Effects of Herbal-acupuncture with Coicis Semen Solution at Joksamni<br /> (ST36) on Collagen-induced Arthritis in DBA/1J Mouse

足三里 薏苡仁藥鍼이 Collagen으로 誘發된 생쥐의 關節炎에 미치는 影響

이성노

이 현

1대전대학교 한의과대학 침구학교실

Effects of Herbal-acupuncture with Coicis Semen Solution at Joksamni (ST36) on Collagen-induced Arthritis in DBA/1J Mouse

Seong-No Lee¹, Hyun Lee¹

1Dept. of Acupuncture & Moxibustion, College of Oriental Medicine, Daejeon University Abstract

Objectives & Methods : The purpose of this study is to observe the effects of Coicis Semen Herbal-acupuncture solution (CS-HAS) at the Joksamni (ST36) on the collagen-induced arthritis in the DBA/1J mouse. The author performed several experiments to analyze the effects of CS-HAS on arthritis; change of the weight; the spleen size and adhesion rate;

serum cytokine levels; serum antibody levels; changes of immunocyte counts; the histological changes of joint.

Results : In the Coicis Semen Herbal-acupuncture (CS-HA), arthritis index, the incidence of arthritis, and the degree of joint edema were decreased. In CS-HA, there was no weight loss.

The size of the spleen, adhesion rate, and the edema and transformation of joint were lowered. In CS-HA, the levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IgG, IgM, and anti-collagen Ⅱ in serum and the levels of IFN-γ, IL-4, IL-10 in spleen were significantly decreased. In CS-HA, the expression ratios of CD45⁺ to CD3e⁺ and CD8⁺ to CD4⁺ were decreased. Also, the overall CD4⁺/CD8⁺ cell ratio was lowered in spleen. Ratios of the CD4⁺/CD25⁺, CD45⁺/CD69⁺ cells were decreased in lymph nodes. In addition, ratios of the CD3⁺/CD69⁺, CD11b⁺/Gr-1⁺ cells were also decreased in synovium. In the histological study, the cartilage destruction and synovial cell proliferation, and collagen fiber destruction were decreased with CS-HA treated group.

Conclusions : From the results mentioned above, it is suggested that CS-HA at the ST36 has several significant effects on the collagen-induced arthritis.

key words : Coicis Semen, Pharmacopuncture, Rheumatoid Arthritis (RA), ST36

Ⅰ. 緖 論

류마토이드 관절염(Rheumatoid arthritis,

RA) 은 관절의 활막에 발생하여 6주 이상 지속되는 만성 비특이적 염증으로 軟骨 破 壞, 관절통, 관절 변형, 機能 消失 및 發熱, 皮膚發疹, 結節, 體重減少 등의 증상을 보이 는

대표적인 自家免疫性疾患이다

.

⋅교신저자 : 이 현, 충남 천안시 백석동 대전대부속천안한방병원 침구과, Tel. 041-521-7579, E-mail : [email protected]

⋅투고 : 2007/11/06 심사 : 2007/12/03 채택 : 2007/12/14

치료법으로는 약물요법, 물리치료, 안정, 외과적 수술 등이 시행되고 있으나 아직까 지 정립된 치료방법이 없는 실정이며

, 최 근에는 면역학, 세포생물학, 분자생물학 등 의 비약적인 발달로 인하여 생물학적 제제 와 같은 새로운 치료방법이 시도되고 있다

4)

.

한의학에서 류마토이드 관절염은 疼痛, 腫 脹, 發赤, 發熱, 運動障碍 등의 증상으로 볼 때 痺症, 歷節風, 痛風, 白虎歷節風, 鶴膝風, 類風濕性關節炎 등의 範疇에 속하고

, 원 인은 風寒濕, 七情, 氣血虛, 肝腎虧損으로 분 류되며

, 치료는 祛風通絡, 散寒除濕, 祛痰 化瘀, 通絡止痛, 滋陰養血, 活血通絡하는 방

법으로

鍼灸, 약물, 藥鍼, 단식요법 등이

시행되고 있다.

류마토이드 관절염에 대한 약침 연구로는 秦艽 등

이 adjuvant 관절염에, 牛膝 등

15-19)

이 collagen 유발 관절염에 유효함이 보 고되었으나, 健脾滲濕, 除痺止瀉, 淸熱排膿의 효능이 있어 濕痺拘攣, 水腫脚氣, 小便不利, 脾虛泄瀉 등

에 쓰이는 薏苡仁藥鍼에 관한 연구는 김

의 연구 외에는 아직 접하지 못 하였다.

이에 저자는 薏苡仁으로 藥鍼液을 제조하 여, collagen으로 誘發된 생쥐의 關節炎에 足 三里 (ST36)를 시술한 후, 관절염 지수 및 발병률, 관절의 부종, 몸무게의 변화, 脾臟 및 관절의 외형변화, 혈청 및 脾臟 세포 배 양액에서의 각종 cytokine의 수치, 면역글로 불린 및 antibody의 수치, 脾臟과 림프절 및 관절내의 면역 세포 변화, 관절의 조직학적 변화 등을 관찰한 결과, 유의한 성적을 얻었

기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 材料 및 方法 1. 재료

1) 동물

동물은 6∼7주령의 수컷 DBA/1J mouse 40마리를 Slc(Japan)에서 공급받아 실험 당 일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료) 와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2℃를 유지하여 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

2) 약재

실험에 사용된 薏苡仁(Coicis Semen ; 이 하 CS로 표기)은 大田大學校 附屬韓方病院 에서 구입한 것을 精選하여 사용하였다.

