유산균 발효 식혜의 품질 특성 및 기능성 평가 오병민

유산균 발효 식혜의 품질 특성 및 기능성 평가

오병민¹․전현일¹․오현화¹․조승화²․정도연²․김영수¹․송근섭¹

1전북대학교 식품공학과

2(재)발효미생물산업진흥원

Quality Characteristics and Functional Evaluation of Sikhye Fermented by Lactic Acid Bacteria

Byung-min Oh

, Hyun-Il Jun

, HyeonHwa Oh

, Seung-Wha Jo

, Do-Youn Jeong

, Young-Soo Kim

, and Geun-Seoup Song

1

Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University

2

Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI)

ABSTRACT This study was carried out to investigate the effects of lactic acid bacteria on the quality and functional characteristics of Sikhye. Of the five lactic acid bacteria strains isolated from Makgeolli, lactic acid bacterium Lactobacillus plantarum LM001, showing the highest total acidity, was selected for the production of Sikhye fermented by lactic acid bacteria (SFLAB). Soluble solids, reducing sugar, pH, total acidity, viable cell count, and total phenolic content of SFLAB were 9.38∼11.30°Brix, 68.39∼89.11 mg/mL, 2.80∼4.54, 0.01∼0.52%, 6.33∼8.43 log CFU/mL, and 0.64∼0.68 mg/mL, respectively. As lactic acid fermentation progressed, soluble solids, reducing sugar, pH, and total phenolic content increased, whereas total acidity and viable cell count decreased. The major organic acid and free sugar contents of SFLAB were lactic acid (144.66∼961.63 mg%) and maltose (8,504.01∼6,503.92 mg%), respectively. Lipase inhibitory and antimicrobial activities for Bacillus cereus of SFLAB increased as lactic acid fermen- tation progressed. These results suggest that SFLAB may be useful as a potential functional food for enhancing health.

Key words: Sikhye, lactic acid bacteria, quality characteristics, lipase inhibition activity, antimicrobial activity

Received 18 May 2020; Accepted 20 July 2020

Corresponding author: Geun-Seoup Song, Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University, Jeonju, Jeonbuk 54896, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-63-270-2568

Author information: Byung-min Oh (Researcher), Hyun-Il Jun (Researcher), HyeonHwa Oh (Researcher), Young-Soo Kim (Pro- fessor), Geun-Seoup Song (Professor)

서 론

쌀은 옛날부터 식생활 문화에서 주식으로서 우리 민족과 함께하였으나, 현재는 국내 쌀 소비량이 1998년 99.2 kg에 서 2018년 61.0 kg으로 20년 만에 약 38.2 kg이 감소하는 등 해마다 감소하고 있어 사회적 문제가 되고 있다(Lee, 2019). 쌀 소비량을 증가시키기 위해서는 주식보다는 편리 하게 섭취할 수 있는 기능성 강화 가공식품으로 소비하는 것이 효과적이라고 판단된다(Shin과 Lee, 2018).

유산균은 당을 이용하여 젖산을 생성하는 균으로

Lacto- bacillus

Lactococcus

Enterococcus

Bifidobacterium

다양한 기능성 성분을 증진시키고 pH를 낮추어 식품의 저장 성을 높이는 역할 때문에 육류, 야채, 유제품 등에 많이 이용 되고 있으며, 최근 아시아에서는 곡류에 미생물을 발효하는 곡류 발효 식품과 다양한 전통 발효 식품 등의 관심이 높아 지고 있어 곡류에 유산균을 발효하는 식품에 대한 연구가 필요하다(Nout, 2009).

식혜는 멥쌀이나 찹쌀을 증자하여 쌀에 함유된 생전분을 호화전분으로 전환시킨 후 엿기름 추출액의 amylase로 호 화전분을 limit dextrin, maltose, glucose 등으로 당화시켜 특유의 풍미와 감미를 증가시킨 우리나라의 대표적 전통 음 료이다(Park, 2006; Lee 등, 2018). 식혜의 수용성 고형분 은 쌀의 종류나 첨가량, 엿기름의 첨가량 및 당화시간에 따라 수용성 고형분의 함량이 결정되는데 일반적으로 약 10°Brix 이상으로 알려져 있다(Jeon과 Kim, 1998; Song과 Hwang, 2016; Cho와 Joo, 2010). 국내 음료시장이 보다 고급화되 고 있는 상황에서 국내산 쌀에 건강기능성이 잘 알려진 유산 균을 접목하여 새로운 형태의 기능성 강화식품의 개발이 가 능할 것으로 판단되지만 아직 유산균 발효 식혜(

