조직배양 기술을 이용한 괄루근(栝樓根, Trichosnathis Radix) 기원식물 하늘타리 부정근 배양에 대한 소고(小考)

Abstract

The genus Trichosanthes (Cucurbitaceae) is a perennial vine plant native to China, Japan, Mongolia and Taiwan. However, the species T. kirilowii Maxim. and T. kirilowii var. japonica Kitam. are native plants mostly in Korea and Japan. T. kirilowii, is used as a Korean and Chinese medicinal herb. However, the roots which are used in traditional medicine take several years to mature when cultivated in a traditional way. Fortunately, through tissue culture techniques, the roots can be produced in a shorter period of time. This in vitro study therefore was conducted to identify and establish the optimal medium and plant growth regulator type and concentrations suitable for adventitious root formation and biomass enhancement of T. kirilowii roots. The wild roots were collected, disinfected and cultured in MS and DJ solid and liquid agitator culture basal media supplemented with auxin-based hormone IBA to induce adventitious roots and increase the biomass within a minimal time frame.

We expect to establish a system of root cultivation of T. kirilowii for the stable supply of substantial mass production in the future by providing a standard in vitro propagation protocol for the root cultivation.

조직배양 기술을 이용한 괄루근(栝樓根, Trichosnathis Radix) 기원식물 하늘타리 부정근 배양에 대한 소고(小考)

주수지 인턴연구원 김용구 박사후과정 강영민 교수 책임연구원, , · ^* 한국한의학연구원 한약연구부

A study on propagation of the Trichosnathis Radix ( Trichosanthes kirilowii Maxim. Root) using tissue culture techniques

Joo Suji, Kim Yong-goo, Kang Youngmin^*

Herbal Medicine Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Republic of Korea

Keywords: Trichosanthes kirilowii Maxim., Trichosanthes kirilowii var. japonica Kitam., adventitious root, plant growth regulators, tissue culture, in vitro propagation protocol

서론

하늘타리(Trichosanthes kirilowii Maxim.)와 노랑하늘타리(Trichosanthes kirilowii var. japonica

는 박과 하늘타리속

Kitam.) (Cucurbitaceae) (Trichosanthes)에 속하는 다년생 덩굴식물이며 우리나라 중부 이남에 분포한다^1-3). 이 중 한약재로 사용되는 괄루근(栝樓根, 생약명 Trichosanthis Radix)은 하늘타리 또는 쌍변괄루(雙邊栝樓, Trichosanthes rosthornii Harms.)의 뿌리의 표피를 제거한 것으 로 규정되어 있다³⁾. 하늘타리는 한국 일본 몽골 대만 등에서 자생하는 박과의 다년생 덩굴성 초본으, , , 로 잎은 호생이고 둥근모양이며 단풍잎처럼 , 5~7갈래로 갈라지며 각 열편에 톱니가 있고 아랫부분은 , 심장형이며 잎 표면에 짧은 털이 있다 덩굴손은 잎과 대생. (對生)이며 다른 물체에 , 5m 정도까지 감겨 올라간다. 7~9월에 백색꽃이 피고 열매는 구형으로 10월에 성숙되며 많은 종자가 들어있고 주황색으 로 익는다^4-7).

하늘타리 뿌리는 녹말을 내어 식용하였으며 열매 씨앗 및 뿌리를 약용으로 사용해왔다, , ⁸⁾. 한방에서 는 열매(瓜蔞)와 뿌리(栝樓根)를 해열 해수 이뇨 변비 어혈 황달 피부병 결핵 유방암 적백리, , , , , , , , , , 당뇨병 등의 치료에 사용한다²⁾. 또한 trichosanthin (TCN), TAP-29, trichokirin, -kirilowin, α β

과 같은 다양한 들이 하늘타리의 종자와

-kirilowin, karasurin ribosomal inactivating protein (RIP)

근경에서 생합성되는 것으로 알려져 있다^9-12). 이 중 trichosanthin은 항진균성 물질로 항암작용은 물론 HIV (human immunodeficiency virus)의 복제를 억제하는 것으로도 알려지고 있다¹³⁾.

