Recurrent parent genome (RPG) recovery analysis in a marker-assisted backcross breeding based on the genotyping-by-sequencing in tomato (<i>Solanum lycopersicum L.</i>)

Abstract Marker-assisted backcrossing (MABC) is useful for selecting an offspring with a highly recovered genetic background for a recurrent parent at early generation to various crops. Moreover, marker-assisted backcrossing (MABC) along with marker-assisted selection (MAS) contributes immensely to overcome the main limitation of the conventional breeding and it accelerates recurrent parent genome (RPG) recovery. In this study, we were employed to incorporate rin gene(s) from the donor parent T13-1084, into the genetic background of HK13-1151, a popular high- yielding tomato elite inbred line that is a pink color fruit, in order to develop a rin HK13-1084 improved line. The recurrent parent genome recovery was analyzed in early

generations of backcrossing using SNP markers obtained from genotyping-by-sequencing analysis. From the BC ₁ F ₁ and BC ₂ F ₁ plants, 3,086 and 4868 polymorphic SNP markers were obtained via GBS analysis, respectively. These markers were present in all twelve chromosomes. The background analysis revealed that the extent of RPG recovery ranged from 56.7% to 84.5% and from 87.8% to 97.8% in BC ₁ F ₁ and BC ₂ F ₁ generations, respectively. In this study, No 5-1 with 97.8% RPG recovery rate among BC ₂ F ₁ plants was similar to HK13-1151 strain in the fruit shape. Therefore, the selected plants were fixed in BC ₂ F ₂ generation through selfing. MAS allowed identification of the plants that are more similar to the recurrent parent for the loci evaluated in the backcross generations. MABC can greatly reduce breeding time as compared to the conventional backcross breeding. For instance, MABC approach greatly shortened breeding time in tomato.

Keywords Background recovery, Molecular marker, rin tomato, Single nucleotide polymorphism (SNP), Tomato elite line

서 언

분자 육종은 형질에서 유래한 표현형의 관찰 없이 DNA 염 기서열의 차이를 보이는 분자 마커(Molecular marker)를 이 용하여 원하는 형질의 유무를 판별하는 기법으로 전통적 선 발 육종 방법에 비해 육종 연한을 단축시키고 우량 개체 선

†

These authors contributed equally to this work.

J. H. Kim

･ Y. J. Jung

･ H. K. Seo ･ K. K. Kang () 한경대학교 원예생명과학과

(Department of Horticultural Life Science, Hankyong National University, Ansung 17579, Korea)

e-mail: [email protected] Y. J. Jung ･ K. K. Kang 한경대학교 유전공학연구소

(Institute of Genetic Engineering, Hankyong National University, Ansung 17579, Korea)

M.-K. Kim 주)토마토연구소

(Tomato Research Center, Cheongju 28112, Korea) I.-S. Nou

순천대학교 원예학과

(Department of Horticulture, Sunchon National University, Suncheon 57922, Korea)

토마토 MABC 육종에서 GBS(genotyping-by-sequencing)에 의한 RPG(recurrent parent genome) 회복률 분석

김종희 ･ 정유진 ･ 서훈교 ･ 김명권 ･ 노일섭 ･ 강권규

Recurrent parent genome (RPG) recovery analysis in a marker-assisted backcross breeding based on the genotyping-by-sequencing in tomato ( Solanum lycopersicum L.)

Jong Hee Kim ･ Yu Jin Jung ･ Hoon Kyo Seo ･ Myong-Kwon Kim ･ Ill-Sup Nou ･ Kwon Kyoo Kang

Received: 7 June 2019 / Revised: 5 July 2019 / Accepted: 8 July 2019

ⓒ Korean Society for Plant Biotechnology

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Research A rticle

발 효율을 극대화시킬 수 있는 장점을 지니고 있다(Edwards and Batley 2010).

최근 들어 가장 대표적인 분자마커 중의 하나인 단일 염기 서열 다형성(Single nucleotide polymorphism: SNP)은 DNA 염 기서열에서 일어나는 단일 염기의 변이로 유전체 전체적으 로 가장 빈번하게 나타나며, 안정적으로 이용할 수 있는 장 점이 있다. 이러한 장점 때문에 식물과 동물의 다양한 유전 연구와 응용이 가능하여 많은 연구가 이루어지고 있다 (Gupta et al. 2001; Kim and Misra 2007). 인간은 평균 1,000개 염기서열 당 1개의 SNP가 1개씩 존재하는 것으로 알려져 있 으며(Wang et al. 1998), 토마토에서는 1,647개의 염기서열 당 1 개의 SNP가 존재하는 것으로 보고되었다(Van Deynze et al.