Sikhye

자 막걸리에서 분리한

Lactobacillus plantarum

재료 및 방법

실험재료 및 기기

본 연구에서 식혜 제조에 사용된 쌀(우렁논 쌀)은 전북 순 창지역에서 2018년도에 재배한 우렁논 쌀을 순창농산물특 산품 직판장에서, 엿기름은 경남 함양군 함양농협 가공사업 에서 2018년에 제조한 가공품을 함양농협에서 구입하여 사 용하였다. 한편 유산균 분리에 사용된 4종의 쌀막걸리는 강 원도 영월군에 있는 영월 양조장의 영월 동강 생막걸리, 강원 도 정선군에 있는 농업회사법인 정선명주의 곤드레 생막걸 리, 강원도 동해시에 있는 낙천 주류의 지장수 호박 생막걸 리, 강원도 정선에 위치한 정선아리랑 협동조합의 황기 생막 걸리를 전북 전주의 지역마트에서 구입하여 사용하였다.

본 연구에서 사용된 glucose, maltose, fructose, oxalic acid, lactic acid, pyroglutamic acid, gallic acid, ascorbic acid, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2′-azino- bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

유산균주 분리 및 선발을 위한 배지는 lactobacilli MRS agar와 lactobacilli MRS broth, 항균 활성을 위한 배지는 nutrient agar(NA)와 nutrient broth(NB), 일반세균수 측정 배지는 plate count agar(PCA)를 Difco Co.(Sparks, MD, USA)에서 구입하였으며, 그 밖의 시약들은 analytical 및 HPLC grade를 사용하였다.

본 연구에 사용된 균주로는 유산균 대조군으로 사용된

Lactobacillus rhamnosus

Lactobacillus plantarum

Bacillus cereus

Bacillus cereus

Bacillus cereus

Escherichia coli

본 연구에 사용된 기기로는 배양물의 균체를 제거하기 위 해 소형 원심분리기(CT15RE, Hitachi Koki Co., Ltd., To- kyo, Japan)와 대형 원심분리기(CR21, Hitachi Koki Co., Ltd.), 균주 배양을 위하여 정치 배양기(VS-1203PI, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)와 진탕 배양기(SI- 300R, Jeio Tech Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 사용하였 다. 식혜 제조를 위해 증자기(DAS-30, Dong-A, Changwon, Korea)와 제분기(single type stainless roller, Shinpoong Eng. Ltd., Gwangju, Korea)를 사용하였다. 품질 분석에서 pH는 pH meter(SevenMulti, Mettler-Toledo GmBH,

Giessen, Germany), 수용성 고형분 함량은 당도계(PAL-1, Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan), 색도는 색도계(Chroma meter CR 400, Konica Minolta, Tokyo, Japan), 흡광도는 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, Kyoto, Japan), 유기산 및 유리당은 UV-VIS detecter(SPD-10A, Shimadzu Co.) 를 장착한 HPLC system(Shimadzu Co.)을 이용하여 측정 하였다.

유산균의 분리 및 동정

쌀막걸리 100 μL를 lactobacilli MRS broth 1 mL에 현탁 하고 희석(10⁶~10⁷)하여 lactobacilli MRS agar에 도말한 후 정치 배양(37°C, 1일)하였다. 배양된 균주의 colony를 임 의선별 및 획선도말 하여 single colony를 분리하였다. 분리 된 균주는 25% glycerol을 첨가하여 -80°C에 보관하며 사 용하였다. 분리된 균주의 동정은 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 위해 universal primer 27F(5′-AGAGTTITGAT CC TGGCTCAG-3′)와 1492R(5′-GGTTACCTTGTTAC GA CTT-3′)을 사용하여 유전자를 증폭한 다음 PCR 산물 을 정제한 후 염기서열을 해독하였다. 이 염기서열을 이용하 여 BLASTN search(Zhang 등, 2000)와 Ribosomal Data- base Project(RDP, ver11)의 SeqMatch program에서 서 열 일치도가 높은 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 을 얻었고, 염기서열 간의 상호비교를 위해 CLUSTAL W (Thompson 등, 1994)를 사용하였다. 계통도 분석은 균주 들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 크로마토그 램의 비교와 수작업으로 gap이 최소화되게 보정한 후 Tamura-Nei model에 기초한 Maximum Likelihood 방법 (Tamura와 Nei, 1993)을 사용하였고, 각각의 계통수에서 각 분자에 대한 통계적 신뢰의 산출을 bootstrap을 1,000회 설정하여 MEGA program(Tamura 등, 2011)을 사용해 계 통분석 tree를 작성하였다.

