효모 Pichia burtonii Y257-7에 의한 α-Glucosidase 저해제의 생산 및 식후 혈당 상승 억제 효과
김영헌, 신자원, 이종수*
배재대학교바이오· 의생명공학과
Received: May 29, 2014 / Revised: July 10, 2014 / Accepted: July 13, 2014
서 론
최근우리나라사람들의식습관서구화에의한과잉영양
섭취로비만과당뇨병이증가하여사회문제가되고있다[24].
당뇨병은일반적으로췌장에서분비되는인슐린의분비이 상이나유전적이상으로혈액이고혈당증세를나타내는대 사성만성질환의일종이다. 당뇨병은크게 1형당뇨와 2형 당뇨로구분하는데 1형당뇨의경우인슐린의존성으로인 슐린주사를이용한혈당조절이필수적이며, 2형당뇨의경
우는인슐린비의존성당뇨로당뇨병전체의 80-90%를차
지하고있으며, 혈당조절을위해경구용혈당강하제를사용 하며인슐린주사를병행하기도한다[25].
현재당뇨병치료제중경구용혈당강하제로도사용되고
있는 α-glucosidase 저해제는 소장 점막의 융모에 있는
maltase와 sucrase 등이당류소화효소류를동시에저해하 며, 따라서전분으로부터포도당분해가저지되고소장융모
에서포도당의흡수를지연시켜혈당상승을억제시켜주는 효과를나타내게된다[19, 22].
현재 시판 항당뇨성 α-glucosidase 저해제로 acarbose [20], voglibose [16], 1-deoxynojirimycin [2] 등이사용되고 있지만이들은복부팽만, 구토, 설사등의위장장애를나타 낼뿐만아니라미분해된이당류가대장에서박테리아에의 해분해되어가스, 설사, 변비등과같은부작용을야기시킬 수있다[23]. 또한 α-glucosidase를완전히저해시킬경우당 의흡수율이현저히떨어져저혈당증상이발생하므로치료 제로사용하는데문제점이있다[4, 14]. 따라서이러한부작 용을줄이고식후혈당상승억제효과를낼수있는새로운 α-glucosidase 저해제개발은매우필요하다.
효모는 Cryptococcus sp. 등몇몇균주이외에대부분이비
병원성 GRAS 진균류로오래전부터주류등발효식품생산
에매우유용하게이용되어오고있고[11] biomass와분자
생물학적연구의재료(숙주)등으로많이이용되고있다. 또 한, 일부효모는비타민등다양한영양성분들을함유하여 식 · 사료의영양보충제로쓰이고있고, 최근항고혈압활성, 항암성, 항균성등의다양한생리기능성이보고되어있다[9,
11]. 그러나배양이비교적용이한효모로부터항당뇨효과
Production and Anti-hyperglycemic Effects of α-Glucosidase Inhibitor from Yeast, Pichia burtonii Y257-7 Young-Hun Kim, Ja-Won Shin, and Jong-Soo Lee*
Department of Biomedical Science and Biotechnology, Paichai University, Daejeon 302-735, Republic of Korea
In order to develop a new anti-diabetic α-glucosidase inhibitor, we compared the α-glucosidase inhibitory activity of the cell-free extracts of 48 strains of yeasts isolated from Korean fermented foods, and found that Pichia burtonii Y257-7 exhibited the high- est α-glucosidase inhibitory activity of 55.6%. The α-glucosidase inhibitor was maximally produced when Pichia burtonii Y257- 7 was cultured in LB broth (initial pH of 6.0) at 28oC for 24 h. The α-glucosidase inhibitor, partially purified by Sephadex G-50 gel permeation chromatography and systematic solvents extraction, revealed potent hypoglycemic effects in normal rats and streptozotocin-induced diabetic rats after the oral administration of starch.
Keywords: Anti-hyperglycemic, α-glucosidase inhibitor, Pichia burtonii Y257-7
*Corresponding author
Tel: +82-42-520-5388, Fax: +82-70-4362-6305 E-mail: [email protected]
© 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
를가진α-glucosidase 저해제의연구는현재까지많이이루 어지지않고있다[12].
따라서본연구에서는효모로부터새로운항당뇨소재를 개발할목적으로전통발효식품에서분리한효모들중α-
glucosidase 저해물질을생산하는우수효모균주를선발하
고α-glucosidase 저해제생산최적조건을검토하였다. 또한 선발균주가생산하는α-glucosidase 저해물질을부분정제한 후일반쥐와당뇨유발쥐를이용한항당뇨효과를조사하 였다.