2007). 최근 여러 작물에서 NGS (Next generation sequencing) 를 통해 해독된 유전체 정보를 기반으로 한 genome-wide SNPs 발굴로 대량의 분자마커를 확보하고 있다(Chagné et al.

2012; Hyten et al. 2010; Trebbi et al. 2011). 또한 SNP는 컴퓨터 를 활용한 in silico 분석을 통해 의학분야와 농업분야에 중요 한 유전자를 확인할 수 있는 유용한 MAB (Marker assisted backcrossing) 마커로 사용되는 등 그 활용 범위가 확대되고 있다(An et al. 2010; Cuesta-Marcos et al. 2010; Xu et al. 2012).

토마토(Solanum lycopersicum L.)는 세계적으로 채소 작물 중 가장 많이 생산되고 소비되는 경제적 가치가 높은 채소일 뿐만 아니라, 가지과 작물의 육종 모델로 이용되고 있다 (Foolad 2007). 2003 년부터 시작된 국제 ‘가지과 유전체 컨소 시엄’을 통해 토마토의 유전체 해독이 완료되었고, 뿐만 아 니라 다양한 유전체 정보(Consortium 2012)와 주요 육종 형질 관련 분자마커, 유전자 지도 등 유전적 정보를 제공 받을 수 있게 되었다(Fulton et al. 2002; Shirasawa et al. 2010). 국내 토 마토 산업은 2007년을 정점으로 현재까지 신종 병충해, 외래 도입 품종, 고유가로 인한 경영비 상승과 소비정체로 침체 를 겪고 있는 상황이다. 최근 출범한 ‘골든씨드 프로젝트’를 통해 국내산 토마토 품종의 점유율을 높이고 종자 수출 확대 를 도모하고자 다양한 유전자원을 확보하고, 평가를 통해 유용 육종 소재를 확충하고자 노력하고 있으며, 최근에는 NGS 를 이용한 대용량 시퀀스 생산이 가속화 되면서 다양한 육종 소재에 대한 sequencing을 통해 유전적 다형성을 탐색 하고, 유용 육종 소재로 이용하기 위한 연구의 중요성이 대 두되고 있다(Chagné et al. 2012; Hyten et al. 2010; Lin et al.

2014; Shirasawa et al. 2013; Trebbi et al. 2011; Xu et al. 2013). 차 세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)의 끊 임없는 발전에 따라 GBS (genotyping by sequencing) 분석은 SNP 검증 방법에 이용 되고 있다. GBS는 유전자 연관지도 작성, 유전체연관분석(Genome-wide association study, GWAS) 을 통한 형질연관 유전자 탐색, MAS와 MABC용 분자마커 선발, 그리고 유전적 다양성 분석을 통한 유전집단 구조 분 석 및 품종식별용 마커 개발 등 다양한 분야에서 활발히 사 용되고 있다(Elshire et al. 2011; Glaubitz et al. 2014; He et al. 2014).

본 연구에서는 저장성이 강한 rin계 대과종 품종 육성을 위해 반복친 HK13-1151과 donor친 T13-1084을 사용하여 BC

F

및 BC

F

세대를 육성하여 rin 유전자를 가진 HK13-1151 엘리트 계통을 육성하고자한다. 따라서 MABC 육종 과정상에서 GBS를 이용하여 반복친 게놈(RPG) 회복 률, 선발 효과 및 유용성 등에 대해 고찰하고자 한다.

재료 및 방법

식물 재료

국내 민간육종회사 주)토마토연구소의 토마토 육종프로 그램으로 개발된 엘리트 계통 HK13-1151과 농촌진흥청 국 립원예특작과학원에서 저장성이 강한 rin 유전자를 가진 T13-1084 계통을 사용하였다. F

식물은 HK13-1151 계통 (recurrent parent) 을 모친으로 T13-1084 계통(donor parent)을 화분친으로 교배하였다. 그리고 BC

F

종자는 F

식물을 HK13-1151 와 여교배 하였다. BC

F

세대에서 유전자를 위한 foreground 선발은 Kim 등(2013)이 보고한 ripening inhibitor 유 전자내 SCAR 분자 마커를 이용하였다. BC

