대변에서 Clostridium difficile 검출을 위한 C. DIFF QUIK CHEK와 VIDAS C. difficile Toxin A&B의 비교
조선영․유재권․김명희1․이희주
경희의료원 진단검사의학과, 동서신의학병원 진단검사의학과1
Comparison of Simultaneous Use of C. DIFF QUIK CHEK and VIDAS C. difficile Toxin A&B to detect C. difficile in Fecal Specimen
Sun Young Cho, Jae Kwon Rheu, Myung Hee Kim1, and He Joo Lee Department of Laboratory Medicine, KyungHee Medical Center, East-West Neo medical Center1, KyungHee University, Seoul, Korea
Background: Clostridium difficile is the most common pathogen of antibiotic-associated diarrhea. Toxigenic strains produce toxin A and toxin B. The pathogenicity of C. difficile is due to the production of these two exotoxins. This study aimed to evaluate diagnostic value of two enzyme immunoassay by comparison of concordance rate to diagnose C. difficile-associated infection.
Methods: C. DIFF QUIK CHEK (TECHLAB, USA) that detect glutamate dehydrogenase antigen and VIDAS C. difficile Toxin A&B (Bio Mérieux, France) that detect toxin A and toxin B were done in 122 fecal specimens to detect C. difficile.
Results: In the total 122 stool specimens, 17 cases showed positive results in both tests. One specimen showed discrepancy that positive result in VIDAS C. difficile Toxin A&B (relative fluorescence value, RFV=2.93) but negative result in C. DIFF QUIK CHEK. Therefore, the concordance rate between two tests was 95.1% (116/122). Both anaerobic culture and in-house PCR for toxin B were negative in the discrepant fecal specimen and there was no clinical evidence that support C. difficile-associated diarrhea, so we concluded result in VIDAS C. difficile Toxin A&B as false positive.
Conclusions: Although these two enzyme immunoassays targeted different antigen, they showed high concordance rate. The discrepant case was concluded to false positive in VIDAS C.
difficile Toxin A&B test because it showed negative results in culture and PCR for toxin B and there were no clinical evidences of C. difficile-associated infection. It could be needed for analysis about conditions that cause false positive result in enzyme immunoassays to detect C.
difficile toxin.
Key Words：Clostridium difficile, Glutamate dehydrogenase, Toxin A and toxin B, Enzyme- immunoassay
교신저자：이희주
우) 130-702 서울시 동대문구 회기동 경희대학교 의과대학 진단검사의학과 전화：02)958-8672, 팩스：02)958-8609 E-mail： [email protected]
서 론
Clostridium difficile은 항균제유발설사(antibiotic- associated diarrhea)의 15-25%의 원인이 되며 위막성 대장 염 원인의 95%이상을 차지한다[1,2]. 또한 입원환자에 있어 서 병원 감염으로 인한 설사(nosocomial diarrhea)의 주요 원인균이기도 하다[2-4]. 독소 생성 균주는 독소 A, B를 생
Table 1. Results in DIFF QUIK CHEK and VIDAS C. difficile Toxin A&B VIDAS C. difficile Toxin A&B*
Total
+ equivocal -
DIFF QUIK CHEK + 17 0 0 17
- 1 5 99 105
Total 18 5 99 122
relative fluorescence value (RFV) ≥ 0.37; 0.13≤RFV<0.37, equivocal; RFV<0.13, negative 산성하며 이 두 종류의 독소는 C. difficile의 주요한 병원성
인자이다. C. difficile 연관 설사의 진단에는 대변 검체에서 배양을 통해 직접 균을 확인하거나 균이 생성하는 독소를 검출하는 방법이 권장된다[5]. 현재 진단의 표준방법은 세포 독성검사법(cytotoxic assay)으로서 세포를 배양하여 독소 B 의 세포병변효과(cytopathic effect)를 확인하는 방법이다 [6,7]. 그러나 이 방법은 배양법처럼 시간이 오래 걸리고(적 어도 48시간 이상) 표준화하기 어려운 단점을 가져 최근 신 속한 진단을 위해 효소면역법이 많이 사용되고 있다. 효소 면역법의 주요 검출 대상은 독소 A 또는 독소 A와 B, 그리 고 독소 생성 균주나 비생성 균주가 모두 생성하는 글루탐 산탈수소효소(glutamate dehydrogenase, GDH) 등이다[8].