식혜 제조

증자 쌀가루는 쌀 8 kg을 3회 수세하고 정제수 16 L를 첨가하여 4시간 수침한 후 30분간 탈수한 다음 roll mill을 이용하여 2회 제분한 쌀가루를 면포로 덮은 후 증자(0.3 pa, 20분)하여 제조하였다.

엿기름 추출액은 엿기름 4.5 kg에 정제수 25 L를 넣고 2시간 동안 침출시킨 후 착즙기로 착즙하여 제조하였다.

식혜는 증자 쌀가루에 엿기름 추출액 25 L와 정제수 25 L를 첨가하여 당화(60°C, 6시간)시킨 후 100°C에 5분간 가 열하여 제조하였다. 제조된 식혜는 원심분리(3,000 rpm, 15 min, 4°C)하여 상등액을 모아 감압여과하고 -20°C에서 보관하면서 사용하였다. 이때 제조된 식혜의 수용성 고형분 은 10.51°Brix였다.

우수 유산균 선정

쌀막걸리에서 분리된 유산균 5종(

Lactobacillus planta-

rum

Lactobacillus plantarum

Lactoba- cillus fermentum

Lactobacillus paracasei

Lactobacillus paracasei

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus rhamnosus

유산균 발효 식혜 제조

SFLAB는 선정된 유산균 전 배양액 10 mL를 멸균된 식혜 1 L에 접종하고 진탕 배양(37°C, 120 rpm, 2일)하여 제조 하였다. 유산균 전 배양액은 식혜에 접종하기 전 파장 600 nm에서 흡광도를 1.00(at 생균수 7.22 log CFU/mL)으로 조절한 후에 사용하였다.

이화학적 특성

pH는 pH meter를 사용하여 측정했으며, 총산도는 시료 1 mL에 0.1 N NaOH를 첨가하여 pH 8.3에 도달할 때까지 소모된 양을 lactic acid 함량으로 산출하였다. 수용성 고형 분 함량은 당도계로 측정하였고, 색도는 시료를 일정량 취해 색도계를 이용하여 Y=85.6, x=0.3172, y=0.3241인 표준 백색판(standard white plate)으로 보정하여 L^*, a^* 및 b^*값 을 측정하였다.

총 페놀성 화합물 함량(total phenolic content, TPC)은 ISO 14502-1(2005)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 5 mL를 첨가하여 3분간 반응시킨 후 7.5% Na₂CO₃ 4 mL를 첨가하 였다. 이 반응액을 암소에서 반응(23°C, 1시간)시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 총 페놀성 화합물 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 시료 mL당 mg gallic acid로 나타내었다. 정량 분석에 사용된 검량 회귀식은 Y＝0.0105X

＋0.0033(R²=0.99)으로 gallic acid 농도별 흡광도 값의 결 과에서 산출하여 나타내었다.

환원당(reducing sugar)은 Park과 Lee(2005)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 3,5-dinitrosalicylic acid reagent 3 mL를 첨가하여 순차적으로 중탕(100°C, 5분) 및 냉각(5°C, 5분)한 용액을 540 nm에서 흡광도를 측 정하였고, 환원당은 glucose를 표준물질로 하여 시료 mL당 mg glucose로 나타내었다. 정량 분석에 사용된 검량 회귀식 은 Y＝0.0052X－0.2557(R²=0.99)로 glucose 농도별 흡광 도 값의 결과에서 산출하여 나타내었다.

생균수(viable cell counts)는 Choi 등(2014)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료를 적절한 희석배수로 희석하여

0.1% bromo phenol blue를 첨가한 MRS agar에 100 μL를 도말하였다. 도말한 MRS agar를 정치 배양(37°C, 24시간) 하여 30~300개 사이에 형성된 집락수를 계수한 후 log CFU/mL로 나타내었다.

HPLC를 이용한 유기산 및 유리당 측정

유기산 및 유리당은 Kim과 Song(2002)의 방법으로 측정 하였다. 분석을 위해 시료를 희석하여 Sep-pak C18 car- tridge(Waters, Milford, MA, USA)에 통과시킨 다음, 0.22 μm membrane filter(Futecs Co., Ltd., Daejeon, Korea) 로 여과하여 HPLC system으로 측정하였다. 분리된 유기산 및 유리당의 각 peak는 동일 조건에서 분석한 표준물질 mix- ture의 peak 면적 비율과 retention time을 비교하여 함량 을 산출하였다. HPLC system의 분석조건은 Aminex HPX 87H Ion Exclusion column(300×7.8 mm, 9 μm, Bio-Rad Labs., Richmond, CA, USA), 이동상은 0.008 M H₂SO₄, 유속은 0.6 mL/min, column oven 온도는 35°C 및 검출 파장은 210 nm였다.