F

세대에서 목 표 유전자 (Rr)을 가지며, 반복친 게놈이 가장 높게 back- ground 마커가 회복되고, 표현형적으로 가장 유사한 식물체 를 선발하여 HK13-1151으로 여교배하고, BC

F

종자를 육 성하였다. 각각의 여교배 세대에서는 엘리트 계통과 함께 foreground, background 및 표현형 선발을 수행하였다. 또한 BC

F

에서 선발한 개체는 BC

F

및 BC

F

세대를 진전시켜 최종 육종소재로 이용하였다. 모든 토마토 육묘는 50공 트 레이에 멸균한 토양을 이용하여 27°C에서 18시간 명조건 및 18°C 에서 6시간 암조건의 생장상에서 생육시킨 후, 8매 잎 상태일 때 한경대학교 원예생명과학과 온실에 옮겨 생장 시 켰다.

Foreground 선발

Rin/rin 관련 유전자형을 동정하기 위하여 Kim 등(2013) 보고

한 SCAR 마커를 이용하였다. DNA 추출을 위한 잎 샘플링은

발아 후 21일 육묘로부터 수행하였다. 게놈 DNA는 CTAB

(cetyltrimethyl ammonium bromide) 법을 사용하여 추출하였

다(Saghai-Maroof et al. 1984). DNA 농도는 Nanodrop spectro-

photometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) 으

로 측정하였으며, 최종농도는 TE buffer (pH 7.0)을 이용하여

20ng μl

로 조정하여 사용하였다. DNA의 순도 및 양의 체크

를 위해 1% agarose 겔에서 전기영동을 통해 확인한 후에 수

행하였다. PCR 반응 조성액은 10 × buffer, 0.2 mM dNTP, 0.5

mM forward primer (Rin-F: 5’-AAGTGTACAATATAGACAT

GAACAGCCTTCT-3’), reverse primers (Rin-R1: 5’-CCATACT

CTTCTTGACAATAAATATATCACAAT-3’, Rin-R2: 5’-AAA GCAACTTCAGCATCACA-3’), 40ng genomic DNA, and 0.5U Taq DNA polymerase (Genet Bio Inc., Korea) 를 혼합하여 20 μl 로 조정하여 사용하였다. PCR 증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) 를 이용하였고, 반응 조건은 94°C에서 2분 denaturation 후, 94°C에서 30초, 60°C에 서 30초, 72°C에서 1분의 세 과정을 35회 반복 수행하였다.

그리고, 72°C에서 10분 elongation을 마지막 단계로 진행하였 다. PCR 산물은 EtBr로 염색한 1% agarose gel상에서 200 V로 40 분 전기영동하였다. 다형성은 UV transilluminator에서 분 석하였다.

GBS 를 통한 NGS 데이터 생산

양친, F

, F

, BC

, BC

세대의 유묘로부터 얻어진 본엽 3 ~ 4매 를 액체질소 처리후 막자사발로 마쇄한 뒤, GeneAll®Gene Ex

Plant kit (GeneAll Biotechnology Co., LTD, Seoul, Korea) 를 이용하여, 농도 100μg/μl, 순도 260/280=1.8 ~ 2.0, 260/230=

1.6 이상인 genomic DNA를 추출하여, 정량화 하였다. 추출된 DNA sample 의 adapter ligation을 위해, 제한효소 ApeKI을 이 용하여 75°C에서 2시간 동안 digestion 하였다. 이후 96-well plate 에 1.66 x ligase buffer, ATP와 T4 ligase가 포함된 solution 을 처리하여 adapter ligation을 수행하였고, DNA sample들을 pooling 한 후 QIAquick PCR Purification kit로 clean up 하고, PCR 을 95°C에서 2분간 반응 후, 98°C에서 30초, 65°C에서 30 초, 72°C에서 30초 (18 cycles), 72°C에서 5분의 조건으로 수행 하였다. GBS library의 염기서열 분석은 Hiseq2000 (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) 을 이용하여 수행하였다.

SNP 탐색 및 background 분석

Barcode sequence 정보를 이용하여 demultiplexing 후, adapter sequence 제거 및 sequence quality trimming을 하였다. Cutadapt (v.1.8.3) 프로그램을 이용하여 adapter trimming을 수행하였 고, SolexaQA (v.1.13) package의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 이용하여 trimming 및 quality control을 다음의 조 건에 따라 수행하였다 1) Probability value ≧0.05, 2) Phred score ≧20, 3) minimum length of reads ≧25bp. 전처리 과정을 거친 read들의 mapping은 BWA (0.6.1-r104) 프로그램을 이용 하여 ICuGI에서 얻은 표준유전체 정보(Cirullus lanatus cv.