약용식물은 기원이 확실하고 외관이 균일하고 양호하며 약효성분의 함량이 기준치 이상이고 안전성 이 확보된 것이라고 할 수 있다³⁾. 하지만 한약재의 수요증가로 인한 수입과 시장의 유통물량은 증가하, 고 있으나 약재의 기원이나 품질기준이 명확하지 않은 상황이다 또한 한약재는 생육지 재배관리, . , , 채집시기 등에 따라 외관 색상 등이 다를 수 있고 성분 함량에 차이가 있을 수 있다, , ^14-15).

하늘타리는 국내에서 재배가 거의 이뤄지지 않아 야생 하늘타리를 그대로 채취해서 식 약용 목적으· 로 사용하고 있으나 수요 대비 공급 양이 부족하기 때문 대부분 중국에서 수입하고 있다¹⁶⁾. 뿌리를 약용으로 이용하고 재배기간이 수년간이 소요되는 경우는 조직배양을 통해 식물체의 개체형성능을 이용하여 세포나 조직이 세포전체의 형태를 형성하거나 식물체를 재생하게 하여 단기간에 대량으로 뿌리를 생산할 수 있는 효과적인 방법으로 활용될 수 있다^17-18). 일례로 재배기간이 긴 인삼은 산업적, 으로 응용하기에 어려운 점이 있다 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 조직배양에 의해 생산된 인삼 . 캘러스나 부정근을 사용하기 위한 연구가 지속적으로 진행되고 있으며¹⁹⁾, 또한 부정근을 이용한 기내 배양 연구방법은 부정근 증식기간의 단축과 이차대사물질의 생산 비율이 높아 천연물을 연구하는 데 적합하다고 보고되어 있다²⁰⁾. 본 논문에서는 한약재 기원식물 하늘타리에서 부정근을 유도하기 위한 기내증식법을 소개함으로써 관련 연구자들에게 미래연구의 방향과 방법에 대한 정보를 제공하고자 한다.

본론

하늘타리의 기원 및 각국 약전비교 1.

하늘타리의 기원 정보는 각국 공정서 및 이를 정보화한 한약기원사전에 수록 되어있다^2,21-24). 각 나라의 공정서를 비교함으로써 한약의 기원식물을 정리하여 그 차이를 비교할 필요가 있다 이를 통해 , . 정확한 기원에 대한 정보를 연구자에게 제공할 수 있기 때문이며 본 논문에서는 이를 바탕으로 하늘타, 리의 기원 및 세부 내용을 비교 분석하였다 하늘타리의 기원 및 자세한 내용은 표 에 정리하였다. 1 .

Table1. The authentic herbal medicines originated from Trichosanthes species in national pharmacopoeia.

Country Pharmacopeia information Origin

한국³⁾

- 출전 대한민국약전 제 : 11개정(KP 11)

- 약명 : 괄루근(栝樓根) - 생약명 : Trichosanthis Radix - 영문약명 : Trichosanthes Root

하늘타리(Trichosanthes kirilowii Maximowicz)또는 쌍변괄루(雙邊栝樓. Trichosanthes rosthornii Harms) (박과 Cucurbitaceae)의 뿌리로 피부를 제거한 것

- 약명 : 괄루인(栝樓仁)

- 생약명 : Trichosanthis Semen - 영문약명 : Trichosanthes Seed

하늘타리 또는 쌍변괄루의 잘 익은 씨

중국²¹⁾

- 출전 중화인민공화국약전 : 2015년 판(ChP 2015)

- 약명 : 천화분(天花粉) - 생약명 : Trichosanthis Radix

박과 호로과( 葫蘆科) 식물 하늘타리 괄루( 栝樓. Trichosanthes kirilowii 또는 쌍변괄루

Maxim.) (雙邊栝樓. Trichosanthes rosthornii Harms)의 뿌리 를 말린 것 가을철과 겨울철에 채취하여 씻어서 겉껍질을 제거하고 길게 . , 자르거나 세로로 쪼개어 말림

- 약명 : 과루자(瓜樓子)

- 생약명 : Trichosanthis Semen

박과 식물 하늘타리 또는 쌍변괄루의 잘 익은 씨를 말린 것 가을철에 잘 . 익은 열매를 채취하여 쪼개어 씨를 꺼내고 씻어서 햇볕에 말린다.