항산화 활성

DPPH 라디칼 검정은 Kano 등(2005)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100 μL에 100 μM DPPH용액 2 mL를 첨가하여 암소에서 20분간 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도 를 측정했으며 대조구로는 ascorbic acid를 사용하였다.

DPPH 라디칼의 소거능은 다음의 식에 의하여 얻어진 결과 에서 산출하여 나타내었다.

DPPH radical scavenging activity (%)＝

Absorbancecontrol－Absorbancesample

Absorbancecontrol ×100

ABTS 라디칼 검정은 Re 등(1999)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 30 μL에 ABTS 라디칼 용액 3 mL를 첨가 하여 암소에서 6분간 반응시킨 후에 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구로는 ascorbic acid를 사용하였다.

ABTS 라디칼의 소거능은 다음의 식에 의하여 얻어진 결과 에서 산출하여 나타내었다.

ABTS radical cation scavenging activity (%)＝

Absorbance_control－Absorbance_sample Absorbance_control ×100

환원력은 Oyaizu(1986)의 방법을 이용하였다. 시료 1 mL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1%

K3Fe(CN)6 2.5 mL를 첨가하여 50°C에서 20분간 반응시켰 다. 이 반응액에 10% trichloroacetic acid 2.5 mL를 첨가 하여 원심분리(3,000 rpm, 10분)한 후에 상등액을 취하였 다. 이 상등액 5 mL에 증류수 5 mL와 0.1% FeCl₃ 1 mL를 첨가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구로는 ascorbic acid를 사용하였다. 환원력은 시료액 첨가구와 무

Fig. 1. Phylogenetic tree of the strains

Bootstrap values are expressed as per- centages of 1,000 replicates.

첨가구의 흡광도 차이로 나타내었다.

항비만 활성

Pancreatic lipase 저해 활성을 측정하기 위해 Decha- khamphu와 Wongchum(2015)의 방법을 본 실험 목적에 맞 춰 일부 변형하여 사용하였다. Pancreatic lipase(100 unit) 를 0.01 M MOPS buffer(pH 6.8, 10 mM MOPS, 1 mM EDTA)에 1 mg/mL 농도로 용해하여 효소액으로 사용하였 고, 기질용액은

p

p

p

p

Lipase inhibition activity (%)＝

Absorbancesample－Absorbanceblank

Absorbancenegative control－Absorbance_blank ×100

항균 활성

항균 활성은 Sohn 등(2008)의 방법을 이용하였다. 계대 배양된 각 식중독 유발 세균 1 백금이를 NB 10 mL에 접종 하여 진탕 배양(37°C, 200 rpm, 18시간)한 후 멸균된 면봉 을 사용하여 NA에 도말하였다. 각 균이 도말된 NA의 표면 에 6 mm paper disc(ADVANTEC, Tokyo, Japan)를 올려 놓고 그 위에 시료를 20 µL 점적하여 정치 배양(37°C, 18시 간)한 후 paper disc 주위로 형성된 clear zone을 측정하였

다. 항균 활성은 paper disc diameter당 clear zone diam- eter 비율로 산출하였다.

통계 분석

각 실험은 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 SPSS pack- age program(Version 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료 간의 유의성은

P

SFLAB의 이화학적 특성, 항산화, 항비만 및 항균 활성의 상 관성은 Pearson 상관분석을 이용한 이변량 상관분석(bivari- ate analysis)을 실시하여 비교하였다.