97103) 를 바탕으로 수행한 후 SNP 탐색을 위한 SAM format file 을 제작하였다. SEEDERS in-house script을 이용하여 SNP validation 을 수행한 후, SAMtools (v.0.1.16)을 이용하여 SNP filtering (min.depth ≧3, MAF>5%, missing data<30%)을 한 후 SNP matrix 를 작성하였다. 이후 SEEDERS in-house script를 활용하여, reference gene position (ICuGi)을 기반으로 SNP annotation 을 수행하고, SNP filtering과 genotyping 조건(reference

sequence 와 동일한 homozygous –‘A’ 다른 homozygous –‘B’, heterozygous –‘B’, missing –‘-’)에 부합하는 genotype 데이터 를 완성하였다.

통계분석

Foreground 선발에서 rin 마커로 분석하여 얻어진 결과는 HK13-1151 유래 RR형, T13-1084 유래 rr형, 이종접합체 Rr형 으로 표시하였다. 카이자승 분석은 공식, Chi

= ∑(O－E)

/E, 여기에서 O는 관찰치, E는 기대치 값으로 계산 하였다.

Background 선발에서 마커로 부터 얻어진 데이터는 Graphical Genotyper (GGT 2.0) 소프트웨어에 의해 분석하였 다. 반복친과 같은 homo 대립 유전자, donor친과 같은 homo 대립유전자 그리고 헤테로 대립유전자는 각각 A, B 및 H로 각각 표시하였다. 이들 데이터는 Microsoft Excel file에 넣어 GGT 2,0 소프트웨어에 의해 분석하여, 반복친 호모마커 페 센트(% RR), donor 대립유전자 페센트(% rr), 헤테로 페센트 (% Rr) 를 계산하였으며, 반복친 HK13-1151 계통과 여교배에 의해 선발된 rin 계통들 사이의 표현형 데이터를 수치화 하 였다.

결과 및 고찰

토마토 반복친 엘리트 HK13-1151 계통의 특성

저장성이 강한 대과종 토마토 육성을 위해 사용한 엘리트 계통은 2014년부터 주)토마토연구소에서 육성한 것을 이용 하였다. 또한 HK13-1151은 pink계 편구형 토마토이며 평균 과중은 260 g이고 토마토황화잎말림 바이러스(TYLCV)의 Ty1, Ty3 유전자, 토마토모자이크 바이러스(ToMV)의 Tm2a 유전자, 시들음병(Fusarium)의 F

유전자, 근부위조병 (Fusarium radicis)의 Fr 유전자, 뿌리혹선충(Nematode)의 N 유전자, 반신위조병(Verticillium)의 Ve 유전자, 잎곰팡이병 (Cladosporium)의 Cf 유전자, 토마토 앞마름 역병(phytophthora infestans)의 Ph3 유전자 및 토마토 반점시듦병(spotted wilt virus)의 Sw5 유전자 등을 지니고 있는 복합내병성 계통이다 (Table 1).

rin 유전자를 이용한 foreground 선발

F

종자는 HK13-1151 계통과 T13-1084 계통 간 교배를 통

해 생산하였으며, F

식물체는 selfing에 의해 F

종자를 육성

하여 이용하였다. F

및 F

세대에서 Rin SCAR 마커를 이용하

여 foreground 선발을 위한 유효성분석을 조사하였다. Rin

SCAR 마커의 경우, 이 프라이머를 PCR에 적용한 결과는

Rin-F 와 Rin-R1은 800 bp, Rin-F와 Rin-R2는 1500 bp 밴드를 도

출하면서 RR, Rr, rr 계통을 구별하는 공우성 분자표지가 확 보되었으며 F

집단에서 1: 2: 1로 분리되었다(Table 2). 또한 분리된 식물체의 성숙한 과일을 조사 하였을 경우, rr의 유전 자형은 그린의 과실을 가진 것으로 미루어 볼 때, 저장성을 가진 토마토육성을 위한 여교배용 foreground 선발 마커로 활용 가능하다고 판단되었다.

