[특별기획(I)] 효소공학에서 이온성 액체의 이용

서론

모든 생명체는 생명현상을 유지하기 위해서 다양한 효소를 이용한다. 이러한 효소는 일반적으로 작동환 경이 물이기 때문에, 물이 아닌 곳에서도 효소가 작용 한다는 발견은 기존의 일반적인 상식을 바꾸는 계기 가 되었다. 지난 20년간 물이 아닌 비수(nonaqueous) 용매에서의 효소반응에 대한 연구는 광범위한 분야에 서 진행되었고, 그 중요성과 응용성은 학문적으로나 산업적으로 엄청난 파급효과를 불러일으켰다. 가장 많은 연구가 진행된 유기용매에서의 효소반응은 물에 서의 효소 반응에 비하여 산업적으로 다양한 장점을 지닌다. 하지만, 유기용매는 휘발성과 발화성이 높고, 환경적으로 유해하여 이를 대체할 수 있는 용매를 찾 고자 하는 노력이 진행되었다. 2000년 들어서 본격적 으로 연구되기 시작한 것이 이온성 액체(ionic liquid) 를 용매로 이용하는 비수계 효소반응인데, 이온성 액 체는 고온에서도 증기압이 거의 0에 가깝고 다양한

기질을 용해시킬 수 있는 특성을 가지고 있는 환경친 화성 용매이다. 특히, 이온성 액체를 이용하면 유기용 매를 이용했을 때의 다양한 장점을 지님과 동시에 더 욱 우수한 효소의 반응성, 선택성, 안정성을 나타낸다 [표 1]. 이온성 액체에서 효소반응의 발견은 효소반응 의 응용성과 잠재력을 확대시키는 새로운 계기가 될 것으로 기대되고 있다. 여기서는 주로 효소반응에서 이온성 액체의 반응매질 및 첨가제로서의 장점과 단 점에 대하여 알아보고, 앞으로의 전망에 대하여 간단 히 소개하고자 한다.

이온성 액체의 특성

[그림 1]은 효소반응에 주로 이용되는 이온성 액체 를 나타낸 것으로, 일반적으로 [BF

],[PF

],[Tf

N]

음이온을 가지는 1,3-dialkylimidazolium 계열이 가장 많이 이용되고 있다.

이온성 액체의 가장 특별한 성질 중의 하나는 높은 극성(polarity)이다. Reichardt’s dye에 의해서 측정 된 이온성 액체의 polarity scale(E

)은 보통 0.6~0.7 정도의 범위이며, 짧은 체인의 알코올이나 포름아마 이드의 극성과 비슷하다. 일반적으로 이러한 범위의 극성을 가지는 무수(anhydrous) 유기용매에서 효소 는 불활성화(inactivation)되어 반응을 수행할 수 없 는 문제점이 있으나, 이온성 액체에서는 효소의 불활 성화가 거의 없으며 오히려 더 안정적이라는 것이 보 고되었다. 이는 친수성(hydrophilic)의 기질로 반응을 수행하기 위해서 극성이 높은 유기용매를 쓰면 효소 가 불활성화되는 현재까지 해결하지 못한 문제를 쉽 게 극복할 수 있는 이온성 액체의 우수한 특성이다.

예를 들어, 포도당, 과당과 같은 당류, 펩타이드와 같 은 친수성 기질을 이용하는 효소반응을 수행하기 위 이상현·구윤모

인하대학교 초정밀생물분리기술연구센터, 인하대학교 생물공학과 {shlee75, ymkoo}@inha.ac.kr

① 100℃ 이상의 고온에서도 액체상태로 증기압이 거의 0에 가깝다(Green Solvent).

② 소수성, 용해도, 점도, 밀도 등의 특성을 쉽게 변화시킬 수 있다(Designer Solvent).

③ 다양한 무기물, 유기물, 고분자 물질을 용해시킬 수 있다.

④ 유기용매내 효소반응에서의 장점(물에서는 불가능한 화 학반응 수행, 부반응의 억제, 소수성 기질 용해, 미생물 오염 가능성 저감, 생성물과 효소의 회수 용이, 효소의 안정성 증가)을 모두 포함한다.