- 약명 : 초과루자(炒瓜蒌子) - 생약명 : Trichosanthis Semen

Tostum

과루자 를 포제가공한 것

‘ (瓜樓子)’ .

과루자를 가지고 초법(炒法)에 따라 약한불로 살짝 부풀어 오를 때까지 볶은 다음 꺼내어 식힌다.

- 약명 : 과루(瓜蔞)

- 생약명 : Trichosanthis Fructus

박과 식물 하늘타리 또는 쌍변괄루의 잘 익은 열매를 말린 것 가을철에 열매가 . 잘 익었을 때 열매꼭지째로 잘라서 통풍이 잘 되는 그늘에서 말린다.

- 약명 : 과루피(瓜蔞皮)

- 생약명 : Trichosanthis Pericarpium

박과 식물 하늘타리 또는 쌍변괄루의 잘 익은 열매의 껍질을 말린 것 가을철에 . 잘 익은 열매를 채취하여 쪼개어 열매속 및 씨를 제거하고 그늘에서 말린다, .

일본²²⁾

- 출전 일본약국방 제: 17개정(JP 17) - 약명 : 괄루근(栝楼根)

- 생약명 : Trichosanthis Radix - 영문약명 : Trichosanthes Root

하늘타리 Trichosanthes kirilowii Maximowicz,

노랑하늘타리 키카라스우리( キカラスウリ) Trichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura 또는 오오카라스우리(オオカラスウリ) Trichosanthes bracteata Voigt (박과 Cucurbitaceae)의 피층(皮層)을 제거한 뿌리

- 약명 : 괄루인(栝楼仁)

하늘타리 기내배양방법의 종류 2.

기내에서 기본적으로 무균 식물체 및 조직이 만들어지고 나서 번식을 하는 방법은 여러 가지가 있을 수 있지만 약용부위가 덩이뿌리인 하늘타리의 경우는 차적으로 고체배지 및 액체배지를 이용한 번, 1 식이 가능하다 한천. (寒天, agar)을 넣어 일정온도 이상으로 열을 가하여 만들어지는 고체배지는 배양 용기에서 식물체를 지지하는 역할을 하기 때문에 정지된 상태에서 식물체를 배양할 때 사용한다 반면. 에 액체배지는 한천을 넣지 않고 액체 상태에서 100 rpm 전후의 교반(shaking) 혹은 현탁

을 통해 식물을 회전 배양할 때 사용된다

(suspension) .

하늘타리 기내배양 장단점 3.

가 배양 상태 및 배양조건에 따른 장점.

고체배양은 배양용기에서 식물체를 지지하는 역할을 하며 정지된 상태에서 식물체를 배양할 수 있다.

초기 생장 촉진을 위한 호르몬 테스트를 통해 부정근을 유도하기 쉽다 액체배양은 현탁배양을 하기 . 때문에 차원적으로 모든 조직이 영향을 받고3 , suspension되는 동안 biomass의 증대가 고체배양보 다 높다 또한 부정근을 대량으로 배양이 가능하고 계대배양이 쉽다 간단한 배지 테스트 및 호르몬 . . 테스트를 위해서는 고체배양이 용이하며 특정부위의 재분화와 , biomass 증진을 유도하기 위해서는 액체배양이 더 편리하다³⁰⁾. 하늘타리의 부정근을 유도할 경우 식물생장조절제의 영향 즉 종류별 농도, , 별 시기별 등을 고려해서 최적생산배지의 조건을 확립하는 것이 중요하며 고체배지와 액체배지의 , 상태를 고려하여 최적시기 및 조건(cf. 4주 전후 에 계대배양) (繼代培養, subculture)을 하는 것이 중 요하다.

나 배양 상태 및 배양조건에 따른 단점.

