100
1)
서 론
장기이식에 대한 수요는 폭발적으로 증가되고 있지만 공 여장기 부족 이외에도 거부반응을 극복하기 위해 평생 면 역억제제를 복용해야 하는 등 해결해야 할 많은 문제를 안
본 논문은 2002년도 가톨릭대학교 의과대학 성빈센트병원 임상 연구비의 일부지원으로 이루어진 것임.
접수 : 2002년 12월 6일, 수정 : 2003년 3월 21일 승인 : 2003년 3월 21일
교신저자 : 김정아, 가톨릭대학교 의과대학 내과학교실 Tel : 031)249-8456, Fax : 031)252-8456 E-mail : [email protected]
고 있다. 특히 면역억제제 장기 복용에 따른 여러 가지 문 제를 해결하기 위하여 이식 항원에 대해 특이적으로 관용 효과를 유도할 수 있는 방법을 개발하기 위한 연구들이 진 행되고 있다. 면역억제제를 사용하지 않고서도 이식된 장 기가 생착되기 위해서는 동종 항원에 반응하는 T 림프구가 체내에서 선택적으로 제거되어야 하는데, 조혈모세포 이식 후 같은 개체로부터 장기를 적출하여 이식하면 골수의 chimerism 상태가 유도되면서 동종항원에 반응하는 T 림프 구가 제거되어 이식된 장기가 거부 반응 없이 생착된다. 하 지만 이 방법은 동종 골수 세포 생착을 위하여 장기 기능이
저용량의 GM-CSF를 이용하여 배양된 미성숙 수상세포의 면역학적 관용효과
가톨릭대학교 의과대학 내과학교실1, 조혈모세포연구실2, 성형외과3
김정아1, 2․홍성열2․최윤석3․김춘추1
Immune Tolerance Effect of Immature Dendritic Cells Cultured Using Low-dose GM-CSF
Jeong-A Kim, M.D.1, 2, Sungyoul Hong2, Yun Seok Choi, M.D.3 and Chun Choo Kim, M.D.1
Department of Internal Medicine1, Hematopoietic Stem Cell Transplantation Laboratory2, and Plastic Surgery3, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea
Background : Dendritic cells induce tolerance in the immature state besides the function of antigen presenting cells in the mature state. Using this effect, it will be overcome the rejection in organ transplantation. In this research we are to confirm the tolerance effect and induction mechanism in immature dendritic cell cultured with low-dose GM-CSF.
Methods : Dendritic cells were cultured from BALB/c (H-2d) bone marrow cells in the low concentration of GM-CSF (5U/mL, GMloDC) for 10 days. The phenotype and functional pro- perties of these GMloDC were compared to those of standard BM-DC cultures generated in the high concentrations of GM-CSF (200U/mL) with lipopolysaccharide (GMhiDC).
Results : Compare to mature DC, GMloDC expressed the low level of CD80 and CD86 and these cells were weak stimulators of allogeneic T cell responses by mixed lymphocyte reac- tion. The administration of GMloDC prolonged allogeneic skin graft survival (median survival time 11.3±1.2 days, compared with 6.6±0.8 days in nontreated controls). The effects of these cells were donor specific but couldn‘t be sustained for a long period.
Conclusions : GMloDC were phenotypically immature and they didn‘t induce allogeneic T cell responses compared with GMhiDC in vitro. It is suggested that the less expression of costi- mulatory molecule in GMloDC induce the tolerance effect. (Korean J Hematol 2003;38:100∼107) Key Words : Immature dendritic cells, Low dose GM-CSF, Immune tolerance
저하된 환자들에게 강력한 전처치를 시행하기 어렵다는 문 제점이 있다.