2. 방법

1) 藥鍼液의 제조

분쇄기를 이용해서 薏苡仁 55g을 분쇄하

여 분말로 만들어, 원형 삼각 flask에 넣고

증류수 500㎖를 가하여 3시간 동안 shaking

water bath에서 유출한 후, 유출액을 여과하

였다. 이 여과액을 여과지로 3회 여과한 후

rotary evaporator에 감압 농축하였다. 이 농

축액에 5% ethyl alcohol 30㎖를 가하고 실

온에서 교반한 후 방치하여 침전물이 생성

되게 한 후 여과하였다. 이 여과액을 rotary

evaporator로 감압 농축한 후 농축액을 다시

여과하였다. 이 여과액에 85% ethyl alcohol 30㎖를 가하여 잠시 교반 후 방치하고 침전 물이 생성되게 한 후 여과하였다. 여과액에 75% ethyl alcohol 30㎖를 가하고 교반한 후 방치하였다가 여과하는 조작을 2회 반복하 였다. 여과액 중의 ethyl alcohol 성분을 rotary evaporator로 감압 제거하고 남은 농 축액이 20㎖가 되게 하였다. 1N NaOH를 이용하여 농축액을 pH 6.8이 되도록 조절하 고, 4℃에서 12시간 방치한 후 멸균하였다.

멸균된 농축액에 PBS를 가하여 1%로 희석 하여 藥鍼液으로 사용하였다.

2) Collagen으로 關節炎을 誘發한 동물모델

CII를 0.05N acetic acid로 녹여 2㎎/㎖로 만들고, 같은 양의 Freund's complete adjuvant (FCA)로 혼합하여 2㎖로 만들어, 이 용액에 녹아 있는 CII의 농도가 1㎎/㎖

가 되도록 하였다.

DBA/1J mouse 8마리씩을 한 군으로 하 여 Normal群, Control群, Saline群, N.P.(needle prick)群, 薏苡仁藥鍼群의 5군으 로 나누고, Normal群을 제외한 각 군에 CII 를 2차(7일, 21일)에 걸쳐 각각 0.1㎖(CII 100㎍)씩 꼬리 기저부에 접종하였다.

3) 取穴 및 藥鍼 처치

Mouse의 뒷다리에서 인체의 足三里 (Joksamni; ST36)에 상응하는 부위를 骨度 分寸法에 의거하여 取하였다.

Control群은 CII 접종 이외의 처치는 하 지 않았다. Saline群은 CII 2차 접종 이후부

터 saline 0.2㎖를 주 3회 우측 足三里에 주 입하였고, N.P.群은 CII 2차 접종 이후부터 주 3회 우측 足三里에 26 gauge 주사기를 0.5cm 정도 깊이로 刺入하고 즉시 제거하였 다. 薏苡仁藥鍼群은 CII 2차 접종 이후부터 우측 足三里에 1%의 薏苡仁藥鍼液 0.2㎖를 주 3회 주입하였다.

4) 관절염 평가

(1) 관절염 지수 (Arthritis index, AI)

CII 2차 접종 1주일 후부터 3-4일 간격으 로 실험동물의 다리를 관찰하여 관절염 유 발 정도를 기록하였다. 아래 기준을 바탕으 로 관절염 정도를 관찰하여 관절염 지수를 계산하였다(Table 1, Scheme 1).

Table 1. Arthritis score

Score Manifestation Degree 0 No change

Degree 1 Mild swelling in ankle or redness in foot

Degree 2 Mild swelling and inflammation and redness from ankle to mid foot Degree 3 Gross swelling and inflammation of

entire foot

Degree 4 Swelling and inflammation of entire foot including toes

Scheme 1. Arthritis index

AI =

Sum of the arthritis score in the four limbs of each mouse within the group The number of mouse within the group

(2) 관절염 발병률

CII 접종으로 관절염을 유도한 이후 3-4

일 간격으로 실험동물의 네 다리 관절을 관

찰하여, 관절염 score가 한 다리 이상에서 degree 3 이상이거나, 두 다리 이상에서 degree 2 이상인 실험동물의 개체를 확인하 여 기록하였다.

(3) 관절의 부종

관절염의 심화도를 객관적으로 평가하기 위하여 2차 접종을 실시한 뒤 10일 간격으 로 micrometer(Mitutoyo, Japan)를 이용하 여 생쥐 발목 관절의 부종정도를 확인하였 으며, 1회 실시에 3번의 측정을 통해 평균값 을 기록하였다.

5) 몸무게 측정

CII 2차 접종 후부터 실험 종료 때까지 10일 간격으로 각 실험군의 몸무게 변화를 관찰하여 관절염 유발 정도에 따른 몸무게 의 변화를 기록하였다.

6) 脾臟의 외형변화 관찰 및 臟器 유착 률 측정

실험 종료시, DBA/1J mouse의 臟器 적출 을 실시할 때 脾臟의 외형변화를 사진촬영 을 통해 기록을 남겼으며, 복강의 모든 臟器 의 유착정도를 확인하여 개체수를 기록하여 유착의 발생정도를 확인하였다.

7) 관절의 외형변화 관찰

실험 기간동안, 관절염으로 인한 각 실험군의 DBA/1J mouse 발목 관절 부위의 외형변화 를 확인하고, 사진 촬영을 통해 기록을 남겼다.

8) 脾臟 세포 채취 및 배양

DBA/1J mouse 脾臟 조직을 적출하여 4℃에 보관했던 PBS로 3회 세척한 후, 40㎛

nylon mesh에 갈아서 脾臟 세포를 얻었다. 脾 臟 세포를 5% fetal bovine serum과 antibiotics (penicillin 100U/㎖, streptomycin 100㎍/㎖) 가 포함된 RPMI 1640 medium에 넣어서 5×10

cells/㎖ 농도로 맞추고 anti-CD3/CD28 항체가 coating되어 있는 96 well plate에 분 주하여 37℃ CO2 배양기에서 48시간동안 배양하였다. 배양 후 원심 분리하여 상층액 만을 분리하였고 상층액 중에 포함된 cytokine을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

9) Enzyme-linked immunosorbent assay

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용하여, mouse에서 분리 한 serum 및 spleen cell culture supernatant에 서 각 cytokine과 면역 글로불린, anti-collagen II 항체를 측정하였다. Anti-cytokine 혹은 면역 글로불린, anti-collagen II 항체가 코팅 된 96 well plate에 serum을 가하여 반응시 킨 후 4번 세척하고, 다시 biotin이 표식된 anti-cytokine 항체를 가하여 반응시킨 후 4번 세척하였다. 여기에 streptavidin horseradish peroxidase를 가하고 ELISA-reader를 이용 하여 측정하였다.