재료 및 방법
실험재료
48종의효모는한국식품연구원으로부터전통발효식품에 서분리, 동정한효모들을분양받아사용하였다.
α-glucosidase와 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (p- NPG)는미국의 Sigma-Aldrich Chemial 제품을사용하였고 Sepadex G-50은 Pharmacia Fine Chemicals (Sweden) 제 품을사용하였으며, 그밖의시약은분석용특급을시중에서 구입하여사용하였다.
효모 배양 상등액 및 무세포 추출물 제조
48종의효모들을 LB 배지에접종하여 28oC에서 12시간 배양한후원심분리 (20 min, 12,000 rpm, 4oC)하여상등액 을얻고, 이를동결건조시켜배양상등액시료로하였다. 또 한배양액을원심분리(20 min, 12,000 rpm, 4oC) 하고침전 된 cell pellets를 회수하여 Tris-HCl buffer로 세척한 후 bead를이용하여세포를파쇄하고원심분리한후동결건조 시켜무세포추출물시료를제조하였으며α-glucosidase 저 해활성측정에사용하였다.
α-Glucosidase 저해활성 측정
α-glucosidase 저해활성은 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8)에 0.2 U/ml로희석한표준α-glucosidase 효소액 50μl와시료 50μl를 96-well plate에넣고 37oC에서 5분간반응시킨후 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8)을이용하여 5 mM로희석한기 질 p-NPG 용액 50μl를첨가한후 37oC에서 25분간반응시 켰다. 반응후 0.1 M sodium carbonate를 100μl 넣어반응
을 정지시킨 다음 ELISA 측정기로 405 nm에서 p-
nitrophenol 함량을측정하였고이를대조구와비교하여다
음과같이저해활성을계산하였다[10].
α-Glucosidase 저해활성 (%) = (C − T)/C × 100 C: 대조구의 p-nitrophenol 함량, T: 시료첨가후생성된 p- nitrophenol 함량.
α-Glucosidase 저해물질 생산 조건
최종선발균주를이용한α-glucosidase 저해물질최적생 산조건으로먼저선발균주를 LB 배지에접종하여 25oC에 서 72시간까지일정시간간격으로배양한후위와같이각
각의무세포추출물을얻어서이들의α-glucosidase 저해활
성을측정하여최적배양시간을검토하였다.
또한 LB 배지와 YPD 배지, PDB, TSB, YM, MRS 배지 등에선발균주를접종하고 25oC에서 24시간배양하여위와 같이최적배지를검토하였고, 초기 pH를 4.0-10.0까지각각 조정한최적배지에위와같이선발균주를배양하여배지의 초기 pH의영향을검토하였다.
Rat Sugar Loading Test
실험동물 준비:실험동물은생후 6주령(180-200 g)된수 컷 SD-rat과조단백질 20.5%, 조지방 3.5%, 조섬유 8.0%, 회 분 8.0%, 칼슘 0.5%와인산 0.5%의조성을가진마우스렛 전용사료를㈜대한바이오링크에서구입하여, 온도 22±1oC, 습도 55±7%, 낮밤주기 12시간으로유지되는동물사육실
에서일주일간매일 18-20 g씩물과함께섭취시키며적응
시켰다[6].
실험동물을무작위로정상군과당뇨유발군으로나누고다 시이를각각대조군과실험군으로나누었다. 당뇨유발은 공복상태인 SD-rat에 0.1 M citrate buffer (pH 4.5)에용해 시킨당뇨유발물질 streptozotocin (STZ, 60 mg/kg, Sigma) 를 1회복강주사하여 3일후혈당측정기(동방휴면텍, Accu- Chek Active)로측정한후혈당치가 300 mg/dl 이상인 SD- rat만을선발하여당뇨 SD-rat로실험에사용하였다[1, 7, 15].
본연구는실험동물의사육에대한배재대학교동물실험 윤리위원회의가이드라인(등록번호: 2013-001)을토대로진 행하였다.
α-Glucosidase 저해물질의 부분정제: 선발균주를α-
glucosidase 저해물질최적생산조건으로배양한후위와같
이무세포추출물을제조한다음동결건조하고멸균수로다 시용해시키고 0.45μm와 0.25μm filter로여과하였다. 이 여과액을 Sephadex G-50 chromatography로활성 분획을 얻은다음 hexane과활성분획을 1:1로혼합하여 1시간진탕
시킨후, 물층과 hexane층을각각분리하여이들을동결건
조시켜위와같이 α-glucosidase 저해활성을측정하였다. 활 성층을다시 chloroform과 ethyl acetate 용매들을이용하 여순차적으로같은방법으로각각 1시간씩연속용매추출 하여활성분획을얻고이를 butanol로마지막으로추출하여 활성분획을얻어동결건조시켜최종부분정제물로하였고 이를동물실험용시료로사용하였다.