⑤ 메탄올과 비슷한 극성을 지니면서도 효소의 활성을 감 소시키지 않는다(일반적으로, 극성의 반응기질을 포함 하는 효소반응을 위해서는 극성의 유기용매를 이용해야 하는데, 극성유기용매의 이용은 효소의 불활성화를 유 발함).

표 1. 효소반응을 위한 반응매질로 이온성 액체의 장점

특·별·기·획(Ⅰ)

해서 극성이 높은 유기용매를 사용하면 효소가 불활 성화되어 반응성이 낮은 반면에 이온성 액체는 친수 성 기질을 과량으로 녹이면서도 효소의 활성을 그대 로 유지하는 장점을 지닌다. 또한, 이온성 액체는 높은 극성을 지님에도 불구하고, 다양한 친수성 뿐 아니라 소수성의 유기물, 무기물, 고분자를 녹일 수 있는 특성 을 나타낸다. 한편, 대부분의 이온성 액체가 높은 극성 을 나타냄에도 불구하고, 이온성 액체의 물에 대한 용 해도는 다양하게 존재한다. 이온성 액체와 물의 상호 용해도는 주로 음이온에 따라서 결정이 되는데, 일반 적으로 [Ac],[NO

],[TFA],[MeSO

] 음이온을 지 니는 이온성 액체는 물에 잘 용해된다. 이러한 물에 잘 녹는 이온성 액체는 주로 물에서의 효소반응에서 부반응을 억제하여 수율을 향상시키고 효소의 선택성 을 높이기 위한 보조용매로 이용될 수 있다. [BF

], [TfO] 음이온을 지니는 이온성 액체는 양이온의 체 인 길이에 따라서 물에 대한 용해도가 결정이 되며, 양이온이 짧은 이온성 액체는 보조용매로 이용될 수

있고, 무수 이온성 액체로 효소반응을 진행하는 데에도 이용된다. [Tf

N], [PF

] 음이온을 지니는 이온성 액체는 물에 거의 녹지 않기 때문에 물과의 이 상계를 형성하여 반응을 진행하는 경우 에 이용될 수 있고, 무수 이온성 액체에 서의 효소반응에 가장 많이 이용되고 있다. 대부분의 이온성 액체는 소수성의 유기용매에 거의 녹지 않는데, 이러한 특성을 이용하여 이상계(two-phase)나 다상계(multi-phase)를 이용한 효소반 응에 대한 연구도 보고되어 있다.

이온성 액체에서의 효소반응

이온성 액체를 이용한 효소반응은 순 수한 무수의 이온성 액체를 반응 매질 로 이용하는 방법, 수용액 시스템에서 보조용매로 이용하는 방법, 이온성 액체 와 물 또는 유기용매의 이상계를 이용하는 3가지 방 법으로 분류할 수 있다. 약 20년 전 ethylammonium nitrate와 물의 혼합물에서 alkaline phosphatase의 반 응을 수행한 것이 거의 최초의 시도였으나, 순수한 이 온성 액체에서의 효소반응에 대한 보고는 비교적 최 근인 2000년 Erbeldinger에 의해서 이루어졌다. 그 이 후 유기용매를 대체하기 위한 이온성 액체의 이용에 대한 연구가 본격적으로 시작되었으며, 현재까지도 다양한 효소반응에 대한 결과가 보고되고 있다.

[표 2]는 현재까지 보고된 이온성 액체에서의 효소 반응의 예를 나타낸 것이다.

1) 가수분해 효소(Hydrolase)

현재까지 보고된 이온성 액체에서의 효소반응은 대 부분 가수분해 효소를 이용하였으며, 그 중에서도 상 업적으로 가치가 가장 높은 lipase를 많이 이용하였다.

Lipase는 유기용매에서 효소반응을 진행하는 대표적

인 효소로서, 본래의 기작은 물과 oil의 계면에서 oil을

가수분해하여 영양분으로 이용되도록 하는 것이다.