10) Flow cytometry

(1) 脾臟內 및 림프절내 면역 세포 분석

각 군에서 절취한 脾臟 및 lymph node에

서 세포를 분리하여 표식 항체를 반응시켜

flow cytometer로 분석하였다.

(2) 관절내 면역 세포 분석

Mouse에서 분리해 낸 무릎 관절을 잘게 절단한 후, collagenase를 가하고 배양하여 분리해 낸 세포에 표식 항체를 반응시켜 flow cytometer로 분석하였다.

11) 관절의 조직학적 변화 분석

DBA/1J mouse의 무릎 관절 부위를 취하여 cryotome을 이용하여 절편한 후, Hematoxylin

& eosin 염색과 Masson's Trichrome 염색을 하였고, 400배율로 현미경에서 관찰을 하였 으며, 사진 촬영을 실시하였다.

12) 통계처리

본 실험에서 얻은 결과에 대하여 ANOVA and Bonferroni-type multiple t-test (parametric), Ver 1.1로 분석하여 p값을 구했다

. 각 실 험군을 비교하여 p<0.05 일 때 有意性이 있 다고 판정하였다. Normal群과 다른 실험군 간의 有意性 표기는 생략하였다.

Ⅲ. 結 果 1. 관절염에 미치는 영향

1) 관절염 지수

관절염 지수에서 薏苡仁藥鍼群은 초기에 는 Control群보다 높게 나타났으나, 시간이 지나면서 지수의 증가가 완만히 유지되어 Control群과 점진적인 차이를 갖게 되었다

(Fig. 1).

Fig. 1. Effects of CS-HA on the collagen induced arthritis index

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 7 14 21 26 28 30 33 35 37 40 44 47 49 51 54 58 61 63 68 71 75 78 81 84 Days after 1st immunization

Index of RA

Control N.P. Saline CS-HA

2) 관절염 발병률

모든 군에서 시간이 지나면서 관절염 발 병이 점차적으로 증가하였으며, 대부분 薏苡 仁藥鍼群은 Control群에 비하여 발병률이 낮게 나타내었다. 또한 藥鍼을 처치한 우측 다리는 좌측 다리에 비하여 관절염 발병률 이 낮게 유지되었다(Table 2).

Table 2. Arthritis incidence Arthritis incidence Days

Control (n=8)

N.P.

(n=8)

Saline (n=8)

CS-HA (n=8) Right Left Right Left Right Left Right Left 26 day 0/8 1/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 1/8 28 day 0/8 2/8 0/8 2/8 1/8 2/8 2/8 1/8 30 day 0/8 2/8 2/8 1/8 1/8 2/8 4/8 2/8 33 day 1/8 3/8 2/8 2/8 1/8 2/8 3/8 2/8 35 day 3/8 3/8 2/8 1/8 1/8 1/8 3/8 2/8 37 day 3/8 3/8 2/8 2/8 2/8 2/8 2/8 3/8 40 day 1/8 4/8 2/8 6/8 2/8 3/8 1/8 2/8 47 day 3/8 4/8 2/8 5/8 2/8 4/8 2/8 1/8 49 day 4/8 5/8 2/8 5/8 1/8 4/8 1/8 2/8 51 day 4/8 3/8 1/8 4/8 1/8 5/8 2/8 2/8 54 day 4/8 4/8 2/8 4/8 5/8 4/8 1/8 3/8 58 day 4/8 5/8 4/8 5/8 4/8 5/8 1/8 2/8 61 day 6/8 4/8 3/8 4/8 2/8 6/8 2/8 4/8 63 day 4/8 5/8 2/8 5/8 2/8 6/8 1/8 3/8 68 day 5/8 6/8 4/8 6/8 2/8 7/8 0/8 3/8 71 day 6/8 6/8 5/8 7/8 2/8 6/8 2/8 4/8 75 day 7/8 8/8 8/8 6/8 5/8 7/8 3/8 3/8 84 day 8/8 8/8 7/8 7/8 7/8 7/8 3/8 5/8

3) 관절의 부종

Normal群을 제외한 모든 군에서 관절의 부 종이 일어났으며, Control群과 N.P.群 그리고 Saline群의 관절은 시간이 경과함에 따라 계 속적으로 부종이 진행되는데 반하여 薏苡仁藥 鍼群에서는 낮게 유지되다가 실험 종반에는 감소 추세를 보여 시간이 지날수록 다른 군과 차이가 커졌으나 有意性은 없었다(Fig. 2).

Fig. 2. Effects of CS-HA on joint edema

2 2.5 3 3.5 4 4.5

40 day 50 day 60 day 70 day 80 day

Thickness (cm)

Normal Control N.P. Saline CS-HA

2. 몸무게 변화에 미치는 영향

몸무게 변화를 관찰한 결과, Control群은 점차로 감소하는 경향을 보였으나, 薏苡仁藥 鍼群은 Normal群과 유사하게 지속적으로 증가하는 경향을 보여 관절염 발병에 따른 몸무게의 저하를 나타내지는 않았다(Fig. 3).

Fig. 3. Effects of CS-HA on body weight

15 17 19 21 23 25 27

10 20 30 40 50 60 70 80

Day s after 1s t immu nization

body weight (g)

Normal Control N.P. S aline CS -HA

3. 脾臟의 외형 변화에 미치는 영향

薏苡仁藥鍼群은 脾臟 종대와 유착 비율에 서 Control群에 비하여 적었다(Table 3, Fig. 4).

