NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 29, No. 2, 2011 … 175
특·별·기·획(Ⅰ)
서론
일반적으로 작동환경이 물인 효소가 물이 아닌 곳 에서도 작용한다는 발견은 기존의 일반적인 상식을 바꾸는 계기가 되었다. 그 후 지난 20년간 물이 아닌 비수(nonaqueous) 용매에서의 효소반응에 대한 연구 는 광범위한 분야에서 진행되었고, 그 중요성과 응용 성은 학문적으로나 산업적으로 엄청난 파급효과를 불 러일으켰다. 비수계 용매 중 가장 많은 연구가 진행된 유기용매에서 효소는 (1) 화학평형에 의해서 물에서 는 불가능한 다양한 반응을 수행할 수 있고, (2) 물에 녹지 않는 소수성(hydrophobic) 물질로 반응을 진행 할 수 있고, (3) 기질에 대한 선택성이 높고, (4) 고온 에서 장시간 반응하여도 안정성이 높고, (5) 부반응을 억제하면서 반응을 진행할 수 있고, (6) 미생물에 의 한 오염의 걱정이 없다는 장점이 있다. 하지만, 이러한 장점에도 불구하고 유기용매는 휘발성 및 폭발성이 높고, 환경적으로 유해하여 이를 대체할 수 있는 용매 를 찾고자 하는 노력이 진행되었으며, 2000년 들어서 본격적으로 연구되기 시작한 것이 이온성 액체(ionic liquid)를 용매로 이용하는 효소반응이다.
이온성 액체(ionic liquid)는 양이온과 음이온의 이 온결합으로 이루어진 소금과 같은 물질로써 100℃ 이 하에서 액체상태로 존재하며, 고온에서도 안정적으로 액체로 존재하고, 증기압이 거의 0에 가깝기 때문에
‘green solvent’라 불리면서 친환경용매로 많은 관심 을 받고 있다. 또한, 이온성 액체는 다양한 무기물, 유 기물, 고분자 물질을 용해시킬 수 있고, 소수성, 용해
도, 점도, 밀도 등의 물리화학적 특성을 쉽게 변화시킬 수 있어서“designer solvent”로도 불리우며, 이론상으 로 1018가지 이상의 합성이 가능하여 용매로서의 무한 한 잠재력을 지니고 있다. 이온성 액체는 기존의 유기 용매가 지니지 못하는 다양한 특성을 나타낼 뿐 아니 라 사용자의 목적에 맞는 용매를 선택하고 합성할 수 있다는 큰 장점을 지닌다. 특히, 이온성 액체에서의 효 소반응의 경우 유기용매를 이용했을 때의 다양한 장 점을 지님과 동시에 더욱 우수한 효소의 반응성, 선택 성, 안정성이 나타낸다는 연구결과들이 보고되고 있 다. 이러한 현상의 원인을 규명하기 위해 시뮬레이션 (computer simulation)을 통한 연구 또한 활발하게 진행되고 있다. 그러므로, 본 원고에서는 이온성 액체 을 매질로 이용한 대표적 효소반응과 이에 대한 컴퓨 터 시뮬레이션에 대해 소개하고자 한다.
이온성 액체에서의 효소반응
이온성 액체를 이용한 효소반응은 순수한 무수의 이온성 액체를 반응 매질로 이용하는 방법, 수용액 시 스템에서 보조용매로 이용하는 방법, 이온성 액체와 물 또는 유기용매의 이상계를 이용하는 3가지 방법으 로 분류할 수 있다. 약 20년 전 ethylammonium nitrate와 물의 혼합물에서 alkaline phosphatase의 반 응을 수행한 것이 거의 최초의 시도였으나, 순수한 이 온성 액체에서의 효소반응에 대한 보고는 비교적 최 근인 2000년 Erbeldinger에 의해서 이루어졌다. 그 이 후 유기용매를 대체하기 위한 이온성 액체의 이용에
이온성 액체에서의 효소반응
하성호, 구윤모*
한남대학교 나노생명화학공학과, *인하대학교 생명화학공학부 [email protected], *[email protected]
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특·별·기·획(Ⅰ)
대한 연구가 본격적으로 시작되었으며, 주로 가수분 해 효소(lipase, esterase, protease, glycosidase) 및 산 화 환 원 효 소 (alcohol dehydrogenase, peroxidase, laccase)를 이용한 반응들이 현재까지 보고되어 있다.