대변 검체에서 효소면역법을 통하여 독소 A를 검출한 국내 의 연구에 따르면 9.8-26.2%의 검출률을 보였으며 임상상 혹은 세균배양을 기준으로 할 때 80% 정도의 일치율을 나 타내었다[9,10]. 최근에는 독소 A를 생성하지 않는 변이주로 인한 감염의 보고가 증가하고 있어 독소 A만을 검출하는 검사법은 한계를 가진다[8]. 본 연구에서는 독소 A와 B를 검출 대상으로 하여 독소 생성 균주만을 대상으로 하는 방 법과 독소 생성 균주와 비생성 균주가 모두 생성하는 GDH 효소를 검출 대상으로 하는 두 가지 종류의 효소면역검사법 간 일치율 비교를 통해 두 검사법의 진단적 효용성을 알아 보고 병원 내 C. difficile의 독소 생성 균주와 비생성 균주 분포비를 추정해 보고자 하였다.
대상 및 방법
항균제 연관 설사증 및 기타 원인에 의한 설사를 주소로 하여 2008년 1월과 2월 사이에 C. difficile 검사가 의뢰 된 122례의 대변 검체에 대해 C. difficile이 생성하는 효 소인 GDH를 검출하는 C. DIFF QUIK CHEK (TECHLAB, Blacksburg, VA, USA) 검사와 독소 A와 B를 검출하는 VIDAS C. difficile Toxin A&B (Bio Mérieux, Marcy-I’Etoile, France) 검사를 동시에 시행 하였다. GDH의 검출은 rapid membrane immunoassay 원리 를 이용하여 검체내에 C. difficile의 존재를 확인하는 방법 으로 키트 내에 들어있는 희석제와 접합제의 혼합용액에 분 변 검체를 가하여 희석된 검체를 반응창(reaction window)
에 떨어뜨린 후 15분 후에 판독하였다. 독소 A와 B의 검출 은 enzyme linked fluorescent immunoassay (ELFA) 원리 를 이용하여 450 nm에서 형광강도를 측정하는 방법으로 제 품 설명서에 기술된 대로 relative fluorescence value (RFV) 가 0.37이상이면 양성, 0.13 이상-0.37 미만이면 equivocal, 0.13 미만이면 음성으로 판정하였다. 두 검사 사이에서 불일 치 결과를 보인 경우에 대해서는 항원 검사와 동일한 검체 로 C. difficile selective agar (CDSA)에서 48시간 동안 C.
difficile의 혐기성 배양을 시행하였고 또한 독소 B에 대한 자가제조 PCR을 시행하였다[11]. VIDAS에서 equivocal로 나타난 검체에 대해서는 배양이나 PCR 등의 추가검사를 시 행하지 못하였다.
평균값의 비교는 Medcalc 12.0 (Medcalc Software, Mariakerke, Belgium)에서 t-test를 통하여 확인하였고 P <
0.05일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
결 과
환자의 평균 연령은 62.6세 였으며 남녀 비는 1.2:1 이 었다. 총 환자 수는 87명이었고 122개의 검체 중 21개에 서는 1회 이상 검사가 의뢰되었다. 122개의 대변 검체 중 두 검사에서 모두 양성을 보인 경우는 17례로 전체의 13.9%였다. C. DIFF QUIK CHEK에서 음성을 보인 5 예에서 VIDAS C. difficile Toxin A & B에서는 equivocal한 결과를 나타내었다. 단 1례에서만 C. DIFF QUIK CHEK에서 음성, VIDAS C. difficile Toxin A&B 에서 양성(relative fluorescence value, RFV=2.93)으로 불일치 결과를 보여 두 검사 간 결과의 일치율은 95.1% (116/122)였다(Table 1). 검사가 가장 많이 의뢰된 과는 신경외과(23.0%), 내과(22.1%), 중환 자실(5.7%) 순이었으며 특히 신경외과에서 의뢰된 검체에 서는 39.3%(11/28)에서 두 검사가 모두 양성을 보였다.