결과 및 고찰

유산균 동정 및 우수 유산균 선정

막걸리에서 분리한 5종 균주의 유전학적 안전성을 확인 하고자 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 동정한 결 과는 Fig. 1과 같다. 이들 균주는 유산균과 서열 일치도가 99% 이상으로 나타나서 이들을 막걸리에서 분리한 유산균 균주라는 의미로 LM

(Lactobacillus

Makgeoli

Lacto-

bacillus plantarum

Lactobacillus fer-

mentum

Lactobacillus para-

casei

Lactobacillus

plantarum

Lactobacillus paracasei

Lactobacillus fer-

mentum

Table 1. Fermentation characteristics of lactic acid bacteria in Sikhye

properties Strains Fermentation time (day)

0 2

pH

Control⁴⁾

Lactobacillus plantarum LM001 Lactobacillus plantarum LM002 Lactobacillus fermentum LM003 Lactobacillus paracasei LM004 Lactobacillus paracasei LM005 Lactobacillus plantarum SRCM101222 Lactobacillus rhamnosus GG

5.51±0.01^H1)2) 4.42±0.01^B 4.65±0.05^D 4.75±0.02^E 5.13±0.10^G 4.50±0.02^C 5.02±0.01^F 4.34±0.03^A

5.40±0.00^F 2.96±0.00^A 3.01±0.01^C 3.00±0.01^B 3.03±0.01^D 2.99±0.00^B 3.41±0.00^E 2.98±0.00^B

Total acidity (%)

Control

Lactobacillus plantarum LM001 Lactobacillus plantarum LM002 Lactobacillus fermentum LM003 Lactobacillus paracasei LM004 Lactobacillus paracasei LM005 Lactobacillus plantarum SRCM101222 Lactobacillus rhamnosus GG

0.01±0.00^A 0.04±0.01^C 0.03±0.01^C 0.02±0.01^B 0.01±0.00^A 0.04±0.00^C 0.02±0.00^B 0.04±0.01^C

0.01±0.01^A 0.45±0.01^G 0.31±0.00^C 0.27±0.01^B 0.34±0.00^D 0.31±0.01^C 0.40±0.01^E 0.43±0.01^F

Viable cell counts (log CFU/mL)

Control

Lactobacillus plantarum LM001 Lactobacillus plantarum LM002 Lactobacillus fermentum LM003 Lactobacillus paracasei LM004 Lactobacillus paracasei LM005 Lactobacillus plantarum SRCM101222 Lactobacillus rhamnosus GG

ND³⁾ 6.52±0.17^AB 6.35±0.19^AB 6.55±0.36^AB 6.13±0.10^A 6.54±0.06^AB 6.20±0.25^A 6.70±0.37^B

ND 8.47±0.41^BC 7.72±0.18^A 8.75±0.24^C 8.17±0.15^AB 8.24±0.41^B 8.15±0.13^AB 8.78±0.23^C

1)Values are mean±SD (n=3).

2)Different capital letters (A-H) in the same column indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

3)ND is an abbreviation for not detected.

4)Control is not added lactic acid bacteria in Sikhye.

그람 양성의 간균인

Lactobacillus

Lactobacillus

막걸리에서 분리한 유산균(

Lactobacillus

0.04%와 6.13~6.70 log CFU/mL이며, 발효 말기에는 con- trol이 0.01%와 불검출, 유산균 첨가구가 0.27~0.45%와 7.72~8.78 log CFU/mL로 나타나 유산균 첨가 및 발효로 인하여 총산도와 생균수가 증가하였는데, 이는 유산균 발효 쌀 음료가 젖산 발효가 진행되면서 pH는 감소하지만 총산도 와 생균수는 증가한다는 결과와 유사하였다(Kim 등, 2011).

이와 같은 현상은

Lactobacillus

Lactobacillus

Lactobacillus rhamnosus

~8.78 log CFU/mL로 나타나 5종의 유산균과 유사한 경향 을 나타내었다. 따라서 SFLAB 제조에 우수한 유산균주는 발효과정 중에 이상발효 없이 수용성 고형분에 함유된 탄소 원을 효율적으로 사용하여 목적성분인 lactic acid를 최대한 생성하는 균주이기 때문에 총산도 함량이 가장 높은

Lacto-

bacillus plantarum

Table 2. Fermentation characteristics of Sikhye fermented by Lactobacillus plantarum LM001

0 1 2

Soluble solids (°Brix) Reducing sugar (mg/mL) pH

Total acidity (%)

Viable cell counts (log CFU/mL) Total phenolic content (mg/mL)⁴⁾ Color³⁾ L^*

a^* b^*

11.30±0.01^c1)2) 89.11±1.07^c 4.54±0.03^c 0.01±0.00^a 6.33±0.08^a 0.68±0.01^c 26.79±0.43^b 2.12±0.23^a 3.22±0.24^a

10.22±0.02^b 75.06±0.74^b 3.01±0.02^b 0.42±0.01^b 8.30±0.05^b 0.65±0.00^b 23.27±0.52^a 2.01±0.24^a 5.30±0.28^b

9.38±0.02^a 68.39±2.23^a 2.80±0.01^a 0.52±0.01^c 8.43±0.03^c 0.64±0.01^a 23.84±0.03^a 2.06±0.09^a 5.40±0.03^b

1)Values are mean±SD (n=3).