고체 배양은 계대가 불편하며 소규모 대량 번식의 한계 점이 있다 액체배지는 장기간 동안 액체배양. 을 할 경우 식물생장조절제(cf. auxin)에 악영향을 미쳐서 다시 고체 배지로 치상했을 경우 재분화

혹은 전형성능 이 상실될 수 있다

(regeneration) (全形成能, totipotency) . - 생약명 : Trichosanthis Semen

- 영문약명 : Trichosanthes Seed

북한²⁴⁾

- 출전 : 조선인민민주주의공화국약 전 제 판7 (DP VII)

- 약명 : 하늘타리뿌리

- 생약명 : Radix Trichosanthis

박과(Cucurbitaceae) 하늘타리(Trichosanthes kirilowii Maxim.)의 뿌리. 가을에 뿌리를 캐여 물에 씻고 겉껍질을 벗긴 다음 썰거나 쪼개서 햇볕에 말림

- 약명 : 하늘타리씨

- 생약명 : Semen Trichosanthis

박과 하늘타리의 여문 씨.

익은 열매를 따서 씨를 모아 햇볓에 말린다.

기타

하늘타리 가공 및 법제

[ ]

- 천화분(天花粉) - 하늘타리뿌리

주의 사항

[ ]

천오(川烏)·제천오(制川烏)·초오(草烏)·제초오(制草烏)·부자(附子)와 함께 사용하면 안 된다.

하늘타리 한약자원식물의 기내배양 4.

가 하늘타리의 무균 기내식물체 생산.

국내 주요 산지 제주도 및 중부 이남 에서 자생하는 하늘타리 종자나 식물체는 수집하여 증식에 이용( ) 할 경우에는 형태학적 분류 및 유전적 검증을 통해 그 기원을 확인 한 후 기내배양의 재료로 사용하는 것이 바람직하다^25-26). 뿌리를 차 증류수와 1 100% ethanol로 표면 소독 후, 70% (v/v) ethanol에

초간 침지한 뒤 멸균수로 세척하였다 용액에 총 분간

30 . 3% (v/v) NaOCl (sodium hypochlorite) 10

표면살균 후 세척된 시료를 MS (Murashige & Skoog, 1962)와 DJ (De Greef & Jacobs, 1979) 배지를 기본 배지로 실험에 이용하였다.

나 하늘타리 기내 식물을 이용한 부정근 유도.

하늘타리의 뿌리 조직을 선발하여 DJ 기본 배지와 MS 기본 배지에 식물생장조절제(plant growth

중 계 를 를 각 각 첨가한 배지에

regulator) auxin IBA (3-indole butyric acid) 1.0 mg/L, 5.0 mg/L

치상하여 주간 식물체의 부정근4 (adventitious root)을 유도 하였다 식물생장조절제인 . IBA는 뿌리와 캘러스를 형성하는 데 사용되며 다른 옥신과 비교하였을 때 더 많은 양의 뿌리를 생산하는 것으로 , 알려져 있다²⁹⁾.

다 생물반응기를 이용한 액체 교반기 배양 부정근 배양. ( )

하늘타리의 뿌리는 약용으로써 활용도가 높아서 뿌리비대 방법과 표준육묘생산 체계 구축은 미래 한약자원을 확보하고 효율적인 재배기술을 선점하는 데 필요한 체계적인 생산기술개발의 일환으로 큰 의의가 있다³⁰⁾. 기내 식물체를 바탕으로 부정근 증식에 효과적인 배지 조성 확립을 위해 배양을 실시하였다 그리고 최소한의 시간으로 뿌리가 최대로 비대 되거나 . biomass를 증대시키기 위해 옥신 계 호르몬인 IBA를 추가적으로 첨가할 수 있다. MS와 DJ를 기본 고체 배지로 사용하였고 IBA 1.0

와 를 각각 첨가하였다 하늘타리 뿌리는 주간 와 가 각각

mg/L 5.0 mg/L . 4 IBA 1.0 mg/L 5.0 mg/L

첨가된 MS와 DJ 기본 고체 배지에서 부정근 배양을 하였다(Fig. 2, 3). 기본 MS 배지와 DJ 배지에서 가늘고 긴 부정근이 유도되는 것이 확인되었다(Fig. 2-d, Fig. 3-d). IBA 1.0 mg/L가 첨가된 MS 배지에서는 작은 돌기를 형성하는 형태의 부정근이 유도되는 것을 확인하였다(Fig. 2-e). DJ 배지에서 유도된 부정근은 전체적으로 형태와 근정단 부분이 정상적이며 측근 형성이 양호함을 보였다, (Fig.