기저질환별 분류에서는 뇌경색과 뇌출혈, 무산소성 뇌손상 (anoxic brain damage)등의 중추신경계 질환이 41.7%
를 차지하였고 악성 종양 환자가 13.9%로 두번째 높은 빈 도를 나타내었다. 두 검사에서 모두 양성을 보인 17명 중 8명에서 추적검사가 시행되었고 모두에서 음성으로 전환되 었다. 두 검사에서 모두 양성을 보인 군(17명)과 음성을 보
Fig. 1. Comparison of C-reactive protein results of both patient group in C. DIFF QUIK CHEK and VIDAS C. difficile Toxin A&B
인 군(99명) 사이에 C반응단백질(C-reactive protein, CRP) 평균값은 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Fig.
1).
불일치를 보인 대변 검체에 대해서는 CDSA에서 48시간 동안 혐기성 배양을 시행하였고 또한 독소 B에 대한 자가 제조 PCR를 시행하였으며 그 결과는 모두 음성으로 나타 났다. 불일치를 보였던 환자는 뇌수술을 받은 후 3차 세팔 로스포린, 반코마이신, 피페라실린-타조박탐 등의 항균제를 장기간 사용 중이었다. 발열이나 복통 등의 특이한 임상증 상은 없었으며 혈변이나 점액변이 아닌 무른 변을 보여 2008년 2월 C. difficile 검사가 의뢰되었다. 이후 환자는 대장염과 관련된 특별한 증상을 호소하지 않아 추가적인 치 료가 시행되지 않았으며 C. difficile 에 관련된 추가 검사 도 요청되지 않았다.
고 찰
C. difficile 는 항균제나 항암요법 등 장내 정상 균무리 에 변화를 줄 수 있는 치료를 받은 환자에게서 나타나는 병 원 획득성 대장염의 주요 원인균으로 인식되고 있다[12]. 환 자들은 단순히 유발약제를 끊는 것에 반응을 보이나 대부분 은 metronidazole이나 vancomycin으로 치료를 받아야 한다 [13]. 격리나 소독 등의 방법으로 균의 전파를 최소화하려는 노력이 있으나 포자의 경우 완전한 제거가 어렵기 때문에 집단발병이 수년간 지속되기도 한다[14]. 다행스럽게도 최근 이에 대한 인식의 증가와 접근성이 향상된 진단법의 등장으 로 인해 임상의들은 빠르고 정확한 진단과 이를 바탕으로 한 정확한 치료적 접근이 가능하게 되었다[15].
C. difficile에 대한 검사에는 혐기성 배양법, 세포독성법
그리고 일반적 항원이나 독소에 대한 항체를 이용한 검사 등이 있으며 결과는 모두 환자의 병력과 연관해서 해석해야 한다[8]. 배양법은 시간이 오래 걸리고 비용이 높다는 단점 을 가진다[16]. 또한 독소 생성 균주 인지를 확인해 줄 수 있는 추가적 검사가 요구된다.
독소 생성 균주 대 비생성 균주의 비는 잘 알려져 있지 않지만 Tracy와 David[8] 등은 환자에서 분리된 C.
difficile의 75%에서 80%가 독소를 생성하였다고 보고하 였다. 이에 따라 본 연구에서도 GDH를 검출 대상으로 하 는 검사에서 더 많은 양성이 나올 것으로 예상하였으나 Diff Quik에서 양성이 나온 17례 모두 독소 A와 B를 검출하는 VIDAS 검사에서 양성이 나와 모두 독소 생성 균주로 나타 났다. 불일치를 나타낸 경우는 1례 뿐이었고 VIDAS에서 equivocal을 보인 5례를 제외하여도 VIDAS 와 Diff Quik은 높은 일치율을 보여주었다. 이러한 결과의 원인은 다음과 같이 추정해 볼 수 있다. 첫째, 검체를 수집할 당시 원내에 독소 생산 C. difficile 균주의 outbreak가 있었을 가능성이다. 그러나 균주들을 대상으로 역학 조사가 이루어 지지 않았기 때문에 이러한 추론은 한계를 가진다. 둘째, Diff Quik에 위음성을 나타내는 검체들이 있었을 가능성이 다. 그러나 Diff Quik이 93.5%의 민감도를 나타냈다고 보고한 Reyes 등[4]의 연구를 볼 때 이러한 가능성에도 큰 비중을 두기는 어렵다. 셋째, C. difficile 검사가 의뢰된 대부분의 환자들이 항균제를 투여 받은 후 설사 증상을 보 이는 경우였으므로 독소 생산 균주에 감염된 환자들만 선택 되어 검사가 의뢰된 선택오차(selection bias)가 개입하였 을 가능성이다. 이렇게 두 검사의 높은 일치율에 대한 정확 한 해석을 위해서는 긴 기간 동안 좀 더 다양하고 많은 검 체를 통해 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
Hardt 등[17]은 진단 시의 혈청 CRP 농도는 심한 C.
difficile 연관 설사의 독립적인 예측인자라고 보고하였다.