Table 3. The rate of adhesion from arthritis by Bovine type II collagen

Normal Control N.P. Saline CS-HA Adhesion

rate 0/8 (0%)

7/8 (87.5%)

6/8 (75%)

7/8 (87.5%)

3/8 (37.5%)

Fig. 4. Effects of CS-HA on spleen size and shape (A: Normal, B: Control, C: N.P., D: Saline, E:

CS-HA)

4. 관절의 외형 변화에 미치는 영향

Control群은 Normal群에 비하여 관절 부 종이 심해졌으며, 더불어 발가락 관절이 휘 어지는 경우도 있었다. 이러한 부종 및 변형 은 개체마다 약간의 차이가 있었으나, 薏苡 仁藥鍼群은 Control群, N.P.群 및 Saline群에 비하여 관절 부종이 완만하였으며 관절 변 형도 적었다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects of CS-HA on hind limb

(A: Normal, B: Control, C: N.P., D: Saline, E:

CS-HA, A-E: Right hind limb)

5. Serum cytokine level에 미치는 영향 1) IL-1β

혈청 IL-1β에서 薏苡仁藥鍼群은 Control 群, N.P.群에 비하여 有意性있게 감소하였다 (Fig. 6).

Fig. 6. Effects of CS-HA on the level of cytokine in serum

***: P<0.001, **: P<0.01 by ANOVA test

(A) IL-1β (B) IL-6

(C) TNF-α (D) IFN-

2) IL-6

혈청 IL-6에서 薏苡仁藥鍼群은 Control群, N.P.群 및 Saline群에 비하여 有意性있게 감 소하였다(Fig. 6).

3) TNF-α

혈청 TNF-α에서 薏苡仁藥鍼群은 Control 群에 비하여 有意性있게 감소하였다(Fig. 6).

4) IFN-γ

혈청 IFN-γ에서 薏苡仁藥鍼群은 Control 群에 비하여 有意性있게 감소하였다(Fig. 6).

6. Serum antibody level에 미치는 영향 1) IgG

혈청 IgG에서 薏苡仁藥鍼群은 Control群 에 비하여 지속적으로 감소하는 경향을 보 였으나 有意性은 없었다(Fig. 7).

2) IgM

혈청 IgM에서 薏苡仁藥鍼群은 실험 시작

4주까지 증가하다가 이후에는 Control群에

비하여 약간 감소된 상태로 일정하게 유지

되었다(Fig. 7).

Fig. 7. Effects of CS-HA on the level of antibody in serum

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

2w 4w 6w 8w 10w 12w

Weeks after 1st immunization IgG level in serum (A450nm)

Normal Control N.P. Saline CS-HA

(A) IgG

0 0.5 1 1.5 2

2w 4w 6w 8w 10w 12w

Weeks after 1st immunization IgM level in serum (A450nm)

Normal Control N.P. Saline CS-HA

(B) IgM

0 1 2 3 4

2w 4w 6w 8w 10w 12w

Weeks after 1st immunization anti-collagen Ab level in serum (A450nm)

Normal Control N.P. Saline CS-HA

(C) anti-collagen II

3) Anti-collagen II

혈청 anti-collagen Ⅱ에서 薏苡仁藥鍼群은 Control群, Saline群 및 N.P.群에 비하여 감 소하였으나 有意性은 없었다(Fig. 7).

7. 脾臟 세포 배양액에서의 cytokine level에 미치는 영향

1) IFN-γ

IFN-γ의 농도에서 薏苡仁藥鍼群은 Control 群, N.P.群 및 Saline群에 비하여 有意性있 게 감소하였다(Fig. 8).

Fig. 8. Effects of CS-HA on the level of cytokine in spleen cell

***: P<0.001, **: P<0.01, *: P<0.05 by ANOVA test

(A) IFN-

(B) IL-4

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Normal Control N.P. Saline CS-HA

IFN-γ/IL-4 ratio

(C) IFN-γ/IL-4 ratio

(D) IL-10

2) IL-4

IL-4의 농도에서 薏苡仁藥鍼群은 Control 群, N.P.群 및 Saline群에 비하여 有意性있 게 감소하였다(Fig. 8).

3) IFN-γ/IL-4 ratio

IFN-γ/IL-4의 농도 비율에서 薏苡仁藥鍼 群은 Control群에 비하여 감소하는 경향을 보였으나 有意性은 없었다(Fig. 8).

4) IL-10

IL-10의 농도에서 薏苡仁藥鍼群은 Control 群에 비하여 有意性있게 감소하였다(Fig. 8).

8. 脾臟內 면역 세포에 미치는 영향 1) Total cell count

총 세포수에서는 薏苡仁藥鍼群은 Saline군 에 비하여 有意性있게 증가하였으며, Control群에 비하여 다소 증가하였으나 통 계적 有意性을 나타내지는 않았다(Fig. 9).

Fig. 9. Effects of CS-HA on immune cell in spleen cell

(A) total cell count (B) Ratio of CD3e

cells to CD45R(B220)

cells

(C) Ratio of CD4

cells to CD8

cells

6. 4 2

± 0 .4 1 1 8 . 1 9

± 0 . 3 8

1 9 . 14

± 0 .4 4 4 . 9 1

± 0 .4 4

8. 1 4

± 0 . 6 7

C D4 F IT C

CD25 PE

N o rm a l Co n tro l

N .P . S a lin e C S -HA

(D) CD4

/CD25

cell population

2) Ratio of CD3e

cells to CD45R+ cells

CD3e

세포와 CD45R(B220)

세포의 비 율에서는 薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하 여 감소하여 Normal群의 비율과 유사하였 다(Fig. 9).

3) Ratio of CD4

cells to CD8

cells

CD4

세포와 CD8

세포의 비율에서는

薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하여 감소하

여 Normal群의 비율과 유사하였다(Fig. 9).

4) CD4

/CD25

cell population

CD4

세포와 CD25

세포의 표적항체에 동시에 반응하는 세포의 비율에서는 薏苡仁 藥鍼群이 Control群, Saline群에 비하여 감소 하였다(Fig. 9).

9. 림프절내 면역 세포에 미치는 영향 1) Total cell count

총 세포의 수에서는 薏苡仁藥鍼群이 Control群, N.P.群에 비하여 有意性있게 감소하였다(Fig. 10).