연구자들은 수년간의 동물 실험으로 간장 이식의 경우는 이식 후 면역억제제를 투여하지 않아도 다른 장기 이식 때 와는 달리 주조직적합항원이 일치하지 않는 개체간에 이식 된 장기가 거부 반응 없이 생착되는 것을 관찰하였으며, 이 는 반드시 골수 chimerism을 유도하지 않아도 공여 장기에 포함되어 있던 다수의 면역세포가 수혜쥐의 체내로 이동하 면서 microchimerism을 형성하여 이식편에 반응하는 세포 를 제거하기 때문으로 설명하였다.1,2) 특히 이러한 면역세 포 중 수상세포(dendritic cell)는 체내의 여러 조직에 다양 한 형태로 존재하면서 동종 혹은 자가 항원에 대한 면역 반 응을 조절한다.3∼5) 강력한 항원제시세포(antigen pre- senting cell)로 알려진 수상세포는 대부분 림프조직의 변 연부(marginal area)에 분포하며, 세포 표면에 다량의 MHC class II 항원과 CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) 등의 costimulatory molecule을 제시하여 면역 반응을 유도한 다. 반면에 림프조직의 T 세포구역에 존재하는 일부 수상 세포는 세포 표면에 MHC class II 항원 뿐만 아니라 costimulatory molecule이 적게 발현되어 T 림프구의 면역 반응을 유도할 수 없을 뿐만 아니라 오히려 T 림프구에 대 한 anergy 상태를 유도하여 면역학적으로 관용효과가 나타 난다.3,6) 마우스의 체내에서 관용효과를 유도할 수 있는 수 상세포는 림프구계 수상세포(lymphoid dendritic cell)와 미성숙 단계의 골수계 수상세포(immature myeloid den- dritic cell)로 알려져 있으며, 특히 미성숙 단계의 수상세 포는 저용량의 GM-CSF와 함께 배양하거나7,8) 간 내의 단 핵구를 IL-3, anti-CD40L와 함께 배양6)하여 얻을 수 있 다. 본 연구에서는 저용량의 GM-CSF를 이용하여 수상세 포를 배양하고, 배양된 세포의 형태와 표면 항원을 고용량 의 GM-CSF와 lipopolysaccharide (LPS)를 사용하여 배양 한 성숙 단계의 수상세포와 비교 분석하여 미성숙 단계의 세포임을 증명하고자 하였다. 또한 배양된 세포의 면역학 적 관용효과를 확인하기 위하여 동종림프구에 대한 mixed lymphocyte reaction (MLR)을 시행하였으며, 배양된 세 포를 동종 피부이식 전에 주사하여 피부 이식편의 생착에 미치는 영향을 관찰하였다.
대상 및 방법 1. 실험동물
생후 7∼8주 된 C57BL/6 (H-2b; 샘타코, 오산)를 수혜 쥐로 BALB/c (H-2d; 샘타코)를 수상세포와 피부조직을
공여하는 공여쥐로 사용하였으며, specific pathogen free (SPF) 상태에서 사육하였다.
2. 골수 및 비장 세포 분리
BALB/c의 대퇴골, 경골, 상완골을 박리하여 분리한 후, 박리한 뼈에서 23guage 주사바늘을 이용하여 골수를 채집하였다. 원심분리하여 혈장성분을 제거한 뒤 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 가하여 2mL의 세포 부유액을 만들고 작은 골 파편들을 제거하기 위하여 nylon mesh를 통과시켰다. BALB/c의 비장을 분리 한 뒤, stainless mesh를 이용하여 조직을 분쇄하여 단일 세포부유액을 만들고 적혈구를 용혈시킨 다음 인산완충용 액으로 3번 세척하였다.
3. 수상세포 배양
수상세포 배양은 Lutz 등7)의 방법을 이용하였다.