가 첨가된 배지에서 유도된 부정근은 전체적으로 시간이 지날수록 비대되는 3-e). IBA 5.0 mg/L MS

것을 확인하였다(Fig. 2-f). DJ 배지에서 유도된 부정근은 전체적으로 짧고 뿌리 끝이 무딘 형태가 관찰되었다(Fig. 3-f, Table 2). 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 대량증식방법이 약용식물의 bio-

생산에 많이 이용되고 있다 고체배지를 통해 부정근의 증식에 효과적인 배지 조성을 확립한

mass .

후 액체배지를 통한 부정근 증식에 효과적인 배지 조성을 확립을 위해 액체 교반기 배양을 실시하였다 (Fig. 4).

Figure 1. Establishment for in vitro propagation of Trichosanthes kirilowii.

Figure 2. Induction of adventitious root from root on MS medium with various concentrations of IBA after 4 weeks of culture. (a·d: MS, b·e: MS + IBA 1.0 mg/L, c·f: MS + IBA 5.0 mg/L) (Bar = 1 cm)　 　

Figure 3. Induction of adventitious root from root on DJ medium with various concentrations of IBA after 4 weeks of culture. (a·d: DJ, b·e: DJ + IBA 1.0 mg/L, c·f: DJ + IBA 5.0 mg/L) (Bar = 1 cm)　 　

Table 2. Effect of medium on the adventitious root.

결론

본 논문은 국내 한약재 중 하나인 하늘타리의 뿌리 배양법에 대한 정보를 제공함으로써 각국 공정서, 의 기원내용 기원식물의 범위 뿌리 배양방법 기내 배양 시 요구되는 유의사항 등 다양한 사례를 , , , 소개하였다 이를 통해 국내 한약재 기원식물의 중요성을 강조하고 효과적인 생산 사례를 소개함으로. 써 추후에 실질적인 대량 생산의 안정적인 공급을 위한 하늘타리 뿌리 배양의 체계가 확립되길 기대해 본다.

감사의 글

한국한의학연구원 주요사업 안정적 한약자원 확보 기술 개발 총괄 ‘ ( K18400, 세부 K18405: 한약자원 국내생산 기반기술 개발 의 지원으로 수행하였고 시료 수집과 시료 보존에 도움을 주신 한약연구부 )’ , 연구자들에게 감사를 표합니다.

참고문헌

1. Lee, Y. N. New Korean illustrated plant book I. Seoul:Kyohaksa. 2000:639,774.

2. Zhu, Y. P. Chinease Material Medica. Harwood Academic Publishers. 1998:489-90.

3. 대한민국 식품의약품안전처 한약재 안전 및 품질관리 규정 식품의약품안전처고시 제. . 2017-21호. 4. Kim, T. J. Korea's Resources Plants (IV). Seoul National University Pub. 1996.

5. Jung B. S., Shin M. K. Encyclopedia of Traditional Drug (2nd ed). Younglim Pub. 1998:960-3.

6. Huang, Y., He, P., Bader, K. P., Radunz, A., & Schmid, G. H. Seeds of Trichosanthes kirilowii, an energy-rich diet. Zeitschrift für Naturforschung C. 2000;55(3-4):189-94.

7. Hoe, J. Dong-Eui-Bo-Gam. (1st ed.). Bub-In Pub. 1999:682,1238,1932.

8. LEE, Y. N. A New Korean Illustrated Plant Book. Gyo Hak Sa.[in Korean]. 2006.

9. Lee-Huang, S., Huang, P. L., Kung, H. F., Li, B. Q., Huang, P., Huang, H. I., & Chen, H. C.

TAP 29: an anti-human immunodeficiency virus protein from Trichosanthes kirilowii that is nontoxic to intact cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1991:88(15);657 0-4.