Fig. 10. Effects of CS-HA on immune cell in lymph node

(A) total cell count

(B) CD4

/CD25

cell population

(C) CD45R

/CD69

cell population

2) CD4

/CD25

cell population

CD4

세포와 CD25

세포의 표적항체에 동시에 반응하는 세포의 비율에서는 薏苡仁 藥鍼群이 Control群, Saline群에 비하여 감소 하였다(Fig. 10).

3) CD45R

/CD69

cell population

CD45R

세포와 CD69

세포의 표적 항 체에 함께 반응하는 세포의 비율에서는 薏 苡仁藥鍼群이 Control群, Saline群에 비하여 감소하였다(Fig. 10).

10. 관절내 면역세포에 미치는 영향 1) CD3e

/CD69

cell population

CD3e

와 CD69

세포의 표적 항체에 동 시에 반응하는 세포의 비율에서는 薏苡仁藥 鍼群이 Control群, Saline群에 비하여 감소하 였다(Fig. 11).

2) CD11b

/Gr-1

cell population

CD11b

와 Gr-1

세포의 표적 항체에 동

시에 반응하는 세포의 비율에서는 薏苡仁藥

鍼群이 Control群, N.P.群 및 Saline群에 비

하여 감소하였다(Fig. 11).

Fig. 11. Effects of CS-HA on immune cell in knee joint

11. 관절의 조직학적 변화에 미치는 영향 1) Hematoxylin and eosin stain

薏苡仁藥鍼群이 Control群, Saline群 및 N.P.群에 비하여 연골의 파괴 및 면역 세포 의 분포가 감소하여 Normal群과 거의 유사 한 상태를 유지하였다(Fig. 12).

2) Masson's Trichrome stain

薏苡仁藥鍼群이 Control群, Saline群 및 N.P.群에 비하여 collagen fiber가 Normal群 에 가깝게 유지되었다(Fig. 12).

(A) H&E stain

(↑: Immune cell, C: Cartilage, F: Femur)

(B) MT stain

(Blue: Collagen fiber, Gray: Cell, Rad: Matrix)

Ⅳ. 考 察

관절은 넓은 의미에서 骨과 骨이 연결되

는 부분을 총칭하지만 생역학 또는 운동학

적으로는 가동관절, 즉 滑膜 관절에 대한 기

술이 主를 이룬다. 滑膜 관절은 滑液으로 차

있는 관절강을 중심으로 양쪽의 骨은 초자

연골로 덮여있고 나머지 둘레는 관절낭으로

덮여 있는 관절로서 인체 각 부위의 屈伸과

回轉運動을 담당한다

. 이러한 관절을 침범

하는 모든 염증성 질환을 관절염이라 한다

.

한의학에서 류마토이드 관절염은 疼痛, 腫

脹, 發赤, 發熱, 運動 障碍 등의 증상으로 볼

때 痺症, 歷節風, 痛風, 白虎歷節風, 鶴膝風,

類風濕性關節炎 등의 範疇에 속하는데

, 크게는 痺症에 속한다고 할 수 있다.

痺症은 風寒濕熱의 邪氣가 인체의 營衛失 調, 腠理空疎, 正氣虛弱한 틈을 타고 인체의 肌表, 經絡을 침입하거나 관절에 凝滯됨으로 써 氣血運行이 순조롭지 못하여 肌肉, 筋骨, 관절에 麻木, 重着, 酸楚, 疼痛, 腫脹 및 屈 伸不利가 생기며, 심해지면 관절의 강직성 변형을 일으키는 병증이다

.

痺症의 치료원칙은 辨證에 따라 風寒濕痺 型은 散寒除濕 祛風通絡하고, 風熱濕痺型은 祛風淸熱 除濕通絡하며, 痰瘀痺疽는 祛痰化 瘀 通絡止痛하고, 正虛邪留는 滋陰養血 活血 通絡시킨다

.

藥鍼療法은 최근에 임상에서 활발하게 활 용되고 연구가 행해지고 있는 치료방법으로 鎭痛, 면역증강, 해독, 종양유발 억제 등에 활용되며 약물의 흡수가 빠르고 작용이 신 속하며 경구투여가 불가능한 경우에 처치할 수 있는 장점이 있다

.

본 실험에 사용된 薏苡仁(Coicis Semen)은 禾本科(벼과; Gramineae)에 속한 1년생 또 는 다년생 초목인 율무 Coix lachryma-jobi var. mayuen (ROMAN.) STAPF의 성숙한 種仁을 건조한 것으로 性은 凉・無毒하고 味는 甘淡하며, 健脾滲濕, 除痺止瀉, 淸熱排 膿 등의 효능이 있어 임상에서 흔히 水腫脚 氣, 小便不利, 濕痺拘攣, 脾虛泄瀉, 肺癰, 腸 癰 등에 응용되고 있다

. 또한 면역 증강

25)

, 항산화

, 기아 stress 감소

등의 효과 가 보고되었고, 관절염과 관련되어 김

이 薏苡仁藥鍼을 adjuvant 관절염 白鼠에 刺鍼 하여 유의한 소염작용과 진통작용이 있음을

보고하였다.

본 실험에 사용된 足三里(ST36)는 足陽明 胃經의 合土穴이며 六腑下合穴, 回陽九鍼穴, 四總穴, 中風七處穴 중의 하나로 임상적으로 가장 많이 활용되고 있으며 穴性으로 理脾 胃, 調中氣하는데 특히 通調經絡, 調和氣血, 扶正培元, 祛邪防病하여 면역을 조정하고 전 신을 强壯시키는 要穴이다

. 권

은 足三里 에 蜂藥鍼을 시술하여 만성 關節炎 병태 모 델에서 경혈점이 아닌 곳에 주입한 경우와 비교하여 유의성 있는 항염증 및 항유해수 용기 효과를 나타남을 보고하였고, 김

은 adjuvant 유발 관절염에서 足三里 電鍼자극 이 임의혈 電鍼刺戟群에 비하여 관절염 증 상을 완화시키며 병변의 진행을 억제하는데 효과를 있음을 보고하였다.

