대장암 세포주에 대한 지부자() 추출물의 세포독성 및 Apoptosis 활성

PREVENTION RESEARCH □ ORIGINAL ARTICLE □

132 책임저자：박해룡, 󰂕 631-701, 마산시 월영동 449번지

경남대학교 식품생명학과

Tel: 055-249-2689, Fax: 055-249-2995 E-mail: [email protected]

접수일：2009년 4월 22일, 게재승인일：2009년 5월 13일

Correspondence to：Hae-Ryong Park

Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, 449, Wolyoung-dong, Masan 631-701, Korea

Tel: ＋82-55-249-2689, Fax: ＋82-55-249-2995 E-mail: [email protected]

대장암 세포주에 대한 지부자(

Kochiae fructus

경남대학교 식품생명학과

이정민ㆍ손은순ㆍ김지현ㆍ김현정ㆍ박해룡

Cytotoxic and Apoptotic Activity of Kochiae fructus Extracts on Human Colon Cancer Cell Lines

Jeung-Min Lee, Eun-Soon Son, Ji-Hyun Kim, Hyun-Jung Kim and Hae-Ryong Park Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, Masan 631-701, Korea

Natural products are widely used in pharmacological applications, due to their potential biological activities. Therefore, we established a screening of natural products as anticancer agents utilizing HT-29 human colon cancer cells. During the course of screening for anticancer agents, we have found a methanolic extracts of Kochiae fructus (KFM) from natural and it induced cytotoxicity and apoptosis in HT-29 cells. The KFM showed highly cytotoxic effects via the MTT reduction assay, LDH release assay, and colony formation assay. As expected, we also detected apoptotic bodies on Hoechst staining. To examine the functions on apoptosis, we used a flow cytometric analysis. The apoptotic cells were distributed according to the cell cycle phase shown by sub-G1 DNA content. These results indicate that KFM may contains bioactive materials and it could be a potential candidates as cancer chemotherapeutic against human colon cancer cells. (Cancer Prev Res 14, 132-139, 2009)

Key Words: Natural products, HT-29 cells, Kochiae fructus, Cytotoxicity, Apoptosis

서 론

1980년대 이후 급속한 경제발전으로 인한 생활수준의 향상에 따라 식습관이 점점 서구화 되어가면서 전염성 질병이나 영양부족 관련 질병보다는 만성 퇴행성 질환 이 크게 증가하고 있다.¹⁾ 대표적인 질병으로는 암과 비 만, 당뇨병 등이 있으며, 그 중 현재 급속도로 증가하고 있는 질병이 암이다.^2∼4) 이러한 암을 치료하기 위해서 수술요법, 화학요법, 방사선요법 등이 행해지고 있지만, 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 독성을 주어 조혈기능 억제, 메스꺼움 및 구토, 점막 궤양, 탈모증 등 많은 부작

용을 초래하고 있다.^5∼7) 이런 부작용을 개선하기 위해 수술요법과 화학요법, 화학요법과 방사선요법, 수술요 법과 방사선요법 등 두 가지 요법을 병행하는 방법을 이 용하거나, 화학요법에 천연물을 첨가하여 병행하는 치 료방법을 사용하여 서로 상호작용을 가져와 많은 우수 성이 보고되고 있으나 이러한 방법 또한 부작용이 나타 난다는 보고가 있다.^8∼11) 현재 암 치료법 연구는 암세포 의 기전연구를 통해 새로운 항암물질을 개발하려는 방 법과 천연물의 추출물로부터 항암활성물질을 개발하려 는 추세이다.^12∼15) 천연물을 이용하는 항암연구의 내용 을 보면 암세포에만 세포독성을 나타내며, 관련 기전 연 구를 통해 새로운 항암물질의 가능성을 보고하고 있

다.^16∼18)

특히, 암 중에서 대장암은 맹장, 결장, 직장에 생기는 악성 종양으로써 대장의 확장성으로 인하여 조기 발견 이 어려운 암 중의 하나이며, 혈관을 중심으로 많은 세포 들이 덩어리진 형태로 성장하여 중심 부위까지 약물이 투과하지 못하기 때문에 완전히 치료되기 어려운 질병