무수의 유기용매에서 lipase는 매우 안정적으로 존재 하며 가수분해의 역반응인 esterification을 촉매화하 는 산업적으로 매우 유용한 효소이다. Sheldon은 무 수의 이온성 액체에서 lipase 반응을 처음으로 수행하 여 [Bmim][PF

]와 [Bmim][BF

]에서 Candida antarctica 유래 lipase의 반응성이 일반적인 유기용매 와 비슷하다는 것을 보고하였다. Lipase를 이용하는 산업적으로 가장 유용한 반응은 라세믹 화학물 (racemate)의 광학분할이다. 대표적으로 1- phenylethanol 유도체의 광학분할이 여러 그룹에 의 해서 보고되었는데, 다양한 이온성 액체에서 반응을 수행한 결과 기존의 유기용매에서 보다 선택성과 반

응성이 향상되고, 효소의 안정성이 높게 유지되었다.

아미노산 에스터의 광학분할에 있어서도 이온성 액체 를 이용하여 기존의 공정에 비하여 향상된 수율과 반 응성을 얻을 수 있었다. Lipase를 이용한 유기용매에 서의 다양한 반응이 이온성 액체에서도 가능하다는 것이 알려지고 있으며, 친수성 기질을 이용하는 당 에 스터의 합성 같은 유기용매에서는 어려운 반응도 이 온성 액체에서 쉽게 수행될 수 있다는 것이 보고되고 있다. Lipase 다음으로 많이 연구되고 있는 것은 단백 질 분해 효소인 protease이다. Protease는 주로 이온 성 액체를 보조용매로 사용하는 반응에서 다양한 결 과가 보고되고 있다. Erbeldinger는 thermolysin을 이 용하여 이온성 액체에서 dipeptide Z-aspartame을 생

Esterase Transesterification [Bmim][PF6]

Transesterifications Various ILs

Alcoholysis, ammoniolysis, perhydrolysis [Bmim][PF6],[Bmim][BF4] Resolution of amino acid ester [EPy][BF₄],[Emim][BF₄]

Lipase Esterification of carbohydrates [MOEmim][BF₄],[Bmim][PF₆]

Synthesis of polyesters [Bmim][PF6]

Kinetic resolution of chiral alcohols Various ILs Kinetic resolution of P-chiralhydroxylmethanephosphinates [Bmim][PF6]

Subtilisin Resolution of amino acid ester [EPy][TFA]-H2O(15:85,v/v)

Themolysin Synthesis of Z-aspartame [Bmim][PF6]-H2O(95:5,v/v)

α-Chymotrypsin Transesterification [Bmim][Tf2N],[MTOA][Tf2N], [Bmim][PF6],[Omim][PF6] β-Galactosidase Synthesis of N-acetyllactosamine [Mmim][MeSO4]-H2O(25:75,v/v) Epoxide hydrolase Hydrolysis of trans-β-methylstylene oxide [Bmim][Tf2N],[Bmim][PF6] Alcohol dehydrogenase Enantioselective reduction of 2-octanone [Bmim][Tf2N]

Formate dehydrogenase Regeneration of NADH [Mmim][MeSO4]-H2O(25:75,v/v) Glucose oxidase Sulfoxidation of thioanisole and methyl 2-naphthyl sulphide [Bmim][PF6]

Peroxidase Oxidation of guaiacol [Bmim][PF6]

Laccase Oxidation of anthracene [Bmim][PF6]

Hydroxynitrile lyase Synthesis of cyanohydrins [Emim][BF4]-water Mandelate racemase Deracemization of mandelic acid Ten different ILs

Baker’s yeast Enantioselective reduction of ketones [Bmim][PF₆]-H₂O(10:1,v/v) Lactobacillus kefir cells Asymmetric reduction of 4-chloriacetophenone to [Bmim][PF₆],[Bmim][Tf₂N],

(R)-1-(4-chlorophenyl)ethanol [OMA][Tf2N]

표 2. 이온성 액체에서 효소반응의 예(Moon et al., 2006)

효소 반응 이온성 액체

특·별·기·획(Ⅰ)

산하였는데, 일반적으로 이용되는 유기용매인 ethylacetae에서의 반응과 비교하여 반응성이 비슷하 고, 효소의 안정성이 매우 우수하다는 것을 보고하였 다. α-Chmotrypsin을 이용한 이온성 액체에서의 반 응으로는 N-acetyl-L-amino acids ethyl ester의 transesterification이 수행되었는데, 반응성은 유기용 매에서와 비슷한 정도로 측정되었고 생산물의 안정성 이 유기용매에서 보다 향상되어 수율이 증대되었다.