따라서 足三里가 免疫을 조정하고, 有效한 항염증 작용이 있음을 확인하여 본 연구에 서 선혈하게 되었다.

DBA/1J mouse에 collagen으로 유발된 관 절염은 류마토이드 관절염의 연구에 광범위 하게 사용되는 실험 모델이다. 성숙된 T나 B 세포가 부족한 생쥐의 콜라젠 면역반응은 관절염 병소를 형성하여 특징적으로 염증을 동반한 활막 증식, 연골 및 골파괴를 일으켜 서

, 본 연구에서 collagen으로 유발된 CIA mouse를 병태모델로 사용하였다.

최근 들어 류마토이드 관절염에 대해 藥

鍼을 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있

는데, 秦艽

, 馬錢子

, 天授根

, 柴胡

등

의 藥鍼液이 adjuvant 관절염에, 牛膝

, 防

己

, 蜂毒

, 鹿茸

, 鷄血藤

등의 藥鍼

液이 collagen 誘發 관절염에 유효함을 보고

되었으나, 健脾滲濕, 除痺止瀉, 淸熱排膿하는 효능이 있어 濕痺拘攣, 水腫脚氣, 小便不利, 脾虛泄瀉 등

에 이용되는 薏苡仁藥鍼에 관 한 연구는 김

의 adjuvant 관절염에 유의 한 소염・진통 작용 연구 외에는 아직 접하 지 못하였다.

이에 저자는 薏苡仁으로 藥鍼液을 제조하 여, collagen으로 誘發된 생쥐의 關節炎에 足 三里 (ST36)를 시술한 후, 관절염 지수 및 발병률, 관절의 부종, 몸무게의 변화, 脾臟 및 관절의 외형변화, 혈청 및 脾臟 세포 배 양액에서의 각종 cytokine의 수치, 면역글로 불린 및 antibody의 수치, 脾臟과 림프절 및 관절내의 면역 세포 변화, 관절의 조직학적 변화 등을 분석하여 薏苡仁藥鍼 足三里 자 극이 류마토이드 관절염에 미치는 효과를 실험적으로 관찰하였다.

관절염에 미치는 영향을 외형적으로 살펴 보기 위하여 우선 관절염 지수, 발병률, 관 절 부종을 관찰하였다. 관절염 지수에서는 薏苡仁藥鍼群이 초기에는 Control群보다 높 게 나타났으나, 시간이 지나면서 지수의 증 가가 완만히 유지되어 Control群과 점진적 인 차이를 갖게 되는 것을 관찰할 수 있었 다(Fig. 1). 이는 薏苡仁藥鍼이 Control群에 비하여 지속적으로 관절염 억제를 보이는 것으로 생각된다.

관절염 발병률에서는 모든 군에서 시간이 지나면서 관절염의 발병이 점차적으로 증가 하였고, 대부분 薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하여 발병률이 낮게 나타났다. 또한 약침 을 처치한 우측 다리는 좌측 다리에 비하여 관절염 발병률이 낮게 유지되었다(Table 2).

이는 薏苡仁藥鍼의 작용에 의하여 관절염 발병률을 억제시키는 것으로 思慮된다.

관절 부종을 관찰한 결과, Control群과 N.P.群 그리고 Saline群의 관절은 시간이 경 과함에 따라 계속적으로 부종이 진행되는데 반하여 薏苡仁藥鍼群에서는 낮게 유지되다 가 실험 종반에는 감소 추세를 보여 시간이 지날수록 다른 군과 차이가 커졌다(Fig. 2).

이는 薏苡仁藥鍼의 健脾滲濕하는 효능과 有 關한 것으로 생각된다.

따라서 薏苡仁藥鍼 足三里 자극이 관절염 지수를 감소시키고, 관절염 발병률과 관절 부종도 감소시켜 관절염을 호전시킴을 알 수 있었다.

관절염 발병에 따른 몸무게 변화를 관찰 한 결과, Control群, N.P.群 그리고 Saline群 에서는 점차로 감소하는 경향을 나타냈으나, 薏苡仁藥鍼群에서는 Normal群과 유사하게 지속적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 관절염 발병에 따른 몸무게의 저하를 나타 내지는 않았다(Fig. 3). 이는 Control群에서 는 부종이 증가하고 관절염이 심화되어 영 양상태의 불균형으로 인하여 몸무게 저하를 보이는 것으로 생각되며, 薏苡仁藥鍼群은 관 절염의 호전으로 Normal群과 유사한 영양 상태를 유지하여 몸무게 저하를 보이지 않 는 것으로 생각된다.

면역 세포의 저장과 활성화에 관련된 脾 臟을 절개하여 외형적 변화를 관찰하였다.

Control群에서는 Normal群에 비하여 脾臟이

약간 비대해졌으며, 특히 脾臟이 위치한 부

위의 기관들과 유착이 일어났으나, 薏苡仁藥

鍼群에서는 Control群에 비하여 脾臟 종대

도 적었고, 유착 빈도도 적었다(Table 3, Fig. 4). 이는 면역 세포의 증식 및 저장과 관련된 脾臟의 변화 측면에서 Control群은 관절염의 증가에 따라 면역 세포의 활성화 와 증식으로 인하여 脾臟이 증대되고, 주변 기관의 유착이 보인 반면에 薏苡仁藥鍼은 면역 세포의 증식과 활성화를 억제하여 脾 臟의 외형 변화가 낮아진 것으로 생각된다.

또한 류마토이드 관절염에서 보이는 관절 증상뿐만 아니라 臟器 증상의 호전도 이와 유관한 것으로 思慮된다.

류마토이드 관절염에서 보이는 부종 및 변형을 관찰한 결과, 개체마다 약간의 차이 를 보이긴 했지만 대체적으로 Control群은 Normal群에 비하여 관절 부종이 심했으며, 더불어 발가락 관절이 휘어지는 경우도 있 는 반면에 薏苡仁藥鍼群은 Control群, N.P.