혈당 상승 억제 효과 측정:탄수화물식이후혈당조절 에미치는효모추출물의영향을조사하기위해일반 SD-rat
와당뇨유발쥐에대하여전분과효모추출물을각각 1회투 여후단기혈당변화를조사하였다. 정상군은일반 SD-rat 을가지고대조군에는멸균수를투여하고실험군은부분정 제물을동결건조한시료를 500 mg/kg, 1000 mg/kg의농도 로경구투여하였으며시판혈당강하제인 acarbose(글루코 바이정 50 mg, 바이엘코리아)는 15 mg/kg를경구투여하고 starch를 3 g/㎏로투여한후시간별로혈당을측정하였고, 당뇨유발군도같은방법으로실험하였다. 혈중포도당의변 화는꼬리정맥에서혈액을체취하고혈당측정기(동방휴면 텍, Accu-Chek Active)로측정하였다.
통계처리
동물실험에서 statistical analysis system에의한 Duncan의
다범위 검정 시험법(multiple range test)을 이용하여
p < 0.05에서각각의시료간의유의적차이를검증하였다.
결과 및 고찰
α-Glucosidase 저해물질 생산 균주의 선발
한국전통발효식품에서분리한 48종의효모들을 28oC에 서 12시간배양하여위와같이제조한배양상등액과무세 포추출물들을동결건조한후다시 1 ml의 0.1 M 인산완 충용액(pH 6.8)에용해시켜α-glucosidase 저해활성을측정
하였다(Table 1).
48종의효모중 13종만이 10% 이상의α-glucosidase 저해 활성을보였고특히청주누룩에서분리한 Pichia burotnii Y257-7의무세포추출물의α-glucosidase 저해활성이 55.6%
로가장높아우수균주로최종선발하였다. 또한, 모든효모 들의배양상등액은α-glucosidase 저해활성이없었다.
이결과는 Kang 등[10]의 Aspergillus oryzae N157-1 배 양상등액의 48.3%와 Lee 등[13]의한약재인토우슬의물추 출물(9.2%)과에탄올추출물(10.9%) 및이들의에틸아세테
이트와핵산추출물(12.8%)들의저해활성보다높은저해활
성이었다. 한편, Chin 등[5]은뽕나무에서분리한 steppogenin 과 oxyresveratrol이효모α-glucosidase를각각농도의존적 으로경쟁적, 비경쟁적으로저해하였다고보고한바있다.
최종선발균주인 Pichia burotnii에관한주요연구로는 Pichia burotnii로부터α-amylase와 lipase[21]생산에관한 연구들이있고 Guo 등[8]은 Pichia burotnii가소아설사치 료로사용되는전통의약인 Qiweibaizhusan과장내에서상 호작용함을보고한바있다. 그러나 Pichia burotnii의항당 뇨효과에관한연구보고는본연구가처음으로선발균주와
이균이생산하는α-glucosidase 저해물질을앞으로대체의
약이나건강소재로산업적으로유용하게응용될수있을것 으로사료된다.
α-Glucosidase 저해물질 최적생산 조건
선발균주를 LB 배지(pH 6.0)에접종하여배양시간에따
른생육과α-glucosidase 저해활성을측정한결과 Fig. 1과
같이균생육이정지기에도달한배양 24시간에 90.9%의가
장높은α-glucosidase 저해활성을보였다.
또한, LB, YPD, PDB, TSB, YM, MRS 등의배지를이용
하여α-glucosidase 저해물질생산에미치는배지의영향을
검토한결과는 Table 2와같다. 선발균주인 Pichia burtonii Table 1. α-Glucosidase inhibitory activities of cell-free extracts
from the 1st screened yeasts.
Yeastsa α-glucosidase
inhibitory activity (%)b
Pichia caribbica Y101-4 41.1± 0.8
Pichia anomala Y103-4 45.5± 0.7
Saccharomyces cerevisiae Y111-5 21.0± 0.4 Pichia caribbica isolate Y162-8 17.6± 0.6
Pichia anomala Y169-6 34.3± 0.7
Saccharomyces cerevisiae Y172-8 45.2± 0.5
Pichia burtonii Y197-9 43.2± 0.4
Pichia burtonii Y257-7 55.6± 0.6
(IC50 1.82 mg/ml) Saccharomyces cerevisiae Y64-3 43.1± 0.6
Pichia burtonii Y86-5 44.7± 0.8
Saccharomyces cerevisiae Y89-1-3 13.6± 0.5 Saccharomyces cerevisiae Y91-5 27.7± 0.7 Saccharomyces cerevisiae Y98-5 43.5± 0.5
aYeast were cultured at 28oC for 12 h and then centrifuged to obtain supernant and cell-free extracts.
bAll of supernatants were not showed α-glucosidase inhibi- tory activity.