GMloDC는 생후 8주된 BALB/c 골수에서 채취한 유핵세포 (2×105/mL)를 100mm의 세균배양용 petri dish (BD Falcon, No. 1029, Franklin Lakes, NJ, USA)에 10mL 의 RPMI 1640 배지(100U/mL penicillin, 100µg/mL streptomycin, 2mM glutamin, 50µM 2-mercaptoetha- nol, 10% FBS)와 5U/mL 농도의 GM-CSF (R&D Sys- tems, Minneapolis, MN, USA)를 혼합하여 37℃, 5%
CO2에서 배양하였다. 3일 후에 5U/mL 농도의 GM-CSF 가 포함된 RPMI 1640 배양액 10mL를 다시 첨가하여 최종 배양액 양이 20mL가 되도록 하였다. 배양 6일과 8일에 배 양액을 각각 반씩 덜어내고, 같은 농도의 GM-CSF가 포함 된 10mL의 RPMI 배양액으로 교환해주었다. 배양 10일째 바닥에 부착되지 않은 세포만을 흡입하여 원심분리 후 GMloDC를 채집하였다. GMhiDC는 5U/mL 농도의 GM- CSF 대신에 200U/mL의 GM-CSF를 사용하여 같은 방법 으로 수상세포를 10일간 배양한 뒤 채집된 세포에 다시 100U/mL의 GM-CSF와 1µg/mL의 LPS (Sigma, St.
Louis, MD, USA)가 포함된 10mL의 RPMI 1640 배양액 을 혼합하여 조직배양용 petri dish (BD Falcon, No.
3003)에 넣고 2일간 배양하여 성숙시킨 뒤 채집하였다.
4. 수상세포 주입 및 피부이식
배양된 BALB/c GMloDC (3×106/마우스)를 인산완충 용액과 혼합하여 1mL 용량으로 만들어 C57BL/6 꼬리 정 맥에 주입하고, 7일 후에 BALB/c와 C3H 피부(full
thickness)를 1.5×1.5cm 크기로 박리 한 후 6마리의 C57BL/6에 BALB/c 피부 이식편을 C57BL/6의 등쪽 윗부 분에 C3H (H-2K; 샘타코) 이식편은 C57BL/6의 등쪽 아 랫부분에 각각 한 개씩 동시에 이식하였다. 이식된 피부는 매주 이식편의 상태를 관찰하였고, 이식편이 완전히 소실 되거나 생착된 조직이 없는 경우를 거부반응으로 정의하였 다.
5. 유세포 분석
형광표지자 (FITC, PE)를 부착시킨 MHC class II, CD11c, CD80, CD86의 단클론항체 (Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 2×106개의 수상세포 부유액에 각각 1µg씩 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시킨 다음 인산완충용 액으로 두 번 세척하여 유세포분석기(FACS Vantage;
Becton Dickinson, Moutain View, CA, USA)로 분석하 였다. 이때 음성 대조로는 각 단클론항체의 isotype 항체 (Pharmingen)를 동일한 조건에서 반응시켜 사용하였다.
6. Mixed lymphocyte reaction (MLR)
BALB/c의 GMloDC 또는 GMhiDC를 자극세포로 사용한 MLR에서는 C57BL/6, BALB/c T 림프구를 반응세포로 사용하여 림프구의 면역반응을 관찰하였으며, BALB/c GMloDC를 주입하고 7일 후에 C57BL/6에서 비장을 적출한 뒤 T 림프구를 분리하여 반응세포로 사용한 MLR에서는 BALB/c (allogeneic), C57BL/6 (syngeneic), C3H (third party) 비장세포를 자극세포로 사용하였다.
0.5g의 나일론 울 섬유를 20mL 주사기에 채워 넣고 BALB/c, C57BL/6 혹은 BALB/c GMloDC를 주입한 C57BL/6에서 분리한 비장세포를 RPMI 1640 배지에 혼합 하여 주사기에 주입한 뒤 37℃, CO2 배양기에서 1시간 동 안 반응시켰다. 반응 후 나일론 울 섬유에 부착되지 않은 T 림프구만을 분리하여 반응 세포로 사용하였으며,9) 자극 세 포는 BALB/c, C57BL/6, C3H의 비장세포 및 GMloDC와 GMhiDC를 20Gy 방사선 조사 후 사용하였다.8) 96 well plate에 well 당 자극 세포와 반응 세포를 각각 0.0025:1, 0.005:1, 0.025:1, 0.05:1, 0.25:1, 0.5:1, 1:1 (well 당 반응 세포수; 2×105)의 비율로 혼합하여 3일간 배양하 였고, 다시 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU; Roche Di- agnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 첨가하여 1일 간 추가로 배양하였다. 원심 분리하여 각 well의 세포들을 수집한 다음 anti-BrdU-peroxidase (Roche Diagnostics GmbH)와 2시간 반응시킨 뒤 tetramethylbenzidine
(TMB; Roche Diagnostics GmbH)으로 발색 반응을 시켜 microplate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 동 일한 실험을 두 번 반복하여 시행하였다.