본 연구에서 두 검사에서 모두 양성을 보인 군과 음성을 보 인 군 사이에 CRP 평균값은 통계적으로 유의한 차이가 없 었다. 또한 신경외과에서 의뢰된 검체에서 특히 높은 양성 률을 보인 것은 신경외과의 높은 항균제 사용량 그리고 장 기입원 환자가 많은 특징과 관련 있을 수 있다고 생각된다.
불일치를 보인 한 예는 CDSA 배지에서 시행한 C. difficile 의 혐기성 배양과 독소 B에 대한 자가제조 PCR 검사에서 모두 음성을 보여 C. DIFF QUIK CHEK에서 나타난 결과 와 일치하였으므로 검사적으로는 VIDAS C. difficile Toxin A&B의 위양성일 가능성이 높아 보이나 임상적으로는 항생 제를 장기간 사용 중인 설사 환자였고 또한 환자에게 사용 된 세팔로스포린은 C. difficile 연관 설사를 잘 유발하는 항 균제 중 하나로 보고된 바 있으므로[13,18] C. difficile 연관 설사를 완전히 배제 할 수는 없다. 향후 C. difficile 독소를 검출하는 효소면역검사의 위양성 유발 조건에 대한 분석이 필요할 것으로 사료되었다. 또한 C. DIFF QUIK CHEK에서
음성을 보이고 VIDAS C. difficile Toxin A&B에서는 equivocal한 결과를 나타낸 5례에 대해서는 두 검사의 민감 도의 차이에서 기인한 결과로 해석할 수도 있겠으나 재검을 하거나 배양, PCR 등의 추가적 검사로 확진하는 과정이 진 행되지 않아 이후 연구에서는 이점에 대한 보완이 필요할 것으로 사료된다.
요 약
배경: Clostridium difficile는 항균제 유발 설사의 가 장 흔한 원인균이다. 독소 생성 균주는 독소 A, B를 생성 하며 이 두 종류의 독소는 C. difficile 의 주요한 독성인자 이다. 본 연구에서는 C. difficile 감염증의 진단을 위한 두 종류의 효소면역법 결과의 일치율 비교를 통해 두 검사법의 진단적 의의를 평가하고자 하였다.
방법: C. difficile 검사가 의뢰된 122개의 대변 검체에 대해 glutamate dehydrogenase를 검출하는 C. DIFF QUIK CHEK (TECHLAB, USA) 검사와 독소 A, B를 검출하는 VIDAS C. difficile Toxin A&B (BioMer- ieux, France) 검사를 시행하였다.
결과: 122개의 대변 검체 중 두 검사에서 모두 양성을 보인 경우는 17례로 전체의 13.9%였다. 단 1례에서만 C.
DIFF QUIK CHEK에서 음성, VIDAS C. difficile Toxin A&B 에서 양성(relative fluorescence value, RFV=2.93)으로 불일치 결과를 보였으며, 두 검사간의 결 과 일치율은 95.1% (116/122). 불일치를 보인 대변 검체 에 대해서는 C. difficile selective agar에서 48시간 동안 혐기성 배양을 시행하였고 또한 독소 B 유전자에 대한 자 가제조 PCR를 시행하였으며 그 결과는 모두 음성으로 나 타났다.
결론: C. DIFF QUIK CHEK과 VIDAS C. difficile Toxin A&B의 두 효소면역검사는 표적이 되는 항원의 종 류가 다르지만 검사 결과에서 높은 일치율을 보여주었다.
두 검사에서 불일치를 보인 검체는 배양검사와 독소 B 유 전자에 대한 PCR 검사에서 음성을 보였으며 또한 임상적 으로 C. difficile 감염증을 의심할 만한 증거가 없어, VIDAS C. difficile Toxin A&B 검사의 위양성으로 생각 되었다. 향후 C. difficile 독소를 검출하는 효소면역검사의 위양성 유발 조건에 대한 분석이 필요할 것으로 사료된다.
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