2)Different small letters (a-c) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

3)L^*, a^* and b^* mean the degrees of lightness, redness, and yellowness, respectively.

4)Total phenolic content of malt extract solution is 1.26 mg/mL.

유산균 발효 식혜의 이화학적 특성

선정된 유산균(

Lactobacillus plantarum

mL로 52.00배와 1.33배 증가하였는데, 이는 우수 유산균 선정에서 분석한 이화학적 특성과 유사한 경향이었다. 한편 수용성 고형분과 환원당은 발효 초기 11.30°Brix와 89.11 mg/mL에서 발효 말기 9.38°Brix와 68.39 mg/mL로 1.20 배와 1.30배가 감소하였는데, 이는 유산균 발효 식혜가 젖산 발효 중 수용성 고형분과 환원당이 감소한다는 것과 유사하 였다(Shin 등, 2017). 유기산, 아미노산, 페놀성 화합물, es- sential oil 및 유리당 등의 다양한 성분으로 구성된 수용성 고형분 중에서 환원당이 73.20~78.76%를 차지하여 SFLAB 의 주성분은 유리당으로 나타났다(Son 등, 2011). TPC는 발효 초기 0.68 mg/mL에서 발효 말기 0.64 mg/mL로 1.06 배가 감소하였는데, 이는 백미로 제조한 식혜의 TPC가 1.03 mg/mL였으며 홍삼 추출물의 TPC가 젖산 발효 중 TPC 함량이 감소하였다는 보고와 유사한 경향이었다(Song 과 Hwang, 2016; Kang 등, 2013). SFLAB에 함유된 TPC 는 전분이 주성분인 쌀가루보다는 전분 당화를 위해 첨가한 엿기름 추출액의 TPC(1.26 mg/mL)에서 기원하며, 발효과 정 중 TPC 감소는 SFLAB와 ester 결합을 하는 TPC가 es- terase로 인해 유리되어 증가하는 양보다 발효과정 중에서 강한 환원성을 가진 TPC의 phenolic hydroxyl group의 일 부가 산화되어 감소하는 양이 많기 때문으로 판단된다(Oh 와 Lim, 2017; Park 등, 2017).

색도(L^*, a^* 및 b^*)는 각각 발효 초기 26.79, 2.12 및 3.22 에서 발효 말기 23.84, 2.06 및 5.40으로 발효과정 중 L^*은 1.12배 감소하였으나 b^*는 1.68배 증가하였는데, 이는 블루 베리 유산균 발효액이 발효과정 중 L^*은 감소하였으나 b^*는 증가한다는 경향과 유사하였다(Lee와 Hong, 2015). 이와

같은 결과는 식물체에 함유된 phenolic hydroxyl group의 수소 일부가 polyphenol oxidase에 의해 quinone으로 산화 된 후 중합과정을 거치면서 갈색 색소인 melanin이 생성되 기 때문에 L^*이 감소하고 b^*가 증가한 것으로 판단된다(Pa- ranjpe 등, 1978).

따라서 pH가 3.27~4.53, 생균수가 8.00 log CFU/mL 이 상으로 규정되어있는 상업적 요거트의 규격보다 발효 말기 SFLAB의 pH가 차이를 보일지라도 생균수가 법적 규격에 적합하여 선정된 유산균(

Lactobacillus plantarum

유산균 발효 식혜의 유기산 및 유리당 함량

선정된 유산균(

Lactobacillus plantarum

%를 차지한 주요 유기산으로 발효 초기보다 발효말기에 6.65배가 증가하였는데, 이는 현미 요거트의 주된 유기산인 lactic acid가 요거트의 제조과정 중 증가하였다는 보고와 유사하였다(Hong과 Ko, 1991). Oxalic acid와 pyrogluta- mic acid는 발효 초기(11.60 mg%, 28.97 mg%)보다 발효 말기에 각각 2.85배와 1.28배가 감소하였으나 lactic acid 는 발효 초기(144.66 mg%)보다 발효 말기에 6.64배가 증가 하여 발효과정 중 SFLAB의 총 유기산 증가의 주된 원인으 로 나타났다. SFLAB에서 acetic acid가 불검출된 것으로 미루어보아 본 연구에 사용된 유산균(

Lactobacillus plan-

tarum

Table 4. Antioxidant activities and antiobesity activity of Sikhye fermented by Lactobacillus plantarum LM001

Component Fermentation time (day)

0 1 2

Antioxidant activity³⁾

DPPH radical assay (%) ABTS radical assay (%) Reducing power

66.90±0.71^b1)2) 46.09±0.14^c 0.46±0.01^c

60.19±1.23^a 42.39±0.51^b 0.43±0.01^b

58.65±0.45^a 39.57±0.72^a 0.39±0.01^a Antiobesity activity Lipase inhibit activity (%) 0.71±0.31^a 56.69±2.58^b 60.61±2.30^b

1)Values are mean±SD (n=3).