BC ₁ F ₁ 세대의 유전자형분석

Foreground 선발을 위해 헤테로 접합체를 가진 F

식물은 HK13-1151 계통과 여교배하여 100개의 BC

F

식물체를 육 성하였다. BC

F

세대에서 rin 마커를 이용하여 foreground 선 발한 결과 카이자승 실험을 통해 BC

F

세대에서 1:1으로 잘 분리되었다(Table 2). 조사한 100개의 BC

F

식물체 중에서 Rinrin 형은 42개였다. 선발한 42개 식물체들을 포장에 옮겨 표현형을 조사한 결과 모두 pink계 과실을 보였다. 이들 계통 들의 total DNA를 추출하여 ApeKI으로 소화한 후 GBS library 를 구축하고, NGS에 의해 sequencing 데이터를 얻었다. BC

F

세대에서 GBS를 통해 총 3086개의 SNP가 다형을 보였다 (Table 3, Fig. 1). 이를 토대로 각각의 계통에서 dornor친 유래 의 게놈이라고 생각되는 heterozygote SNP를 데이터화 하였 다. 그 결과 BC

F

세대에서 반복친(RPG) 회복 비율은 56.7%

에서 84.5%의 범위를 보였으며, 평균 70.8% 였다(Fig. 2). 이 들 수치는 멘델의 법칙에 따른 반복친 게놈의 회복률의 이론 치 75%에 미달 되었다. Randhawa 등(2009)의 보고에 의하면 여교배 후대의 background 마커는 염색체상의 거의 동등한 거리로 약 20cM가 적당하며, BC

F

세대에서 91.5%의 RPG회 복률을 가진 개체를 선발했다고 하였다. 그러나 본 실험에 서는 3086개의 GBS 유래 SNP의 genotyping 결과로 마커 수가

Randhawa 등(2009)이 사용 한 것보다 많아 BC

F

세대에서의 평균 RPG 회복률이 낮게 나타난 것으로 생각된다. 또한 MABC 프로그램의 효율을 결정하는 또 다른 중요한 요인은 도입하려고 하는 표적유전자수, 마커 지도, 교차율 및 적용 되는 선발 전략 등 이라고 하였다(Servin and Hospital 2002;

Collard and Mackill 2008) 따라서 본 연구 결과를 토대로 BC

F

세대에서 RPG 회복률이 75% 보다 높은 82.5% 개체를 이용하여 BC

F

세대를 육성하였다.

Table 1 Morphological character and disease resistance of HK13-1151 and T13-1084 inbred line used for the tomato marker assisted backcrossing program

Line Growth habit Maturity days

Fruit shape

Av. fruit weight (g)

Fruit color

Shoulder

color* Firmness** Brixº Disease resistance***

HK13-1151 Indeterminate 100-110 Cylindrical 300.5 Pink G F 6.0 Ty1, Ty3, Tm2a, F2, F3, Fr, Ve, N, Cf, Ph3, Sw5 T13-1084 Indeterminate 90-110 Cylindrical 201.3 rin U FF 5.0 Tm2a, F2, N, Cf, Sw5

*Shoulder color: U (uniform), G (green),**Firmness : MF (medium firm), F (firm), FF (very firm), ***Disease resistance : Ty1 and Ty3 (Tomato yellow leaf curl virus), Tm2a (Tomato mosaic virus), F2 (Fusarium race 2), F3 (Fusarium race 3), Fr (Fusarium radicis), Ve (Verticilium), N (Nematode), Cf (Cadosporium), Ph3 (Phytophthora infestans), Sw5 (Tomato spotted wilt virus)

Table 2 Genotyping results of the foreground selection in backcross population of HK13-1151 x T13-1084

Population Generation Number of plant

Expected ratio χ

P-value

Total RR Rr rr

HK13-1151 x T13-1084

BC

F

100 58 42 - 1:1 0.75 0.25<P<0.50

BC

F

192 90 102 - 1:1 2.56 0.10<P<0.25

Table 3 Number of polymorphic SNP per 12 chromosome obtained from GBS experiments according to the individual plants of each generation

Chromosome

BC

F

BC

F

No. of

polymorphic SNP

No. of polymorphic SNP

chr00 30 64

chr01 139 396

chr02 193 523

chr03 187 42

chr04 149 216

chr05 233 772

chr06 896 787

chr07 220 357

chr08 129 238

chr09 171 939

chr10 126 218

chr11 168 86

chr12 245 330

Total 3,086 4,868

BC ₂ F ₁ 세대의 유전자형분석

BC

F

세대에서 선발한 RPG 회복률이 82.5%인 식물체로부 터 얻어진 BC

F

세대에서는 RR : Rr 분리비가 1:1로 잘 분리 되었으며, 총 192개 중 102개 식물체는 Rr으로 확인되었다 (Table 2). Background 선발을 위해 BC