이온성 액체에서 이용되는 대표적인 가수분해 효소 는 상업적으로 가치가 가장 높은 lipase이다. Lipase는 유기용매에서도 효소반응 수행을 위해 사용된 대표적 인 효소로서, 본래의 기작은 물과 oil의 계면에서 oil을 가수분해하여 영양분으로 이용되도록 하는 것이다.
무수의 유기용매에서 lipase는 매우 안정적으로 존재 하며 가수분해의 역반응인 esterification을 촉매화하 는 산업적으로 매우 유용한 효소이다. 네덜란드의 Sheldon 그룹은 무수의 이온성 액체에서 lipase 반응을 처음으로 수행하여 [Bmim][PF6]와 [Bmim][BF4] 에서Candida antarctica 유래 lipase의 반응성이 일 반적인 유기용매와 비슷하다는 것을 보고하였다. 다 양한 이온성 액체에서 반응을 수행한 결과 기존의 유 기용매에서 보다 선택성과 반응성이 향상되고, 효소 의 안정성이 높게 유지되었다. 스페인의 Lozano 그룹 또한 이온성액체에서 CaLB(Candida antarctica Lipase B)가 유기용매에서보다 3배정도 안정하다는 연구결과를 발표했으며, 일본의 Itoh 그룹에서는 [Emim][PF6]에서의 CaLB를 이용한 1-Phenylehtanol 의 광학분할이 기존의 용매보다 뛰어나다는 것을 보 고하였다. Lipase를 이용한 유기용매에서의 다양한 반응이 이온성 액체에서도 가능하다는 것이 알려지고 있으며, 친수성 기질(당)과 소수성 기질(지방산)을 동시에 이용해야 하기 때문에 물, 유기용매 등과 같은 기존의 용매를 사용한 공정에서는 어려운 반응도, 극 성과 비극성 물질을 모두 용해시킬 수 있는 특징을 가 지고 있는 이온성액체에서 lipase 촉매반응을 통한 당 에스터 생산이 쉽게 수행될 수 있다고 보고되고 있다.
한국의 구윤모 그룹의 연구결과에 따르면, [Emim][TfO]내에서의 CaLB를 이용한 바이오디젤 의 생산성이 기존에 바이오디젤 생산에 최적의 용매 로 알려진 tert-BuOH에 비해 높다고 보고하였다. 이
를 통한 친환경적인 바이오디젤 생산 또한 귀추가 주 목되고 있다.
Lipase 다음으로 많이 연구되고 있는 것은 단백질 분해 효소인 protease이다. Protease는 주로 이온성 액체를 보조용매로 사용하는 반응에서 다양한 결과가 보고되고 있다. 미국의 Erbeldinger 그룹은 thermolysin을 이용하여 이온성 액체에서 dipeptide Z-aspartame을 생산하였는데, 일반적으로 이용되는 유기용매인 ethylacetae에서의 반응과 비교하여 반응 성이 비슷하고, 효소의 안정성이 매우 우수하다는 것 을 보고하였다. 스페인의 Lozano 그룹은 α- chmotrypsin을 이용하여 이온성 액체에서 N-acetyl- L-amino acids ethyl ester의 transesterification을 수 행하였는데, 반응성은 유기용매에서와 비슷한 정도로 측정되었고 생산물의 안정성이 유기용매에서 17배 정 도 향상되었다는 결과를 보고하였다. 그 외에 epoxide hydrolase, β-galactosidase 등의 가수분해 효소를 이 용한 반응에서 이온성 액체를 사용하여 높은 수율과 반응성을 얻을 수 있었다.