이다.^19,20) 이러한 대장암을 치료하기 위해서는 부작용이

없으면서 암세포의 중심부까지 항암활성 효과가 있는 새로운 항암제의 개발이라 할 수 있다. 항암활성물질 연 구의 중요한 부분은 정상세포에는 영향이 없으면서 암 세포에만 선택적인 세포독성을 나타내는 새로운 물질을 찾는 것이라 할 수 있으며 현재 다방면에서 이러한 연구 가 이루어지고 있다.^21,22)

본 연구팀에서는 국내ㆍ외에서 자생하고 있는 약용 식물을 대상으로 인간 대장암 세포주의 성장을 효과적 으로 저해하는 천연 추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결 과 지부자(Kochiae fructus) 추출물로부터 대장암 세포주에 대해서 강력한 세포독성과 apoptosis를 유도 하는 활성을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된 지부자는 명주과에 속한 댑싸리의 성숙한 과실을 건조한 것으로 우리나라 전국 각지에서 재배되고 있다. 형태는 편구상 5각의 별 모양으로 지름 1∼3 mm이다.²³⁾ 바깥 면은 회녹색 또는 엷은 갈색으로 주위에 작은 막의 깃이 5개 붙어 있다.²⁴⁾ 등 쪽의 중심에는 작은 돌기와 과경의 자국이 있고 방사 상의 능선이 5∼10개 있으며 과피를 벗기면 편란형의 흑 색 씨가 들어 있다.²⁵⁾ 성분으로는 triterpenoid saponin, 정 유 등을 함유하고 있으며 약리 작용으로는 항알레르기, 항염증, 항통증, 항가려움증 등이 연구 되어 있다.²⁶⁾ 한의 학적으로는 방광에 작용하여 습기와 열을 소변으로 배 출시키고, 고환염과 열로 부은 증상에 사용한다. 임질, 대하, 소양증, 습진 등을 다스리며 습열로 인한 피부질환 에 응용된다고 알려져 있지만, 지부자의 항암활성에 관 련된 생리활성물질의 연구는 아직 초보적인 단계에 불 과하다.

따라서 본 연구에서는 천연자원으로부터 항암활성을 가지는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 지부자 추출물 을 이용하여 대장암 세포주에 대한 선택적인 항암활성 효과를 밝히고자 하였다.

재료 및 방법 1. 시약 및 실험 재료

본 실험에 사용한 지부자는 2009년 2월 경남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출하여 실험에 사용

하였다. 대장암 세포주 배양을 위해 필요한 RPMI1640 medium, fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고, 암세포의 세포독성 효과를 실험하기 위한 시약으로 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co. (St Louis, Mo, USA)로부터 구입하였으며, LDH (lactate dehydrogenase) release assay kit 는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부 터 구입하였다. 그 외의 연구에 사용된 여러 가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

2. 추출물 제조

지부자 5 g에 methanol, ethanol, acetone 용매를 각각 100 ml씩 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출 한 후, 여과지(Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하였다. 여과된 추 출여액은 회전감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용 하여 40°C에서 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻었다.

3. 암세포주의 배양

본 실험에 사용된 인간 대장암 유래의 세포주 HT-29 와 SW620은 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 분양 받아 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 medium에 10% fetal bovine serum (FBS) 및 100 unit/ml의 penicillin, 100 μg/ml의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습 도가 유지되는 37°C, 5% CO2 incubator (MOC-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

4. 암세포의 형태학적 변화 관찰

지부자 methanol 추출물에 대한 HT-29 세포주의 형태 학적인 변화를 관찰하기 위해 6 well plate에 2⨉10⁵ cells/well로 2 ml씩 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 각각 50, 100, 250μg/ml의 농도로 추출물을 24시간 처리한 후, phase contrast microscope (Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 변화된 HT-29 세포주의 형태학적 특징을 관찰하고 100 배로 사진 촬영하였다.

5. MTT reduction assay

지부자 추출물의 세포생존율을 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 1⨉10⁵ cells/ml로 맞추고 96 well plate에 각각 100μl씩 첨가하여 24시간 동 안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 지부자 추출물 을 각각 50, 100, 250μg/ml의 농도로 제조하여 암 세포주 에 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완 충용액에 녹인 MTT (5 mg/ml) 용액을 10μl씩 첨가하여

다시 1시간 동안 배양하였다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, 100μl의 DMSO를 첨가한 후 ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 지부자 추출물을 처리하 지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포생존율로 나타내었다.