群 및 Saline群에 비하여 관절 부종이 완만 하였으며 관절 변형도 적었다(Fig. 5). 이는 薏苡仁藥鍼이 관절 부종 및 변형에도 영향 을 미쳐 관절염을 억제한 것이라 생각된다.

따라서 薏苡仁藥鍼 足三里 자극은 류마토 이드 관절염에 일정한 억제 작용이 있어 Control群에 비하여 관절염 발병에 따른 몸 무게의 저하를 감소시켰으며, 脾臟의 증대, 유착 빈도, 관절 부종 및 관절 변형도 감소 시킴을 알 수 있었다.

Cytokine의 주요한 역할을 보면 세포성 면역반응, 항체생성의 조절, 암세포의 증식 과 파괴, 염증반응 및 allergy 반응 등에 관 여하는데, 염증반응에 관여하는 cytokine은 IL-1, IL-6, IL-8, TNF, IFN 등이 알려져 있다

.

IL-1β가 비특이적으로 면역 시스템을 활 성화시켜서 염증반응 및 골조직의 파괴를 활 성화시켰음이 보고된 바 있고

, anti-TNF-α 항체가 류마토이드 관절염을 앓고 있는 환 자의 관절에서 염증성 cytokine의 자발적인 생성을 억제한다는 보고가 면역학적 치료제 개발의 이론적 배경을 제시하고 있으며

, 임상연구를 통해서 anti-IL-6 수용체 항체가 염증반응을 억제하는 효과가 입증되어져 있 다

. 또한 IFN-γ는 대식세포 활성화 cytokine으로 염증반응의 시작과 유지에 작 용하고, 모든 염증반응을 확대하고 증폭하는 분자에 부착하여 세포표면의 발현을 확실히 해준다

.

실험 동물의 혈청에서 염증발현시 활성화 되고 증식되는 cytokine들인 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 혈청내 농도에서 薏苡 仁藥鍼群은 Control群에 비하여 有意性있게 감소시켰는데(Fig. 6), 이는 薏苡仁藥鍼 足 三里 자극이 염증성 cytokine의 발현과 증식 을 억제하는 효과를 입증하여 류마토이드 관절염에 효과가 있을 것으로 思慮된다.

관절염 초기에 B 세포가 관계하는 체액성 면역이 중요한 역할을 가지는데, 이

가 B 세포의 면역반응이 자가면역과 관련이 있음 을, 문

이 류마토이드 관절염 환자의 혈청 IgM 항체의 시간적인 변화가 있음을 보고 하였고, anti-collagen 항체는 CⅡ에 대한 특 이반응을 보여, 이 항체가 증가하는 경우 관 절염이 심해지는데 이를 측정하여 관절염의 객관적 지표로 이용하고 있다

.

본 실험에서 혈청 IgG에서는 薏苡仁藥鍼

群이 Control群에 비하여 지속적으로 감소

하는 경향을 보였으며, 혈청 IgM의 농도에 서는 薏苡仁藥鍼群이 실험 4주까지 증가하 다가 이후에는 Control群에 비하여 약간 감 소된 상태로 일정하게 유지하였으며, 혈청 anti-collagenⅡ의 농도에서는 薏苡仁藥鍼群 이 Control群에 비하여 감소하였다(Fig. 7).

이는 薏苡仁藥鍼 足三里 자극이 류마토이드 관절염 발병을 매개하는 면역글로블린 및 collagen의 생성을 감소시켜 관절염의 진행 을 억제시킨 것으로 생각되며, 특히 실험 4 주째부터는 collagen Ⅱ 항체 생성에 영향을 미쳐 항체의 생성정도가 일정하게 유지됨을 알 수 있었다.

IL-4, IL-10는 류마토이드 관절염 환자에 서 IL-1β와 TNF-α, IL-6, IL-8의 전사를 억제하여 과잉 생산을 차단하는데, 특히 IL-10은 IL-1β와 TNF-α의 수준을 억제하 는데 가장 효과적이다

.

면역에 관련되어 중요한 역할을 하는 脾 臟 세포 배양액에서 IFN-γ, IL-4, IL-10의 생성량은 薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하 여 有意性있게 감소하였는데(Fig. 8), 이는 薏苡仁藥鍼이 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성 을 억제하여 상대적으로 이들의 과잉 생산 을 억제하는 cytokine인 IL-4, IL-10에 영향 을 미쳐 Control群보다 감소한 것으로 추정 되며, 염증성 cytokine인 IFN-γ와 IFN-γ /IL-4 비율의 감소도 Control群에 비하여 염증발현이 적은 결과로 이해할 수 있어서, 薏苡仁藥鍼 足三里 자극이 면역 세포의 활 성화뿐만 아니라, 조절에도 관여하여 관절염 의 억제 효과를 보이는 것으로 생각된다.

면역 세포는 세포의 종류나 분화 단계에

따라서 특징적인 표면분자(CD)를 표현하는 데

, T 세포 항원 수용체와 밀접하게 연관 된 CD3e는 성숙 T 세포를 인지하고, CD4 는 보조 T 세포를 활성화시키고, B 세포에 항원을 전달하여 항체 생성을 유발하는 작 용을 하며, CD8은 세포독성 T 세포와 억제 T 세포에 항원을 전달하고, CD45

는 티로 신 인산 분해 효소로, pro B 세포부터 성숙 B 세포까지를 인지한다

.

CD25

는 활성 T 세포와 B 세포 모두를 인지하는데 활성화된 T 세포에 의하여 IL-2 수용체를 형성하고

, CD69

는 T 세포가 활성화되면 2시간 이내에 발현이 되는 초기 활성인자로 초기 면역 세포의 활성도를 알 수 있으며

, CD11a

는 세포와 세포의 결합 과 이동에 관여하고, macrophage, NK cell, granulocyte를 인지하는 작용을 하며

, Gr-1은 골조직 내에서 과립백혈구에 양성 반응을 보인다

.