7. ELISA를 이용한 사이토카인 농도 측정
IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ사이토카인 농도 측정은 ELISA 방법으로 OptEIATM set (Pharmingen)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 실험하였다. GMloDC 또는 GMhiDC 를 C57BL/6 T 림프구와 RPMI 1640 배지에 혼합하여 3일 간 배양 한 후, 상층액을 분리하여 capture 항체를 부착시 킨 96 well plate에 각 well 당 100µL씩 넣고 상온에서 2시 간 동안 반응 시켰다. 96 well plate에 biotin을 부착시킨 각 사이토카인에 대한 단클론항체를 다시 첨가하여 1시간 동 안 반응시킨 뒤 avidin이 부착되어 있는 horseradish per- oxidase로 30분간 반응시키고, TMB로 발색하여 micro- plate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
8. 통 계
이식된 피부조직의 생존기간 차이는 log-rank test로 분 석하였으며, P 값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하 였다.
결 과 1. 미성숙단계의 수상세포 배양
저용량의 GM-CSF와 2×106개의 BALB/c 골수 세포를 10일간 배양한 뒤 채집된 GMloDC는 2.5×104개로 세포 수 득률은 1.25%였고, GMhiDC는 배양 후 채집된 세포가 3.0×105개로 세포 수득률은 15%였다. 배양된 세포 모양 을 확인하기 위하여 저용량의 GM-CSF로 배양된 세포를 cytospin한 뒤 Wright-Giemsa 염색을 시행 했을 때는 작 은 돌기(dendrite)가 있는 균일한 모양의 수상 세포가 관찰 되었다(Fig. 1A). 반면에 고용량의 GM-CSF를 사용하여 골수세포를 10일간 배양한 뒤 다시 LPS와 GM-CSF를 첨 가하여 2일간 분화시킨 세포는 나뭇가지 모양의 긴 돌기가 있는 보다 큰 크기의 세포임을 확인할 수 있었다(Fig.
1B).
2. 표면 항원 분석 및 MLR
GMloDC는 GMhiDC에 비하여 세포 표면에 MHC class
II, CD11c 항원뿐만 아니라 CD80, CD86 costimulatory molecule이 적게 발현되어 있는 미성숙 단계의 세포 임을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 배양된 수상 세포의 면역 효과 를 확인하고자 GMloDC와 GMhiDC를 자극 세포로 사용하 였고, BALB/c와 C57BL/6 T 림프구를 반응 세포로 사용 하여 MLR을 시행하였다. GMhiDC에 대한 C57BL/6 림프 구 증식에 비하여 GMloDC에 대한 C57BL/6 증식 반응이 자가 림프구인 BALB/c T 림프구의 반응과 같은 수준으로 현저히 감소되어 있어, GMloDC가 항원제시세포로서 동종 T 림프구의 증식을 효과적으로 유도할 수 없었다(Fig. 3).
3. ELISA를 이용한 사이토카인 농도 측정
수상세포와 T 림프구의 면역 반응 시 생성되는 사이토카 인의 종류와 양을 측정하고자 C57BL/6 T 림프구와 BALB/c의 GMloDC, GMhiDC를 혼합 배양하여 배양 2, 3, 4일에 상층액에서 Th1 사이토카인인 IL-2, IFN-γ와 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-10을 측정하였다. GMhiDC와 T 림프구 혼합 배양 시 ELISA 방법으로 측정한 IL-2, IFN-γ는 시간이 경과 할수록 생성되는 양이 증가하였으 나, 두 수상세포와 림프구 혼합배양 시 IL-4, IL-10 생성 량은 별다른 차이가 없었다(Fig. 4).