6. LDH release assay

지부자 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 LDH release assay를 실시하였다. 세포주를 1⨉10⁵ cells/ml로 맞 춘 후, 100μl씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에 서 24시간 배양한 뒤, 50, 100, 250μg/ml의 농도로 제조한 지부자 추출물을 세포주에 처리하였다. 다시 24시간 동 안 배양한 후, 배양액을 새로운 96-well plate에 50μl 분주 하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50μl씩 첨가하여 상온 에서 정치시킨 후, 20분간 반응하였다. 반응이 완료되면 stop solution인 1 N HCl을 100μl씩 첨가하여 반응을 중지 시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액 을 제거한 후, 0.5% Triton X-100용액을 50μl씩 첨가하여 10분 동안 shaking시켜 세포벽을 깨뜨린 다음, 같은 방법 으로 LDH reagent를 50μl씩 첨가하여 반응 시키고, 반응 이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 대한 세포독성의 백분율은 배양액 과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으 로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 지부자 추출물 을 처리하지 않은 대조군과의 값을 비교하여 나타내었 다.

7. Colony formation assay

지부자 추출물의 세포생존율을 측정하기 위하여 colo- ny formation assay를 실시하였다. 6 well plate에 5⨉10⁴ cell/ml로 plating하여 배양시킨 후 지부자 추출물 50, 100, 250μg/ml의 농도로 처리하고 다시 24시간 반응시킨 후 새로운 배지로 희석하여 6 well plate에 1⨉10³ cell/ml이 되도록 replating하여 7∼8일 동안 37°C, 5% CO2 incubator 에서 배양하였다. 형성된 colony는 10% formalin로 고정하 고, 0.01% crystal violet으로 염색하여 counting 하였다. 세 포생존율은 지부자 추출물을 처리하지 않은 대조군 값 을 100%로 두고 계산하였다.

8. Hoechst 33342 staining

지부자 추출물의 apoptotic body를 측정하기 위하여 세 포주를 Hoechst 33342 (Sigma, Mo, USA)로 염색하였다.

6-well plate에 2⨉10⁵ cells/well로 24시간 동안 배양하여 지 부자 추출물 50, 100, 250μg/ml 농도로 처리한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% formalin으로 고정한 후, Hoechst 33342 (10μM)로 염색하여 형광현미경 하에서 400배로 관찰하였다.

9. Flow cytometric analysis

지부자 추출물의 apoptotic cell을 측정하기 위하여 flow cytometer로 세포주기를 측정하였다. HT-29 세포를 6 cm dish에 1⨉10⁵ cell/dish로 세포를 분주 하여 24 시간 배양 한 후, 지부자 추출물을 50, 100μg/ml의 농도로 처리하였 다. 세포를 24시간 배양시키고, 부유 세포 및 trypsin 처리 한 세포들을 모아서 4°C, 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 를 한 후, ethanol 1 ml을 넣고 4°C에서 세포를 고정시켰 다. 4°C에서 2,000 rpm으로 2분간 원심분리 하고 PBS 용 액으로 수세한 후, propidium iodide/RNase staining buffer (BD pharmingen^TM)을 500μg/ml 첨가하고, 어두운 상온에 서 30분간 staining 한 후, flow cytometry caliber (Beckman coulter epics XL)를 이용하여 세포주기를 분석하였다.

10. 통계처리

모든 자료처리는 SPSS-PC＋ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차 (SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하 고 Scheffe’s test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가 하였다.

결과 및 고찰

1. 대장암 세포주 HT-29에 대한 지부자 추출물의 세 포독성 효과

대장암 유래의 세포주인 HT-29에 대한 지부자 추출물 의 세포독성을 확인한 결과는 다음과 같다. 각 용매별 지 부자 추출물을 50, 100, 250μg/ml의 농도로 HT-29 세포주 에 처리하고, MTT reduction assay 방법을 통하여 추출물 을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 암세포 성장 억제 효과를 확인하였다. Methanol 추출물의 경우 50μg/ml 농 도에서 78.7% 생존율을 보였으며 250μg/ml 농도에서는 13.0%로 가장 강한 항암활성을 나타내었다(Fig. 1A).

