

胡桃藥鍼液의 抗酸化效能을 알아보기 위 해 胡桃藥鍼液을 1, 10, 100 ㎍/㎖로 나누어 2, 6, 12, 24시간 동안 NO 농도를 測定하였 다.

2, 6시간 경과 후 측정한 NO 농도는 胡桃

藥鍼液 1, 10, 100 ㎍/㎖ 處置群에서 無處置

群에 비해 저하하는 것으로 나타났으나 有

意性 있는 감소는 없었다. 12시간 경과 후

NO 농도는 無處置群이 100.0±2.30%, Vit. C 處置群은 45.3±2.20%, 胡桃藥鍼液 1, 10, 100

㎍/㎖ 處置群에서 각각 94.1±2.55, 85.2±3.03, 81.4±2.02%로 나타났으며 胡桃藥鍼液 10, 100 ㎍/㎖ 處置群에서 無處置群에 비하여 有意한 NO 消去效果가 있었다. 24시간 경과 후 NO 농도는 無處置群이 100.0±1.09%, Vit. C 處置群은 24.8±2.27%, 胡桃藥鍼液 1, 10, 100 ㎍/㎖ 處置群에서 각각 88.8±1.87, 80.1±2.32, 82.2±1.30%로 나타났으며 胡桃藥 鍼液 1, 10, 100㎍/㎖ 處置群에서 無處置群 에 비하여 有意한 NO 消去效果가 있었다.

따라서, 胡桃藥鍼液의 NO 소거 효과는 胡 桃藥鍼液의 농도가 높을수록, 처치 후 최소 12시간 이후에 결과를 관찰하는 것이 더 의 미가 있었다.

이상은 胡桃藥鍼液이 NO 消去 效能으로 抗酸化 作用이 있음을 시사하나 추후 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사려된다.

V. 結 論

胡桃藥鍼液의 抗酸化 作用을 알아보기 위 해 NO의 농도를 測定한 결과 다음과 같은 結論을 얻었다.

1. 2, 6시간 경과 후 측정한 NO 농도는 胡 桃藥鍼液 1, 10, 100 ㎍/㎖ 處置群에서 無 處置群에 비해 저하하는 것으로 나타났으 나 有意性은 없었다.

2. 12시간 경과 후 측정한 NO 농도는 胡桃 藥鍼液 10, 100 ㎍/㎖ 處置群에서 無處置 群에 비하여 有意性 있는 감소가 있었다.

3. 24시간 경과 후 측정한 NO 농도는 1, 10, 100 ㎍/㎖ 處置群에서 無處置群에 비하여 有意性 있는 감소가 있었다.

이에 胡桃藥鍼液은 NO 消去 效果를 통해 抗酸化 作用을 나타낼 수 있을 것으로 사려 된다.

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