4. 동종 피부조직 생착에 미치는 영향
BALB/c GMloDC를 C57BL/6의 꼬리 정맥에 주입하고 7일 후에 C57BL/6에서 비장을 적출하여 T 림프구를 분리 하고, 동종항원에 대한 T 림프구의 증식 반응을 측정하기 위해 MLR을 시행하였다. 분리한 C57BL/6 림프구가 C3H 항원에 대해서는 정상적으로 증식 반응을 나타냈으나 같은
Fig. 1. Wright-Giemsa staining of cytospins of GMloDC (A) and GMhiDC (B). GMloDC showed a typical plasmacytoid-like morphology, characterized by a large eccentric nucleus with granular cytoplasm and these cells expressed small dendrites. In the other hands, GMhiDC were a little larger than GMloDC and they expressed long dendrites (×400).
Fig. 2. Flow cytometric analysis of MHC class II, CD11c and costimulatory molecule expression by GMloDC and GMhiDC.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
MHC II CD11c CD80 CD86
Percent of total cells
GMloDC GMhiDC
Fig. 3. T cells in MLR. γ-irradiated BALB/c GMloDC and GMhiDC (H-2d) were cultured with C57BL/6 (H-2b) and BALB/c T lymphocytes (H-2d) for 3 days at various S:R ratios.
0 1 2 3
0.0025:1 0.005:1 0.025:1 0.05:1 0.25:1 0.5:1 1:1
S : R Ratio
Absorbance
GMloDC:BALB/c GMloDC:C57BL/6 GMhiDC:C57BL/6
A B
동종항원인 BALB/c에 대해서는 증식 반응이 현저하게 감 소되어 있어(Fig. 5), GMloDC 주입으로 C57BL/6의 체내 에서 BALB/c 항원에 반응하는 T 림프구가 제거되어 관용 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
BALB/c 혹은 C3H 피부를 이식하기 7일 전에 GMloDC 를 C57BL/6의 꼬리정맥에 주입하여 동종 피부 이식편에 대한 효과를 관찰하였다. 대조군(A)에서 이식한 BALB/c 피부조직이 6.6±0.8일째 거부반응으로 괴사되는 것에 비 하여 Fig. 6B에서와 같이 BALB/c의 GMloDC를 동종 피부 이식 전에 주입하면 이식된 피부가 평균 11.3±1.2일간 생 착되어(P<0.05), GMloDC가 생체 내에서 T 림프구의 증 식보다는 BALB/c 피부 조직에 대해 면역학적인 관용효과 를 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 GMloDC를 이 식 전에 주입하여도 이식된 C3H 피부조직의 생착기간은 대조군과 비슷하게 평균 6.8±0.7일로 관찰되어 BALB/c 수상세포에 의한 관용효과가 MLR에서의 결과와 마찬가지 로 BALB/c 이식 항원에 대해서만 국한되어 있었다.
고 찰
수상세포는 인체에서 면역반응을 가장 강력하게 유도할 수 있는 세포로 알려져 있으나, 최근에 수상세포가 전문적 항원제시 기능 이외에 동종 세포나 항원에 대하여 관용효 Fig. 4. Cytokines profiles of T cells stimulated by GMloDC and GMhiDC. Cytokines levels in supernatants
from 3- day MLR were assayed by ELISA. C57BL/6 splenic T cells (H-2b) were cultured with γ-irradiated BALB/c GMloDC and GMhiDC (H-2d).