Ethanol과 acetone 추출물을 50μg/ml의 농도로 처리 했을 때 각각 80.6%, 79.8%로 약한 활성을 보였지만, 250μg/ml 로 처리하였을 때에는 각각 59.5%, 56.9%로 활성이 증가

Fig. 1. Cytotoxic effect of extracts from Kochiae fructus (KF) against HT-29 human colon cancer cells. The cells were treated with various concentrations of KF extracts (A: methanol ex- tracts, B: ethanol extracts, C: acetone extracts). After MTT as- say, the MTT reduction rate (means±S.D. of triplicate dete- rmination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of KF extracts. *significant vs. control of un- treated cells (p＜0.001).

Fig. 2. Cytotoxic effect of methanolic extracts of KF (KFM) in HT-29 cells. The cells were exposed to the various concentrations of KFM for 24 h. Cell viability was measured with the LDH release assay (A). As the results of LDH release assay (mean±S.D.

of triplicate determination), data were normalized to the activity of LDH released from vehicle-treated cells (100%) and expressed as percentage of the control. *significant vs. control of untreated cells (p＜0.001). Morphological changes were monitored for 24 h (B) (a: control, b: 50μg/ml, c: 100μg/ml, d: 250μg/ml). The photographs were taken with a phase-contrast microscope at 100⨉ magnification. The results are representative of at least two independent experiments.

Fig. 3. KFM-induced cytotoxicity in HT-29 cells. The cells were exposed to the 50μg/ml of KFM for 24 h. After colony for- mation, the survival rate (mean±S.D. of triplicate determi- nations) was calculated by setting each of the control survival rates. After 7∼8 days, the formed colonies were fixed with 10% formaldehyde, stained with 0.01% crystal violet, and counted. *significant vs. control of untreated cells (p＜0.001).

Fig. 4. Analysis of apoptotic body of KFM on HT-29 cells. The cells were treated with various concentrations of KFM for 24 h (A: control, B: 50μg/ml, C: 100μg/ml, D: 250μg/ml). Fixed cells were stained with Hoechst 33342 (10μM) and examined by fluorescence microcopy at 400⨉ magnification. The arrow indicates the apoptotic cell. The results are representative of at least two independent experiments.

하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 1B, C). 또한, 지부자 methanol 추출물의 세포독성 효과를 확인하기 위하여 배양액 중 들어있는 LDH (lactate dehydrogenase)의 방출량을 측정하 였다. Fig. 2A와 같이 지부자 methanol 추출물의 농도가 증가 할수록 LDH의 방출량은 증가 하였으며 250μg/ml의 농도에서 control과 비교했을 때 두 배 이상 증가 하였다.

다음으로 HT-29 세포주에 대한 형태학적 변화를 알아 보기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 대 조군의 암세포는 조밀하고, 정상적으로 성장하는데 반 해 지부자 methanol 추출물이 처리된 세포주는 세포의 수가 적을 뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있고, 불규칙 적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것을 알 수 있 었다. 세포독성 효과를 좀 더 정확하게 알아보기 위해 지부자 methanol 추출물을 HT-29 세포주에 처리하여 colony formation assay를 실시하였다(Fig. 3). HT-29 세포주 에 지부자 methanol 추출물을 50, 100, 250μg/ml의 농도 로 처리한 결과 50μg/ml에서 20% 정도의 세포생존율을 보였으며 100, 250μg/ml의 농도에서는 colony를 생성하 지 않았다. 이상의 결과로부터 지부자 methanol 추출물이 HT-29 세포주에 대해서 강력한 항암활성 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

2. 지부자 methanol 추출물의 apoptosis 유도 효과

Apoptosis는 다세포 생물에서의 programmed cell death를 일컫는 용어로 세포의 죽음에 관련되어 능동적으로 일

어나는 세포의 죽음 과정 중 하나이다. Apoptosis가 일어 나면 세포는 면역반응을 일으켜, 핵의 condensation 및 DNA가 일정한 크기로 조각나는 형상을 비롯하여 세포 질 속 세포소기관 및 세포막 등에서의 변화가 발생하여 세포가 사멸하게 되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 암세포들은 이러한 apoptosis 경로가 불활성화 되어져 계 속해서 증식하게 되는 것이다. 본 논문에서는 지부자 methanol 추출물이 가지는 세포독성 효과의 기전연구를 위해 HT-29 세포주의 apoptosis 활성 여부를 확인하였다.

Apoptosis의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관 찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다(Fig. 4). 그 결과 대조군은 타원형 의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면 250μg/ml의 지부자 methanol 추출물을 처리한 경우에는 apoptotic body가 핵 주변에 나타나 세포사멸에 영향을 미치는 것을 알 수 있 었다.