Fig. 1. Effect of cultural time on the cell growth and α- glucosidase inhibitory activity of Pichia burtonii Y257-7.
Y257-7를 LB 배지에서배양하였을때α-glucosidase 저해활 성이 90.9% (IC50; 1.92 mg/ml)로가장높았고, YPD 배지에 서도 79.5% (IC50; 3.9 mg/ml)로비교적높은저해활성을보 였다.
최적생산배지로선정된 LB 배지를이용하여배지초기 pH의영향을검토한결과, 생육은 pH 6.0에서가장양호하 였고α-glucosidase 저해활성도 pH 5.0-7.0에서큰차이없 이 90% 이상을보였다(data not shown).
이상의결과들을종합했을때, α-glucosidase 저해물질은 선발균주인 Pichia burotnii Y257-7를 LB 배지(pH 6.0)에 접종하여 28oC에서 24시간배양하였을때가장많이생산되 었다.
α-Glucosidase 저해물질의 부분정제 및 식후 혈당 상승 억제 효과
Pichia burotnii Y257-7 무세포추출물을동결건조한후 멸균수로 희석하고 0.45μm와 0.2μm disposable syringe filter unit로여과한후 Sephadex G-50 column chromato- graphy를실시하여활성분획 F-1 (IC50 0.86 mg/ml)을얻었 다. 이 활성 분획물을 동결건조 후 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol과물까지순차적으로용매추출하여 각각의추출물들에대한저해활성을측정한결과마지막단 계인물추출물에서가장높은저해활성(79.3%, 수율: 57.7%) 을보여 Pichia burtonii Y257-7이생산하는α-glucosidase 저해물질은 친수성 물질로 판단하였다. 이 친수성 α-
glucosidase 저해물질을동정하기위해서먼저단백질과펩
타이드, 당단백질실험법[18]으로효모추출물을확인한결 과단백질이나펩타이드, 당단백질과는다른물질이었다. 따
라서본실험의효모추출물에함유되어있는α-glucosidase
저해물질은아마도최근보고된 polyphenol 계통의 tannic
acid [3]로추정되었고보다확실한물질동정을위해서는추
가의정제실험이요구된다.
일반 SD-rat에서의 혈당 상승 억제: 위와같이얻은 Pichia burtonii Y257-7의α-glucosidase 저해물질의 부분 정제물을동결건조한후 500 mg/kg, 1000 mg/kg의농도로
전분 3 g/kg과함께경구투여하였고시간별로혈중포도당
함량의변화를측정하였다(Fig. 2).
일반 SD-rat의평균혈중포도당함량은 80±10 mg/dl를
보였고대조구인멸균수를경구투여한 SD-rat에서는혈중
포도당이 5분후엔 122±4.2 mg/dl로급격히증가하여 30분 까지변화없이 122±6.1 mg/dl의혈중포도당함량을보였 으며, 투여 120분후엔정상의혈중포도당함량으로다시 낮아졌다.
그러나α-glucosidase 저해제의부분정제물을 500 mg/kg,
1000 mg/kg의농도별로투여한실험군에서는 5분후각각
105±7.0 mg/dl, 94±5.1 mg/dl의혈중포도당함량을보여 이는일반 rat의혈당함량보다농도의존적으로 17 mg/dl, 26 mg/dl 낮아α-glucosidase 저해제의부분정제물이혈당 상승억제효과가있음을확인할수있었다.
시판혈당강하제인 acarbose를 15 mg/kg의농도로경구 투여 5분후일반 rat(대조구)와 α-glucosidase 저해제의부 분정제물의경구투여 rat보다훨씬낮은 85±4.3 mg/dl, 30분 후엔 88±3.1 mg/dl의혈중포도당함량을보여혈당상승 억제효과가매우우수하였다. 이와같이비록 Pichia burotnii Y257-7이생성하는α-glucosidase 저해제의부분정제물이시 판혈당강하제인 acarbose보다는 SD-rat에서혈당상승억 Table 2. Effect of media on the α-glucosidase inhibitory activity
of cell-free extracts from Pichia burotnii Y257-7.