INF-gamma
0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000
2 3 4
Days of Culture
pg/mL
GMloDC GMhiDC
IL-10
0 5 10 15 20
2 3 4
Days of Culture
pg/mL
IL-2
0 300 600 900 1,200
2 3 4
Days of Culture
pg/mL
IL-4
0 30 60 90 120
2 3 4
Days of Culture
pg/mL
GMloDC GMhiDC
GMloDC GMhiDC GMloDC GMhiDC
Fig. 5. T cells in MLR. At 7 days after 3×106 GMloDC were injected into C57BL/6, β-irradiated BALB/c (donor), C57BL/6 (host), C3H (third party) spleen cells cultured with T lymphocytes from C57BL/6 for 3 days at various S:R ratios.
0 1 2 3
0.0025:1 0.005:1 0.025:1 0.05:1 0.25:1 0.5:1 1:1 S : R Ratio
Absorbance
BALB/c C57BL/6 C3H
과를 유도 한다는 결과들이 보고되면서,3,5) 이를 장기 이식 시 거부반응을 극복하는데 이용하고자 하는 연구가 진행되 고 있다. 하지만 다른 세포와는 달리 수상세포는 체내의 여 러 조직에 다양한 형태로 존재하고, 세포의 종류와 분화단 계에 따라 특성이 달라 이를 대상으로 한 연구는 실험상의 어려움이 많다.10)
마우스의 수상세포는 림프구계 수상세포와 골수계 수상 세포(myeloid dendritic cell)로 분류되며, 골수계 수상세 포는 림프조직의 변연부에서 다량의 MHC class II 항원과 CD80, CD86 등의 costimulatory molecule을 제시하여 면 역 반응을 유도한다.4) 반면에 림프구계 수상 세포는 표면 항원이 CD8＋DEC205＋인 세포로 흉선이나 림프절에서 자 가 항원에 반응하는 T 림프구를 제거하여 면역반응을 억제
한다.6,8,11) 림프구계 수상세포와 마찬가지로 골수계 수상
세포도 미성숙 상태에서는 세포 표면에 costimulayory molecule이 적게 발현되어 효과적인 면역반응을 유도하지 못하고 오히려 T 림프구가 사멸되어 자가항원에 대한 관용 효과가 유도된다.7)
수상세포가 면역반응 혹은 관용효과를 유도 함에 있어서 서로 다른 종류의 세포가 관여하는지 혹은 같은 세포가 성 숙 단계에 따라 다른 반응을 유도하는지는 아직 명확하게 규명되어 있지 않다. 하지만 Steinman 등12,13)은 감염이나 바이러스 등의 외부 항원에 대해서는 미성숙 상태의 세포 가 성숙단계의 수상세포로 전환되면서 면역반응을 유도하 지만 정상적인 상태에서는 수상세포가 자가 항원에 반응하 는 T 림프구 또는 세포 주기에 따라 사멸된 세포를 끊임없 이 탐식하여 이를 제거하거나 면역조절 T 림프구를 생성하 여 관용 상태가 유지된다고 설명하여, 수상세포가 흉선에 서 뿐만 아니라 림프절을 비롯한 말초 조직에서도 자가 항 원에 대한 관용 상태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것 을 증명하였다. 특히 이 과정에서 여러 조직에 산재되어 있
는 수상세포가 항원을 탐식한 뒤 림프절로 이동하여 림프 절 내의 또 다른 미성숙 수상세포에 항원을 제시하여 관용 효과가 유도되며, 실험적으로 배양된 미성숙 단계의 수상 세포를 혈액 내에 주입하여도 주입된 세포의 일부가 림프 절로 이동하면서 같은 효과가 나타날 수 있다.12)