2)Different small letters (a-c) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

3)Comparison is 0.01% (w/v) ascorbic acid for DPPH radical assay (100%), ABTS radical assay (100%) and reducing power (1.26).

Table 3. Organic acid and free sugar content of Sikhye fermented by Lactobacillus plantarum LM001

Component Fermentation time (day)

0 1 2

Organic acid (mg%)

Oxalic acid Lactic acid Pyroglutamic acid Total organic acids

11.60±0.97^c1)2) 144.66±4.22^a 28.97±0.48^b 185.23±2.89^a

7.31±0.51^b 755.54±9.06^b 28.62±0.18^b 791.47±9.20^b

4.07±1.05^a 961.63±5.74^c 22.60±0.27^a 988.31±6.33^c

Free sugar content (mg%)

Maltose Glucose Fructose

Total free sugar contents

8,504.01±153.68^c 992.85±19.13^c 188.67±7.34^b 9,685.52±177.55^c

8,230.88±30.45^b 626.55±7.44^b 28.24±3.32^a 8,885.67±36.25^b

6,503.92±40.77^a 205.91±5.22^a

ND³⁾ 6,719.33±45.85^a

1)Values are mean±SD (n=3).

2)Different small letters (a-c) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

3)ND is an abbreviation for not detected.

등, 2004).

SFLAB의 유리당 조성은 maltose, glucose, fructose 등 3종이 검출되었다. 주요 유리당은 총 유리당(6,719.33~

9,685.52 mg%)의 87.80~96.79%를 차지한 maltose로 나 타났으며, 발효 초기보다 발효 말기에 1.31배가 감소하였고 glucose도 이와 유사한 경향이었다. 이는 감자 주스의 젖산 발효가 진행될수록 maltose와 glucose가 감소하여 lactic acid가 증가한다는 보고와 유사하였다(Kim과 Yoon, 2013).

한편 fructose는 발효 초기 188.67 mg%로 소량이 검출되 었는데 이마저도 젖산 발효 중 소모되어 발효 말기에는 불검 출되었다. 이는 유산균이 lactose와 maltose 같은 이당류보 다는 glucose, fructose 등과 같은 단당류를 우선적으로 소 모하지만, 경우에 따라서는 α-amylase를 생성하여 mal- tose를 glucose로 분해하여 lactic acid를 생성하기 때문으 로 알려져 있다(Amapu 등, 2016).

유산균 발효 식혜의 기능성 평가

선정된 유산균(

Lactobacillus plantarum

66.90%, 46.09~39.57% 및 0.39~0.46으로 발효 초기보다 발효 말기에 각각 1.4배, 1.2배 및 1.2배 감소하였는데, 이는 버섯 유산균 발효액이 발효과정 중 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거능이 감소하였다는 보고와 유사하였다(Yang 등,

2014). 이와 같은 결과는 SFLAB에 함유된 TPC의 phe- nolic hydroxyl group의 일부가 발효과정 중 산화되어 DPPH 라디칼이나 ABTS 라디칼에 전자를 제공하여 이들을 소거하는 환원력이 감소하기 때문이다(Kaur와 Kapoor, 2002; Machowetz 등, 2007).

SFLAB의 lipase 저해 활성은 발효 초기 0.71%에서 발효 말기 60.61%로 85배가 증가하였다. 이는 꾸지뽕 유산균 발 효물과 여주 유산균 발효음료가 발효 후에 lipase 저해 활성 이 증가한다는 경향과 유사하였는데, 꾸지뽕, 여주 등과 같 은 식물의 젖산 발효 중 생성되는 lactic acid, acetic acid, esterase 등과 같은 유용성분에 의한 것으로 알려져 있다 (Lee 등, 2014; Park 등, 2017; Behera 등, 2018). 또한 유산균이 생성하는 lactic acid와 같은 유용성분들이 지방세 포의 수를 조절하거나 지방 축적량을 감소시키는 등 지방 분화 과정을 지연시킨 것으로 알려져 있기 때문에 SFLAB의 lipase 저해 활성의 주요 원인은 lactic acid로 판단된다 (Kadooka 등, 2010; Takemura 등, 2010). 따라서 SFLAB 는 lipase의 활성을 저해시켜 지방 분해산물 중에 하나인 지방산이 체내로 흡수되어 중성지방으로 재합성될 가능성 을 감소시키는 항비만 활성이 있는 것으로 판단된다(Lee 등, 2019).