Media α-glucosidase inhibitory activity (%)b
MRSa 38.5
PDB 32.3
LB 90.9 (IC50 1.92 mg/ml)
TSB 49.2
YM 47.4
YPD 79.5 (IC50 3.9 mg/ml)
aMRS: De Man, Rogosa and Sharpe, PDB: potato dextrose broth, LB: Luria-bertani, TSB: trptic soy broth, YM: yeast extract-malt extract, YPD: yeast extract-peptone-dextrose.
bAfter cultured in various media at 28oC for 24 h prepared cell-free extract.
Fig. 2. Effects of the partial purified α-glucosidase inhibitor on blood glucose levels after 3 g/kg starch administration in nor- mal SD-rat. Different symbols on the bars indicate significant dif- ference (p < 0.05) by Duncan's multiple range test. ●-●: Starch + D.W, △-△: Starch + commercial anti-diabetic acarbose (15 mg/
kg), ○-○: Starch + partial purified α-glucosidase inhibitor (500 mg/
kg), ▼-▼: Starch + partial purified α-glucosidase inhibitor (1000 mg/kg).
제효과가낮았지만같은경향으로식후농도의존적으로혈 당상승을낮추는효과가있었다.
당뇨 유발 SD-rat에서의 혈당 상승 억제: 부분정제한 α-glucosidase 저해물질을이용하여 streptozotocin로당뇨
를유발시킨 SD-rat에서항당뇨효과를조사하였다. 당뇨가
유발된 SD-rat에서의대조구인멸균수를경구투여하였을
때혈중포도당함량은 5분후에 523±5 mg/dl를보였으나 시료인효모α-glucosidase 저해제의부분정제물을 500 mg/
kg, 1000 mg/kg의농도별로투여한실험군에선 5분후각각 490±5.2 mg/dl, 460±3.4 mg/dl의혈중포도당함량을보 여일반 rat의결과와같이각각 35 mg/dl, 65 mg/dl 혈당상 승억제효과를확인할수있었다(Fig. 3).
시판혈당강하제인 acarbose를당뇨유발쥐에 15 mg/kg 의농도로경구투여하였을때투여 5분후 410±5.3 mg/dl, 30분후 425±3.6 mg/dl의혈중포도당함량을보여혈당상 승억제효과가아주우수하였다. 위결과같이, 부분정제 한 Pichia burtonii Y257-7의α-glucosidase 저해물질의당
뇨유발 SD-rat에서의혈당상승억제효과는비록시판혈
당강하제인 acarbose보다낮았지만유사하게식후농도의 존적으로혈당을낮추는효과가있다는것을알수있었다. 따라서본실험의 α-glucosidase 저해물질을함유한효모추
출물은시판 acarbose와유사한항당뇨효능기작을갖고있
는것으로사료된다.
한편, 이결과들은검은콩씨껍질에함유되어있는안토 시아닌이본실험과같이 streptozotocin으로유도된당뇨쥐
에서 혈당과 triglyceride 함량을 급격히 감소시켰다는
Nizamutdinova 등[17]의보고와오디중의안토시아닌이당
뇨성고지혈쥐의혈당함량을농도의존적으로감소시켰다 는 Sarikaphuti 등[22]의보고와같은결과이었다.
요 약
본연구에서는우리나라전통발효식품에서분리한효모들
을이용하여새로운항당뇨성α-glucosidase 저해물질을개
발하기위하여, 먼저 48종의효모들의α-glucosidase 저해활 성을측정한결과, Pichia burtonii Y257-7의무세포추출물 이가장높은저해활성을보여시험균주로최종선발하였다. α-glucosidase 저해제최적생산조건을검토한결과, Pichia burtonii Y257-7를 28oC에서 24시간 LB 배지(pH 6.0)에배 양하여얻은무세포추출물에서가장높은α-glucosidase 저 해활성을보였다. 최적생산조건에서얻은α-glucosidase 저 해물질을 0.45μm와 0.2μm syringe filter unit로여과한후 Sephadex G-50 column chromatography와연속용매추출 을실시하여부분정제한후일반쥐와당뇨유발쥐를이용 하여항당뇨효과를조사하였다. 정상쥐와 streptozotocin으 로당뇨를유발시킨당뇨유발쥐에 Pichia burtonii Y257-7
이생산하는α-glucosidase 저해제의부분정제물을전분과
함께 500 mg/kg, 1000 mg/kg 농도로경구투여한결과, 시 판혈당강하제인 acarbose보다는효과가낮았지만농도의 존적으로정상쥐와당뇨유발쥐모두에서혈당상승억제 효과를확인할수있었다.
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