이온성 액체에서의 효소반응은 주로 가수분해 효소 에 대한 것이 많이 보고되어 있는 반면, 산화환원효소 의 활성에 대한 연구는 상대적으로 적다. 하지만, 최근 들어서 무수의 이온성 액체에서도 다양한 산화환원효 소가 활성을 나타낸다는 것이 보고되고 있다. 하지만, 무수의 이온성 액체에서 산화환원효소의 활성은 매우 낮은 편이며, 주로 이온성 액체와 물의 혼합물을 이용 한 단일상이나 이상계에서의 반응이 보고되고 있으며, 특히 이온성 액체의 특성에 의해 기질과 생성물의 적 절한 분배가 일어나 기존의 유기용매보다 높은 반응 속도를 유도할 수 있다.
효소 반응성 향상을 위한 이온성액체에서의 기질 용해도 증진
이온성 액체가 친수성, 소수성의 물질을 모두 용해 시킬 수 있다는 장점은 있지만 효소의 활성을 억제하 지 않으면서 친수성, 소수성의 용질을 용해시킬 수 있
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특·별·기·획(Ⅰ)
는 이온성 액체를 찾기란 쉽지 않다. 특히 당과 같은 친수성 물질은 상대적으로 이온성 액체에서의 용해도 가 적어 당을 사용하는 효소반응을 진행하는데 있어 어려움이 있다. 한 예로 [Emim][MS], [Emim][Cl]
의 경우 당인 glucose가 매우 높은 용해도(25℃에서 90~145 g/L)를 보이지만, 효소를 비활성시키기 때문 에 효소반응의 용매로써 적합하지 않다. 반면에 [Bmim][BF4], [Emim][TfO]와 같은 이온성 액체 는 효소반응에 적합한 용매이지만, glucose의 용해도는 매우 낮다. 효소의 반응성이 높은 이온성 액체에서 당 의 용해도를 증진시키기 위해, 구윤모 그룹은 최근 당 을 물에 먼저 녹인 후 이 혼합물을 이온성 액체에 넣고 물을 증발시켜 이온성액체에 당을 과포화 시키는 공정 을 개발하였다(대한민국 특허 제10-0791848호). 이온 성 액체의 증기압이 거의 없다는 특성을 이용한 방법 으로, [Bmim][BF4]와 [Emim][TfO]에서의 glucose 용해도를 각각 10배, 19배가 증가시킬 수 있었다.
컴퓨터 시뮬레이션을 이용한 이온성 액체에서의 효소반응 연구
상기와 같이 이온성액체에서 다양한 효소반응이 수 행되고 있으며, 이를 통해 이온성액체가 지니고 있는 장점들이 계속적으로 보고되고 있다. 하지만 결과에 대 한 명확한 이유 없이, 유기용매에서의 반응 메커니즘에 기초를 둔 추측을 바탕으로 결과를 보고하는 경우가 많았다. 따라서 정확한 이유와 메커니즘을 밝혀내기 위 해 컴퓨터를 사용한 분자 시뮬레이션(molecular
simulation)을 통한 원자 수준의 분석이 최근 들어 진 행되고 있다. 효소와 이온성액체를 사용한 대표적인 시뮬레이션은 주로 효소 안정성에 관한 것이다. 포르 투칼의 Soares 그룹에서는 [Emim] [PF6]와 [Emim][NO3]에서의 Serine protease cutinase의 변화 에 대한 컴퓨터 시뮬레이션을 진행한 뒤, 여러 가지 통계적인 분석을 통하여 효소가 안정성에 영향을 미 치는 이유가 음이온 때문임을 밝혀냈다. [Emim]
[NO3]의 경우 [NO3] 음이온이 효소의 알파-나선(a- helix)이나 고리(loop) 부분에 위치한 아미드 그룹과 강하게 결합하여 구조의 불안정화를 일으키나, [Emim][PF6]의 경우 위와 같은 결합이 없어 구조적 으로 안정함을 증명하였다[그림 1]. 또한 [Emim]
[PF6] 내에서 효소가 가장 안정할 수 있는 최적의 물 함량과 온도를 찾아내었다. 이 밖에 이온성 액체를 포 함한 여러용매에서 효소활성 부위의 변화 관찰, 여러 가지 이온성 액체와 유기용매 내에서의 효소 안정성 비교 및 분석, 이온성 액체와 유기용매에서의 단백질 접힘/풀림 분석 등 실제 실험으로는 관찰과 분석이 힘든 내용을 컴퓨터를 통한 원자적인 수준에서의 접 근을 통한 연구가 늘어나는 추세이며, 이를 통해 실제 효소반응을 위한 최적의 이온성 액체를 디자인하는데 방향을 제시할 수 있을 것으로 전망되고 있다.