선정된 유산균(

Lactobacillus plantarum

E. coli

Table 5. Antimicrobial activities of Sikhye fermented by Lactobacillus plantarum LM001

Clear zone diameter ratio¹⁾ value Fermentation time (day)

0 1 2

Bacillus cereus (KACC 10097) Bacillus cereus (KACC 13064) Bacillus cereus (KACC 13066) Escherichia coli (KACC 10115)

1.00±0.00^a2)3) 1.00±0.00^a 1.00±0.00^a 1.00±0.00^a

1.47±0.01^b 1.58±0.00^b 1.50±0.02^b 1.00±0.00^a

1.75±0.02^c 1.80±0.01^c 1.62±0.02^c 1.00±0.00^a

1)Clear zone diameter ratio value is expressed as clear zone diameter (mm)/ paper disc diameter (mm).

2)Values are mean±SD (n=3).

3)Different small letters (a-c) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

가 나타나지 않았던 반면에

Bacillus cereus

이는 감귤과 동치미 유산균 발효액이

Bacillus

B

cereus

S. aureus

E

coli

유산균 발효 식혜의 이화학적 특성 및 기능성의 상관성 비교

Lactobacillus plantarum

P

검정 및 환원력)에서는 각각 0.944, 0.989 및 0.971의 양의 상관성을, 항비만 및 항균 활성(

B

cereus

B

cereus

B

cereus

본 연구를 통해서 SFLAB에 함유된 기능성 성분으로 판 단한 lactic acid와 TPC를 중심으로 살펴본 기능성의 상관 성은 lactic acid가 항산화 활성에서 DPPH 라디칼 검정, ABTS 라디칼 검정 및 환원력이 각각 -0.980, -0.969 및 -0.931의 상관성을, 항비만 활성에서 0.981, 항균 활성에서

B

cereus

B

cereus

B

cereus

B

cereus

B

cereus

B

cereus

요 약

본 연구에서는 국내산 쌀의 활용도를 높이고자 국내산 막걸리 에서 분리한 유산균을 활용하여 유산균 발효 식혜(SFLAB) 를 제조했으며, 그에 따른 이화학적 특성 및 기능성을 평가 하였다. 쌀막걸리에서 분리한 5종의 유산균 중에서 식혜를 기질로 하는 젖산 발효에 적합한 유산균으로 총산도 함량이 가장 높은

Lactobacillus plantarum

89.11 mg/mL, 2.80~4.54, 0.01~0.52%, 6.33~8.43 log CFU/mL 및 0.64~0.68 mg/mL였으며, 젖산 발효가 진행됨 에 따라 수용성 고형분, 환원당, pH 및 TPC는 감소하였으나

총산도와 생균수는 증가하였다. SFLAB의 유기산은 oxalic acid, lactic acid, pyroglutamic acid 3종이 검출되었고 lactic acid가 총 유기산(185.23~988.31 mg%)의 78.10~

97.30%를 함유하여 주요 유기산으로 나타났으며, 유리당은 총 유리당(6,719.33~9,685.52 mg%)의 87.80~96.79%를 함유한 maltose가 주요 유리당으로 나타났다. 항산화 활성 (DPPH 라디칼 소거 활성, ABTS 라디칼 소거 활성 및 환원 력)은 각각 58.65~66.90%, 46.09~39.57% 및 0.39~0.46 으로 젖산 발효가 진행됨에 따라 각각 1.4배, 1.2배 및 1.2배 가 감소하였으나, lipase 저해 활성은 0.71~60.61%로 85배 증가하였다. 항균 활성은

Bacillus cereus

결과적으로 SFLAB의 항산화 활성은 감소했을지라도 항비 만과 항균 활성이 증가하였기에 새로운 형태의 기능성 강화 식품으로서의 가능성이 있다고 판단된다.

감사의 글

본 논문은 농림축산식품부 향토산업 육성사업(과제명: 친환 경 쌀 융복합 고부가 제품개발, MIFI 2019-1)의 연구비 지 원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.

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