脾臟內 면역 세포의 변화를 살펴보아 薏

苡仁藥鍼이 면역 세포의 활성화와 증식에

미치는 영향을 관찰한 결과, 脾臟內 총 세포

수에서는 薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하

여 다소 증가하였으나 통계적 有意性은 없

었다(Fig. 9). 활성화된 T와 B 세포의 비율

을 알아보기 위한 CD3e

세포와 CD45R

세포의 비율, 보조 T세포와 억제 T세포의

비율을 알아보기 위한 CD4

세포와 CD8

세포의 비율, 면역조절 T 세포의 변화를 알

기 위한 CD4

/CD25

세포의 표적항체에

동시에 반응하는 세포의 비율에서 모두 薏

苡仁藥鍼群이 Control群에 비하여 감소하여

Normal群의 비율과 유사하게 회복되었다

(Fig. 9). 이는 면역 세포의 활성화와 증식 이 되는 臟器인 脾臟內의 면역 세포들이 薏 苡仁藥鍼 足三里 자극에 의하여 억제되어 Control群에 비하여 감소된 것으로 생각된 다.

면역 세포들의 집합처이면서 통로의 역할 을 하는 림프절내의 면역 세포 변화를 관찰 한 결과, 총 세포수에서는 薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하여 有意性있게 감소하였다 (Fig. 10). 면역조절 T 세포의 변화를 관찰 하기 위한 CD4

/CD25

세포 비율, 활성화 된 B 세포들의 변화를 관찰하기 위한 CD45R

/CD69

세포 비율에서 모두 薏苡 仁藥鍼群이 Control群에 비하여 감소하였다 (Fig. 10). 이는 薏苡仁藥鍼 足三里 자극으 로 림프절내 면역 증식과 활성에 관련된 T, B 세포를 억제한 것으로 思慮된다.

관절염의 주요 발병처인 관절내 면역 세 포의 변화를 관찰한 결과, 활성화된 T 세포 의 변화를 관찰하기 위한 CD3e

/CD69

세 포 비율, 염증성 과립구의 변화를 관찰하기 위한 CD11b

/ Gr-1

세포 비율 모두에서 薏苡仁藥鍼群이 Control群에 비하여 감소하 였다(Fig. 11). 이는 관절내에서도 薏苡仁藥 鍼 足三里 자극이 염증 반응 중에 나타나는 T 세포와 염증성 과립백혈구의 활성을 억제 한 것이라 생각된다.

따라서, 薏苡仁藥鍼 足三里 자극이 脾臟 內, 림프절내 및 관절내의 면역 세포에 영향 을 미쳐 유효한 면역조절 및 염증 억제 작 용을 보이는 것이라 思慮된다.

관절의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 생쥐 무릎 관절을 절편하여 현미경으로 관

찰하였다. 면역 세포와 활막을 보기위한 H&E stain에서는 Control群에서 관절염에 의한 연골내부의 파괴가 심하게 일어났으나, 薏苡仁藥鍼群은 Control群, Saline群 및 N.P.

群에 비하여 연골의 파괴 및 염증세포의 증 식이 적게 일어나 Normal群과 유사한 상태 를 유지하였다(Fig. 12). Collagen fiber의 상 태를 관찰하기 위한 MT stain에서는 Control群에서 collagen fiber의 구성이 조밀 하지 못하고 연골표면이 매끄럽지 않으며, collagen 섬유 조직이 파괴되어 있는 반면에 薏苡仁藥鍼群은 Control群, Saline群 및 N.P.

群에 비하여 파괴정도가 적어서 Normal群 에 가깝게 유지되었다(Fig. 12).

따라서 薏苡仁藥鍼 足三里 자극이 관절의 조직에도 영향하여 연골 파괴, 활막 증식, collagen fiber의 파괴를 감소시켜 유효한 염 증억제 작용이 있음을 알 수 있었다.

이상 薏苡仁藥鍼 足三里 자극이 류마토이

드 관절염에 미치는 영향을 관절염 지수 및

발병률, 관절의 부종, 몸무게의 변화, 脾臟

및 관절의 외형변화, 혈청 및 脾臟 세포 배

양액에서의 각종 cytokine의 수치, 면역글로

불린 및 antibody의 수치, 脾臟과 림프절 및

관절내의 면역 세포 변화, 관절의 조직학적

변화 등을 통하여 관찰한 결과, 면역 세포

조절과 염증 억제작용에 대한 실험적 유효

성을 관찰할 수 있었으며 향후 이에 대한

지속적 연구와 임상적 응용이 필요하리라

思慮된다.

Ⅴ. 結 論

薏苡仁藥鍼(CS-HA) 足三里 자극이 류마 토이드 관절염에 미치는 영향을 알아보기 위하여 collagen으로 誘發된 생쥐의 관절염 에 足三里를 시술한 후 관절염 지수 및 발 병률, 관절의 부종, 몸무게의 변화, 脾臟 및 관절의 외형변화, 혈청 및 脾臟 세포 배양액 에서의 각종 cytokine의 수치, 면역글로불린 및 antibody의 수치, 脾臟과 림프절 및 관절 내의 면역 세포 변화, 관절의 조직학적 변화 등을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 薏苡仁藥鍼 足三里 자극은 관절염 지수, 발병률, 관절 부종을 감소시켰다.

2. 薏苡仁藥鍼 足三里 자극은 몸무게의 저 하, 脾臟 증대, 유착빈도, 관절변형을 감소 시켰다.

3. 薏苡仁藥鍼 足三里 자극은 혈청내 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IgG, IgM, anti-collagen Ⅱ와 脾臟 세포의 IFN-γ, IL-4, IL-10를 有意性있게 감소시켰으며, IFN-γ/IL-4에서는 유의한 차이가 없었 다.

4. 薏苡仁藥鍼 足三里 자극은 脾臟內 CD3e

+

・CD45R

, CD4

・CD8

, CD4

/CD25

와 림프절내 CD4

/CD25

, CD45R

/CD69

와 관절내 CD3

/CD69

, CD11b

/Gr-1

세포 비율을 감소시켰다.

5. 薏苡仁藥鍼 足三里 자극은 연골 파괴, 염 증세포 증식 및 collagen fiber의 파괴를 감소시켰다.

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