본 연구에서는 이러한 효과를 이용하여 특정 항원에 반 응하는 T 림프구의 면역 반응을 억제하고 동종 이식편에 대한 관용효과를 유도하고자 저용량의 GM-CSF를 사용하 여 GMloDC를 배양하였고, 배양된 세포가 형태학적으로도 Saloman 등9)이 림프절에서 분리한 미성숙단계의 수상세포 와 동일한 모양의 세포임을 확인하였다. 또한 이 세포는 MLR 결과에서 뿐만 아니라 피부 이식 결과에서도 BALB/
c 항원에 대한 T 림프구의 면역 반응을 감소시킬 수 있었으 며, 이러한 관용효과는 배양된 세포가 CD80, CD86 등의 costimulatory molecule 발현이 적은 미성숙 상태의 골수계 수상세포로 효과적인 T 림프구의 증식을 유도하지 못하고 특정 항원에 반응하는 T 림프구를 제거하여 나타나는 것으 로 설명할 수 있다. 그러나 주입된 GMloDC가 림프절로 이 동하여 림프절 내의 다른 미성숙 단계의 수상세포를 이용 하여 관용효과를 유도했는지, 혹은 배양된 세포 자체가 특 정 림프구의 anergy 상태를 유도했는지는 불분명하다. 마 우스의 CD8＋DEC205＋ 세포와 마찬가지로 사람에서는 표 면항원이 CD11c－CD4＋IL-3R＋인 수상세포가 IL-4, IL-10 과 같은 Th2 사이토카인을 증가시켜 관용효과를 유도할 수 있는데, 이 세포는 G-CSF 혹은 Flt-3 리간드를 사용하여 말초 조혈모세포를 가동화 시킬 경우에 증가된다.14,15) 이 식 면역에서 특정 수상세포를 이용하여 관용효과를 유도하 고자 하는 연구가 진행되고 있지만, 본 실험에서의 결과와 마찬가지로 이식 전에 수상세포를 단독으로 사용하는 방법 만으로는 관용효과를 장기간 지속시킬 수 없다. 이는 주입 한 수상세포가 체내에서 성숙 단계의 수상세포로 전환되어 Fig. 6. The observation results of skin allografts 10 days after transplantation. The
BALB/c and C3H skin grafts were rejected and have already necrotic changes in control (A). The BALB/c skin allografts weren't rejected (B, left graft) but C3H grafts rejected (B, right graft).
면역반응을 유도하거나, 수혜쥐의 체내에서 항원제시세포 가 다시 활성화되어 이식 항원에 대한 면역반응을 유도하 는 것으로 설명한다.8) 하지만 costimulatory molecule 억 제제 등을 이용하는 강력한 면역억제 방법과는 달리 수상 세포를 이용하여 관용효과를 유도하려는 노력은 여러 가지 실험상의 어려움에도 불구하고 장기 이식 수혜자의 면역 기능을 저하시키지 않으면서 이식 항원에 반응하는 T 림프 구를 선택적으로 제거하여 관용효과를 유도할 수 있다는 장점이 있다.
저용량의 GM-CSF를 이용하여 수상세포를 배양하는 방 법은 이식 항원에 대한 뚜렷한 면역반응 억제 효과에도 불 구하고 세포 수득률이 낮을 뿐만 아니라 배양된 세포가 이 미 분화 단계의 세포로 체내에서 관용효과를 오래 지속시 킬 수 없기 때문에 아직까지는 임상에서 적용하여 사용할 수는 없다. 이를 해결하기 위해 유전자를 조작한 수상세포 를 이용하는 연구가 새롭게 시도되고 있으며,16) 앞으로 체 내에서 수상세포로 분화하여 이식 항원에 대해 면역억제 효과를 유도할 수 있는 보다 초기 단계의 세포들에 대한 연 구가 필요할 것으로 생각된다.
요 약
배 경 : 성숙된 수상세포는 강력한 항원제시세포로 작용 하여 T 림프구의 면역반응을 유도하지만 수상세포가 미성 숙상태에서는 오히려 동종 항원에 대한 관용효과를 유도한 다. 본 연구에서는 수상세포의 이러한 효과를 동종장기 이 식에 대해 거부반응을 제거하는데 이용하고자 저용량의 GM-CSF를 이용하여 수상세포를 배양하고, 배양된 세포 의 면역학적 관용효과를 확인하였다.