그 외에 epoxide hydrolase, β-galactosidase 등의 가 수분해 효소를 이용한 반응에서 이온성 액체를 사용 하여 높은 수율과 반응성을 얻을 수 있었다.

2) 산화환원효소

이온성 액체에서의 효소반응은 주로 가수분해 효소 에 대한 것이 많이 보고되어 있는 반면, 산화환원효소 의 활성에 대한 연구는 상대적으로 적다. 하지만, 최근 들어서 무수의 이온성 액체에서도 다양한 산화환원효 소가 활성을 나타낸다는 것이 보고되고 있으며, Khmelnitski는 무수의 [Bmim][PF

]에서도 laccase 가 anthracene의 산화반응을 촉매화한다는 것을 보고 하였다. 하지만, 무수의 이온성 액체에서 산화환원효 소의 활성은 매우 낮은 편이며, 주로 이온성 액체와 물의 혼합물을 이용한 단일상이나 이상계에서의 반응 이 보고되고 있다. Eckstein은 [Bmim][Tf

N]과 물 의 이상계에서 alcohol dehydrogenase를 이용하여 2- octanone의 광학선택적인 환원반응을 성공적으로 수 행하였는데, 이온성 액체의 특성에 의한 기질과 생성 물의 적절한 분배가 기존의 유기용매보다 높은 반응 속도를 유도할 수 있었다. 또한, Candida boidinii 유 래의 formate dehydrogenase가 [Mmim][MeSO

] 와 buffer의 혼합물에서 매우 안정적으로 활성을 나타 낸다는 것이 보고되었다.

3) 이온성 액체의 불순물

이온성 액체에 포함되는 주된 불순물은 물과 halide 이온이다. 대부분의 이온성 액체는 흡습성이 강하여

포함되어 있는 물의 양이 쉽게 변할 수 있다. 물의 양 이 이온성 액체에서 중요한 이유는 순수한 이온성 액 체가 지니는 극성, 점도, conductivity 등이 매우 적은 양의 물에 의해서도 쉽게 변할 수 있기 때문이다. 또 한, 무수 용매에서 효소반응을 진행함에 있어서 물은 효소의 구조를 안정적으로 활성을 띄도록 유지시킬 수도 있고, 불활성화시킬 수도 있는 매우 중요한 인자 이다. 무수의 이온성 액체에서의 효소반응에서도 물 은 매우 중요한 역할을 하며, 포함된 물의 양에 의해 서 효소의 활성은 크게 변한다. 한편, 이온성 액체에는 합성과정에 중간체로 이용한 halide 이온을 포함하는 이온성 액체가 완전히 제거되지 않고 존재할 수 있으 며, halide 이온의 함량은 효소의 활성에 많은 영향을 미친다. 이러한 두가지의 불순물에 대한 영향을 이해 하지 못하여 매우 상반되는 효소반응 결과가 다른 연 구 그룹에 의해서 자주 보고되고 있는데, 이는 이온성 액체의 순도가 효소반응에서 중요하다는 것을 인지하 지 못하였기 때문이다.

효소 안정화를 위한 이온성 액체의 이용

일반적으로 효소공정은 우수한 반응성과 선택성에 도 불구하고, 효소의 높은 가격이 산업화의 가장 큰 걸림돌이다. 이를 극복하기 위해서는 안정성이 매우 우수한 효소의 개발이 필요하며, 일반적인 방법이 효 소의 고정화이다. 그런데, 이온성 액체가 반응매질로 이용될 때 효소의 안정성을 향상시킨다는 결과는 이 온성 액체의 또 다른 응용 가능성을 제시하게 되었다.

이온성 액체를 효소 안정화를 위한 첨가제로 이용하

는 방법으로, 김만주 박사팀은 녹는점이 53° C인

[PPmim][PF

]로 lipase를 코팅하여 유기용매에서

native lipase에 비하여 높은 선택성과 안정성을 나타

내는 효소를 개발하였다. 이와 유사한 방법으로 셀룰

로오스 필름에 laccase를 고정화하는 경우에 소수성의

이온성 액체로 효소를 먼저 코팅하여 안정성을 향상

시킨 결과도 보고되어 있다. 또 다른 방법으로 sol-gel

방법으로 효소를 고정화할 경우에 첨가제로 이온성

액체를 사용하면 효소의 활성과 안정성이 향상된다는 것이 최근 보고되어, 효소의 안정제로서의 이온성 액 체의 이용에 대한 관심이 높아지고 있다.