다음은 flow cytometry를 이용하여 세포주기를 분석하 였다(Table 1). Apoptotic cell을 나타내는 sub-G1기의 세포 수는 증가 하였으며 지부자 methanol 추출물 100μg/ml의 농도에서 10% 정도의 apoptotic cell을 확인할 수 있었다.

이 결과는 지부자 methanol 추출물이 HT-29 세포주에 대 해서 강력하게 apoptosis를 유도하여 항암활성을 나타낸 다는 것을 의미하는 결과라고 할 수 있다.

Fig. 5. Cytotoxic effect of KFM on SW620 human colon cancer cells. The cells were treated with various concentrations (50, 100, 250μg/ml) of KFM for 24 h. Cytotoxicity was measured with the MTT reduction assay (A) and LDH release assay (B), respectively. After MTT assay, the MTT reduction rate (mean±S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of KFM. As the results of LDH release assay (mean±S.D. of triplicate determination), data were normalized to the activity of LDH released from vehicle-treated cells (100%) and expressed as percentage of the control.

*significant vs. control of untreated cells (p＜0.001).

Table 1. Apoptosis effect of KFM on flow cytometric analysis in HT-29 cells

Sample Concentration (μg/ml) Apoptotic cells (%) Control

KFM

- 50 100

0.45±0.11 1.5±0.28 6.2±0.96 A flow cytometric analysis of HT-29 cells at the indicated concentration of KFM was conducted after the cells had been incubated for 24 h. The cell cycle distribution was determined by a flow cytometric analysis of the DNA content after staining with propidium iodide. Data (mean±S.D. of triplicate determi- nations) are representatives of at least three independent experiments.

3. 대장암 세포주 SW620 세포에 대한 지부자 me- thanol 추출물의 세포독성 효과

지부자 methanol 추출물이 다른 대장암 세포주에도 영 향을 주는지를 확인하기 위해 SW620 세포주를 이용하 여 MTT reduction assay와 LDH release assay 실험을 하였다.

지부자 methanol 추출물을 50, 100, 250μg/ml의 농도로 처리하여 control과 비교하였다. MTT reduction assay에서 는 50, 100μg/ml에서 89.7%, 79.4%로 미약하게 활성이 보였지만, 250μg/ml에서는 9.2%로 확연히 높은 세포독 성 효과를 보였다(Fig. 5A). LDH release assay에서도 50, 100μg/ml에서 24.3%, 30.8%로 control과 비슷한 활성을

보였지만, 250μg/ml에서는 73.9%로 높은 항암활성을 보 였다(Fig. 5B).

이상의 결과로부터 지부자 methanol 추출물은 HT-29 세포주와는 다른 인간 유래의 대장암 세포주 SW620에 서도 강력한 항암활성 효과가 있다는 것을 확인할 수 있 었다.

결 론

본 연구는 지부자(Kochiae fructus) 추출물의 항암활성 효 과와 작용기전을 확인하기 위한 연구로서 지부자 추출 물을 이용하였다. 먼저 인간 대장암 유래의 세포주인 HT-29에 지부자 추출물을 농도별로 처리하여 여러 가지 세포생물학적인 assay 방법을 이용하여 항암활성을 확인 하였다. 그 결과 지부자 methanol 추출물에서 가장 강력 한 항암활성을 확인할 수 있었다. 그리고 HT-29 세포주 의 형태학적 변화를 관찰한 결과도 지부자 methanol 추 출물을 처리한 세포들은 control에 비해 암세포의 응축 및 형태학적 변화가 두드러지게 나타났다. 특히, 지부자 methanol 추출물 100μg/ml 이상의 농도에서는 colony 형 성이 안 될 정도의 강력한 항암활성을 나타내었다. Hoe- chst 33342 staining을 통하여 HT-29 세포주의 apoptotic bo- dy를 확인할 수 있었으며, flow cytometric analysis를 통하 여 sub-G1기의 apoptotic cell이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 다른 대장암 세포주인 SW620에 대해서도

높은 항암활성을 나타내고 있음을 MTT reduction assay와 LDH release assay를 통하여 확인할 수 있었다. 이상의 결 과로부터 지부자가 인간 대장암 치료에 효과적인 항암 활성 소재로 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.

감사의 글

이 연구결과물은 2009학년도 경남대학교 학술연구장 려금지원에 의한 것임.

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