방 법 : GMloDC는 BALB/c 골수세포를 저용량(5U/
mL)의 GM-CSF와 10일간 배양하였고 GMhiDC는 BALB/
c 골수세포를 고용량(200U/mL) GM-CSF와 10일간 배양 한 후 lipopolysaccharide로 분화시킨 세포로, 두 세포의 형태학적 특징과 표면 항원 및 동종 항원에 대한 면역학적 인 관용효과를 비교하였다.
결 과 : GMloDC는 GMhiDC에 비하여 세포 표면에 CD80, CD86 등의 costimulatory molecule이 적게 발현되 었으며, mixed lymphocyte reaction 결과에서도 동종 림프 구의 증식반응이 현저하게 감소되어 있었다. C57BL/6에 GMloDC를 주입하면 BALB/c 항원에 대해 선택적으로 관 용효과가 유도되어 이식된 BALB/c 피부 조직의 생착이 증 가하지만 이러한 효과를 장기간 지속시킬 수는 없었다.
결 론 : 저용량의 GM-CSF를 이용하여 배양한 GMloDC 는 GMhiDC에 비하여 미성숙단계의 수상세포이며, 세포표
면에 costimulatory molecule이 적게 발현되어 동종 T 림 프구의 증식을 유도하지 못하고 오히려 관용효과가 나타나 는 것으로 확인되었다.
참 고 문 헌
1) Starzl TE, Demetris AJ, Murase M, Ilstad S, Ri- cordi C, Trucco M : Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet 339:1579-1582, 1992 2) Lacatelli F, Rondelli D, Burgio G : Tolerance and
hematopoietic stem cell transplantation 50 years after Burnet's theory. Exp Hematol 28:479-489, 2000
3) Fairchild PJ, Waldmann H : Dendritic cells and prospects for transplantation tolerance. Curr Opin Immunol 12:528-535, 2000
4) Banchereau J, Steinman RM : Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245-252, 1998 5) Thomson AW, Lu L : Are dendritic cells the key to
liver transplant tolerance? Immunol Today 20:27- 32, 1999
6) Lutz MB, Kukutsch N, Ogilvie ALJ, RoBner S, Koch F, Romani N, Schuler G : An advanced cul- ture method for generating large quantities of high- ly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods 223:77-92, 1999
7) Lutz MB, Suri RM, Niimi M, Ogilvie ALJ, Kukutsh N, Schuler G, Austyn JM : Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the ab- sence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survival in vivo. Eur J Immunol 30:1813- 1822, 2000
8) O’Connell PJ, Li W, Wang Z, Specht SM, Logar AJ, Thomson AW : Immature and mature CD8α＋ dendritic cells prolong the survival of vascularized heart allografts. J Immunol 168:143-154, 2002 9) Gunzer M, Weishaupt C, Planelles L, Grabbe S :
Two-step negative enrichment of CD4＋ and CD8＋ T cells from murine spleen via nylon wool ad- herence and an optimized antibody cocktail. J Im- munol Methods 258:55-63, 2001
10) Saloman B, Cohen J, Masurier C, Klatzmann D : Three populations of mouse lymph node dendritic cells with different origins and dynamics. J Im- munol 160:707-717, 1998
11) Suss G, Shortman K : A subclass of dendritic cells kill CD4 T cells via Fas/Fas ligand induced apop- tosis. J Exp Med 183:1789-1796, 1996
12) Steinman RM, Turley S, Mellman I, Inaba K : The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med 191:411-416, 2000
13) Steinman RM, Nussenzweig MC : Avoiding horror
autotoxicus : The importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance. Proc Natl Acad Sci USA 99:351-358, 2001
14) Arpinati M, Green CL, Heimfeld S, Heuser JE, Ana- setti C : Granlocyte-colony stimulating factor mobi- lizes T helper 2-inducing dendritic cells. Blood 95:
2484-2490, 2000
15) Lui YJ, Blom B : Introduction : Th2 inducing DC2 for immunotherapy. Blood 95:2482-2483, 2000 16) Luke PPW, Thompson AW : Blockade of costimula-
tory molecules on dendritic cells : Implications for tolerance induction. Transplant Proc 33:507-508, 2001
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