F

세대에서 foreground 선발을 통해 얻어진 102개중에서 88개 BC

F

식물체를 대상 으로 RPG 회복 정도를 확인하기 위해 GBS 분석을 수행하였

다(Fig. 1). 그 결과 88개 BC

F

식물들간 다형 SNP는 4,868개 를 얻었으며 RPG 회복정도를 조사한 결과는 87.8%에서 97.8% 범위를 보였다(Table 3, Fig. 3). Collard and Mackill (2008) 등의 보고에 의하면 BC

F

세대에서 개체수를 200개 가까이 조사한 결과, 거의 99%의 RPG 회복 개체수가 출현한 다고 하였다. 본 연구에서는 BC

F

의 Rr형 개체수가 42개로 background 선발을 위해 비교적 적은 수를 이용하였기 때문에 BC

F

세대에서는 Rr형 개체수를 192개로 하여 background을 Fig. 1 Genotyping results of the background selection in backcross populations. (A) Genotyping results for the BC

F

population of a total of 42 individuals and 3,086 SNP markers were used. The highest recovery rate was 84.5% and the lowest recovery rate was 56.7%. (B) Genotyping results of BC

F

population of a total of 88 individuals and 4,868 SNP markers were used. The highest recovery rate was 97.8%, while the lowest recovery rate was 87.8%

Fig. 3 Frequency distribution of the recurrent parent genome recovery (%) in BC

F

population

Fig. 2 Frequency distribution of the recurrent parent genome

recovery (%) in BC

F

population

수행한 결과, Collard and Mackill (2008)가 보고한 결과와 일치 하였다. 본 실험에서 BC

F

세대의 개체들에서 rin 마커에 의 해 선발한 donor친 유래 단편은 염색체 5번에 속해 있었으며, 4 번, 6번, 8번 12번 염색체의 segment를 제외하고 선발된 식물 체들에서 거의 대부분이 회복 되었다(Fig. 1). 따라서 반복친 HK13-1151 계통과 RPG 회복 정도가 높은 3개체를 대상으로 표현형을 조사한 결과 No. 5-1 식물체가 표현형이 가장 유사 하여 자가수정을 통해 BC

F

종자를 육성하였다(Table 4). 본 연구에서 개발된 GBS분석을 이용한 MABC 적용은 반복친 게놈 회복률 높일 수 있는 방법으로 생각되고, NGS 분석 및 SNP 정보를 원활하게 이용 한다면 비교적 손쉽게 사용가능 하다고 생각된다. 그러나 매번 GBS library 구축 등의 기술적 인 문제점이 야기될 수 있다. 따라서 GBS 분석을 통해 개발 된 SNP 마커들의 fluidigm chip (EP1 system)이나 array와 같은 SNP 자동화 분석 플랫폼(Thomson 2014; Wang et al. 2009)에 적합한 형태로의 마커전환과 이를 이용하여 보다 폭 넓은 여 교잡 육종용 background chip 개발이 절실한 상태이다.

적 요

Marker-assisted backcrossing (MABC) 은 marker-assisted selection

(MAS) 와 함께 다양한 작물에서 여교배 초기세대에서 반복 친 게놈의 회복률이 높은 개체선발을 위한 분자육종 기술로 매우 유용하게 사용하고 있다. 본 연구에서는 토마토 MABC 육종 프로그램의 일환으로 저장성이 강한 rin유전자를 주)토 마토연구소에서 육성한 핑크계 엘리트 토마토계통에 도입 하고자 수행하였다. foreground 선발은 RIN SCAR 분자 마커 를 이용하여 100개 BC

F

식물체에서 Rr 유전자형 가진 42개 체를 선발하였다. 그리고 이를 이용하여 GBS 분석을 이용하 여 background 선발을 하였다. 총 3,086개 SNP를 대상으로 반 복친 HK13-1151과 게놈 회복률을 조사한 결과, 56.7%에서 84.5% 를 보여 평균 70.5%로 나타났다. 이 중 87.2%을 보인 BC