이온성 액체에서의 당의 과포화 결과에 대한 원인 을 규명하기 위해 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 원자수 준의 분석이 최근 시도되었다. 미국의 Yingling 그룹 과의 공동연구를 통해 구윤모 그룹은 이온성액체의 그림 1. 분자 시뮬레이션 결과 얻어진 (A) [Bmim][PF6] 와 (B) [Bmim][NO3] 이온성 액체에서 cutinase의 conformation (2.5 %
water percentage와 343 K 조건) [The Journal of Physical Chemistry B & Design, 2008, 112, 2566-2572].
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분자적 동역학을 분석해봤을 때 glucose 주변에 있는 소량의 물이 이온성액체 내에서 glucose를 단순 분산 (mono-disperse) 시키는데 도움을 주는 개선제 역할 을 한다는 결과를 보고하였다[그림 2].
전망
이온성 액체를 효소반응을 위한 반응매질로 이용하 면 유기용매가 지니는 위험성과 유독성을 극복할 수 있다는 근본적인 장점 외에 효소의 활성, 선택성, 안정 성 증대라는 부가적인 효과를 얻을 수 있다. 그러나, 이온성 액체를 반응매질로 이용한 공정 시스템을 산 업화하기 위해서는 극복해야할 점들이 몇 가지 있다.
첫째, 일반적으로 이온성 액체는 유기용매에 비하여 점도가 높다. 이온성 액체가 25℃에서 35~500 cp의 점도를 지니는데, 톨루엔이 0.6 cp, 물이 0.9 cp인 점 을 비교할 때 점도가 높다는 것을 알 수 있다. 높은 점 도는 작동환경을 어렵게 하고 물질전달의 한계를 극 복해야하는 문제를 유발한다. 하지만, 점도가 낮은 이 온성 액체가 계속 보고되고 있기 때문에 이러한 문제 는 조만간 쉽게 해결될 것으로 보인다. 둘째, 이온성 액체의 합성 과정에서 포함되는 불순물은 효소반응을
진행함에 있어서 많은 영향을 미쳐서 재현성이 떨어 지게 만든다. 주로 포함되는 halide 계열의 불순물은 특히 효소의 활성을 많이 감소시키므로 순수한 이온 성 액체를 합성할 수 있는 기술이 중요하다. 현재는 halide 계열의 중간물을 이용하지 않고 합성하는 방법 과 크로마토그래피를 이용한 정제방법들이 보고되고 있으므로 해결하기 어려운 문제는 아니라고 생각한다.
셋째, 이온성 액체에서 효소반응을 진행한 후 남아있 는 반응물과 생성물을 추출하기 위한 방법의 개발이 다. 이러한 목적으로 초임계 CO2를 이용하는 친환경 적인 방법이 최근 개발되었지만, 이온성 액체를 반응 매질로 하는 효소공정이 완전히 친환경적인 시스템이 되기 위해서는 추출공정을 위해 다시 사용하게 되는 유기용매의 양을 감소시키는 더 많은 연구가 필요하 다. 위와 같이 이온성 액체가 효소반응을 위한 반응매 질로 이용되기 위해서는 아직도 극복해야 할 점들이 있지만, 이온성 액체는 21세기의 패러다임인 환경 친 화적인 공정의 개발이라는 관점에 부합하는 최적의 용매이기 때문에 앞으로의 전망은 매우 밝을 것으로 기대되고 있다.
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