요약 및 전망

이온성 액체를 효소반응을 위한 반응매질로 이용하 면 유기용매가 지니는 위험성과 유독성을 극복할 수 있다는 근본적인 장점 외에 효소의 활성, 선택성, 안정 성 증대라는 부가적인 효과를 얻을 수 있다. 그러나, 이온성 액체를 반응매질로 이용한 시스템을 산업화하 기 위해서는 극복해야할 점들이 몇가지 있다. 첫째, 일 반적으로 이온성 액체는 유기용매에 비하여 점도가 높다. 보통의 이온성 액체가 25° C에서 35~500cp의 점도를 지니는데, 톨루엔이 0.6cp, 물이 0.9cp인 점을 비교할 때 매우 높은 값임을 알 수 있다. 높은 점도는 작동환경을 어렵게 하고 물질전달의 한계를 극복해야 하는 문제를 유발한다. 하지만, 점도가 낮은 이온성 액 체가 계속 보고되고 있기 때문에 이러한 문제는 조만 간 쉽게 해결될 것으로 보인다. 둘째, 이온성 액체의 합성 과정에서 포함되는 불순물은 효소반응을 진행함

에 있어서 많은 영향을 미쳐서 재현성이 떨어지게 만 든다. 주로 포함되는 halide 계열의 불순물은 특히 효 소의 활성을 많이 감소시키므로 순수한 이온성 액체 를 합성할 수 있는 기술이 중요하다. 현재는 halide 계 열의 불순물이 포함되지 않도록 합성하는 방법과 크 로마토그래피를 이용한 정제방법이 보고되어 있으므 로 해결하기 어려운 문제는 아니라고 생각한다. 셋째, 이온성 액체에서 효소반응을 진행한 후 남아있는 반 응물과 생성물을 추출하기 위한 방법의 개발이다. 이 러한 목적으로 초임계 CO

를 이용하는 친환경적인 방법이 최근 개발되었지만, 이온성 액체를 반응매질 로 하는 효소공정이 완전히 친환경적인 시스템이 되 기 위해서는 추출공정을 위해 다시 사용하게 되는 유 기용매의 양을 감소시키는 더 많은 연구가 필요하다.

위와같이 이온성 액체가 효소반응을 위한 반응매질로 이용되기 위해서는 아직도 극복해야 할 점들이 있지 만, 이온성 액체는 21세기의 패러다임인 환경 친화적 인 공정의 개발이라는 관점에 부합하는 최적의 용매 이기 때문에 앞으로의 전망은 매우 밝을 것으로 기대 되고 있다.

이 철 수

고려대학교 화공생명공학과, [email protected]

서론

이온성 액체는 발견된 지 오래되었지만 비교적 최 근에 반응용매의 관점에서부터 시작된 관심은 이제 열역학적 특성에 까지 파급되어 요즈음 이온성 액체 의 열역학적 특성과 평형에 관한 논문들이 활발하게 발표되고 있다. 2004년의 Chemical vision 2020 (http://www.chemicalvision2020.org/ionic_roadma p.html)은 이온성 액체를 이용한 공정의 상용화문제 와 연구개발 필요성을 논의하고 있으며 이온성 액체

에 관한 연구가 2000년 이후 급격하게 증가하고 있다

는 것을 보여주고 있다. 또한 이온성 액체의 공정화를

위해서는 열역학적 특성의 데이터와 모델링이 필요하

다는 것도 제시되어 있다. 이온성 액체의 분리용매로

서의 새로운 관심은 반응용매로 이용된 이온성 액체

의 반응 혼합물로부터 생성물 또는 미반응 반응물의

분리는 물론이고 환경친화적 용매로서의 응용 가능성

에 기인한다. 이온성 액체에 관한 정보는 단순한 인터

넷 검색만 해도 넘쳐 날 정도이므로 이 글은 기초적