F

개체를 이용하여 192개 BC

F

식물체를 육성하여 fore- ground 선발을 하였다. 선발된 102개 중 88개 식물체를 이용 하여 GBS 분석을 수행한 결과 4,868개의 다형 SNP 마커를 얻 었으며, 이를 이용하여 RPG 회복률을 조사하였다. BC

F

식 물체들에서 HK13-1151 반복친 게놈과 87.8%에서 97.8% 유 사하였다. 본 연구에서 BC

F

식물 중 RPG 회복률이 97.8%인 5-1 개체는 반복친인 HK13-1151과 과일특성에서 매우 유사 하였다. 따라서 선발된 5-1 개체는 BC

F

세대를 육성하여 계 통화 하고자 한다. 본 연구를 통해 MABC는 전통 여교배 육 종에 비해 육종연한을 획기적으로 줄일 수 있으며, 원하는 육 종모델을 완수할 수 있는 첨단육종 기술로 평가 할 수 있다.

Table 4 Agro-morphological trait performance of improved lines in comparison with recurrent parent HK13-1151

Plants

Fruit weight (g)

Fruit height (mm)

Fruit width (mm)

Fruit hardness

(kg)

Brix Plants

Fruit weight (g)

Fruit height (mm)

Fruit width (mm)

Fruit hardness

(kg) Brix

BC

F

HK13-

1151 260.7 122.2 134.8 13 6.0

BC

F

31-1 254.2 122.0 140.9 1.3 6.0

2-2 239.4 124.1 139.1 1.5 4.8 32-3 220.9 127.8 145.4 0.9 5.8

3-2 239.3 131.2 147.6 1.2 5.2 33-2 309.4 148.4 132.0 1.0 6.0

4-4 209.5 124.7 130.9 1.0 5.3 36-4 234.8 130.5 147.3 1.9 5.0

5-1 260.9 132.2 137.8 1.2 6.1 38-1 228.9 146.0 137.7 1.4 5.5

6-3 238.9 129.1 120.5 1.0 5.4 39-1 232.4 133.1 138.8 1.0 5.5

7-4 268.0 134.1 130.7 0.95 6.0 40-1 263.1 133.6 149.0 0.8 5.9

8-4 264.0 125.5 131.1 1.7 5.0 41-2 257.0 144.3 131.6 1.2 5.5

9-1 211.1 120.3 125.1 1.0 5.0 42-2 196.5 147.2 138.1 1.0 5.5

12-1 216.5 134.8 139.9 1.0 4.9 43-2 258.5 145.8 138.5 1.65 5.9

13-2 243.9 140.9 149.8 1.3 4.8 44-1 222.5 140.5 130.7 0.835 5.4

15-1 240.3 127.7 130.6 1.0 5.0 45-1 228.3 149.5 125.3 1.3 5.4

17-2 217.8 137.0 137.7 1.1 5.0 46-1 197.2 146.7 139.8 0.92 5.3

19-4 232.9 124.0 133.0 0.8 5.5 47-2 216.4 148.5 121.9 1.01 5.1

20-7 237.5 123.8 146.3 1.0 4.9 49-3 200.9 145.1 130.4 1.045 5.0

21-2 211.2 130.3 132.0 1.5 6.0 50-1 221.7 130.4 129.7 0.98 5.5

22-2 188.9 136.7 130.3 1.3 5.0 51-1 227.6 132.2 124.0 1.3 5.9

23-3 213.8 123.4 122.7 0.9 5.1 53-1 197.0 146.2 137.5 1.45 5.8

25-4 188.4 127.8 136.6 0.9 5.1 56-3 180.5 133 132.8 0.87 5.3

27-6 197.7 139.2 120.3 1.6 5.9 58-1 184.4 141.5 121.5 1.7 5.5

28-5 164.2 125.1 132.7 0.4 5.0 61-1 195.1 148.6 136.7 0.9 5.9

29-3 164.5 121.3 130.8 1.1 6.0 62-1 218.0 135.4 134.4 1.8 5.3

30-3 176.0 127.2 134.4 1.4 6.0 63-1 215.5 122.3 130.6 1.45 6.0

사 사

본 연구는 농림식품기술기획평가원에서 시행하는 골든씨 드 프로젝트(원예종자 사업단: 213007-05-3-SBD30)과 2017 년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재 단의 지원을 받아 수행된 중견연구사업(과제번호: 2017 R1A2B4007473) 에 의해 이루어진 것임.

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