10. Toyokawa S., Takeda T., Ogihara Y. Isolation and characterization of Trichosanthes kirilowii

Media IBA concentration (mg/L) Adventitious root

MS

0 ++

1.0 +

5.0 ++++

DJ

0 ++

1.0 ++++

5.0 +++

Max. var. japonicum Kitam, Chem. Pharm. Bull. Tokyo. 1991;39:716-9.

11. Casellas P., Dussossoy D., Falasca A. L., Barbieri L., Gullemot J. C., Ferrara P., Bolognese A., Cenini P., Stripe F. Trichokirin, a rigosome-inactivating protein from seeds of Trichosant hes kirilowii Max. Purification, partial characterization and use for preparation of immunotox ins. Eur. J. Biochem. 1988;176:581-8.

12. Dong T. X., Nag T. B., Yeung H. W., Wong R. N. Isolation and characterization of a novel ribosome-inactivating protein, beta-kirillowin, from the seeds of Trichosanthes kirilowii Ma x. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994;199:387-93.

13. Byers, V. S., A. S. Levin, L. A. Waites, B. A. Starrett, R. A. Mayer, J. a., M. R. Price, R. A.

Robins, M. Delaney, and R. W. Baldwin. A phase Ⅰ Ⅱ / study of tichosantin treatment of HIV disease. AIDS 4. 1990;1189-96.

14. 이진만 이상한 김환묵 약용식품으로 한약재의 이용 식품산업과 영양, , . . . 2000;5(1):50-6.

15. 김관수 류수노 약용식물의 품질평가 현황과 전망 한국작물학회지, . . . 2002;47:186-99.

16. Jo, D. H., Jeong, B. J., & Kim, M. S. Cultivation research of Trichosanthes kirilowii. Naju, Korea:Jeollanamdo Agricultural Research and Extension Services. 2007;64-9.

17. Yu K. W., Hahn E. J., Paek K. Y. Production of adventitious ginseng roots using bioreactor.

Kor J Plant Tiss Cult. 2000;27:309-15.

18. Samuelsson, G. Plant Tissue Culture. In drugs of Natural Origin. Swedish Phamaceutical Pres s. 1992:27-35.

19. Lee, H. O. E. C. S. Optimization of submerged ginseng root culture conditions for the product ion of saponin. Journal of Ginseng Research, 2000;24:118-22.

20. Sivakumar G., Yu K. W. and Paek K. Y. Production and biomass and ginsenosides from adven titious roots of Panax ginseng in bioreactor cultures. Engineering in Life Sciences. 2005;5:33 3-42.

21. Phamrmacopoeia of the People’s Republic of China 2015. (China) 22. The Japanese Pharmacopoeia 17th deition, 2016. (Japan)

23. Taiwan Herbal Phamacopeia 2nd edition, 2013. (Taiwan)

24. The Pharmacopoeia of Democratic People’s Republic of Korea 7th edition, 2011. (Korea, Dem ocratic People’s Republic of)

25. Moon, B. C., W. J. Kim, Y. Ji, Y. M. Lee, Y. M. Kang, and G. Choi. Molecular identification of the traditional herbal medicines, Arisaematis Rhizoma and Pinelliae Tuber, and common adulterants via universal DNA barcode sequences. Genetics and Molecular Research. 2016;15 (1):gmr.15017064.

26. Zhang, J. Y., Q. S. Guo, and D. S. Zheng. Genetic diversity analysis of Pinellia ternata based

cuttings of Camellia sinensis (L.) Kuntze and associated biochemical changes. Plant growth regulation, 2006;48.2:111-7.

30. 강영민 최지은 이가연 문병철 윤아라 한약재 반하, , , , . (半夏)의 기내대량번식법에 관한 소고(小考).

한약정보연구회지. 2016;4(2):43-52.

The Author(s) 2018, khmi.or.kr

ⓒ