tuberculosis및 Mycobacterium bovis를 同定하기 寫한 親究

대 한임 상영 리 사회 지 : 제 7 권 제 1 호 197s:.

p-nitrobenzoic

Mycobacterium

tuberculosis및 Mycobacterium bovis를 同定하기 寫한 親究

= Abstract=

대구보건전문학교 임상병러과

李 建 燮

A diagnostic aid in distinguishing Mycobacterium tuberculosis from other of mycobacterium

Gun Sup

,

Taegu Health Junior College

An attempt was made to distinguish Mycobacterium tuberculosis and M. bovis from other mycobacterial species, by demonstrating cord-formatlon of mycobacteria, particularly tubercle bacilli, which are frequently encountered in diagnostic laboratories.

A total of 71 sputum specimens with positive results and 75 strains of mycobacteria were employed for _the purpose applied combine with Tsukamuras and Stritch-Dickinsons method.

Blood media were prepared two ways which with the incorporation of p-nitrobenzoic acid (PNB, 500μg per ml) and without PNB. Sputums mears, which were allowed to dry thorou- ghly, treated wÍth 1N HCl and washed in sterile distilled water. Then the sputum smears were submerged in to the medla both PNB added and without PNB respectlvely.

After incubation at 37⁰C for a week, the slides were removed out from the tube, then rinsed by distilled water and dried on hot plate for 30 minutes, and stalned with Ziehl-Neelesens or fluorochrome dyes.

Upon examinlng them by ordlnary optical mlcroscope, growing bacteria were confirmed fir- stly and the development of cord-formation secondary.

To make sure of the dlfferentiation, the sputa were simultaneously decondaminated, inocula- ted and incubated at 37⁰C until the growth is seen. The cultures were then examined for niacin production in order to identify M. tuberculosis.

As seen in table 1, both results obtained in this study appear to be identical in discriminat- ing Mycobacterium tuberculosis and M. bovis from other mycobacterial species.

In conclusion, the blood medium containing p-nitrobenzoic acid can be readily used as a diagnostic aid.

績 論

結核의 原因園언 A型結核園 (Mycobacterium tube- rculosis) 또는 牛型結核園(Mycobacterium bovis) 을

Mycobacterium파 藍別하는 方法은 여 러 가지 가 昭究 發表되어 있다.

(Konno Niacin test 19568), Runyon E. H Niacin^‘ test 1959³\ Kubica Catalase test 1960⁴\ 1965⁵) Mid- dlebrook 1954, Virtanens 196912) ... 둥)

._ 1 9 -

各種可檢物로 부터 分離培養된 Mycobacteri um은 園 -集落의 著色과 形態 그러 고 發育速度 둥으로 人型結核

園을 Scotochromogen 및 Rapid grower와 區別하고 그러 고 Photochromogen과는 光發色性 驗試으로 區別 하게 된다.

-般的으로 人型 및 牛型結核園을 他 (Non chrom- ogen) 과 鍵別하는데 있어저는 園索形成 (cord-formati­

-on) 與否를 觀察하고 人型파 牛型의 區別은 Niacin test 로한다.

그러 나 人型 빛 牛型 結核園을 他抗醒과 鍵別하는데 는 긴 時間을 要할 뿐 아니라 복장한 처리파정을 거치 게 된다. 그러므로 短時間內에 간단한 方法으로 鍵別 할 수 있 는 方法을 찾고저 Hedgecock외- Faucher (19 '65)2), Stritch와 Dickison (1958) ¹⁰⁾ Tsukamura (1970

'11)) (1972)7)의 方法을 응용하여 本 實驗을 實雄하였다.

材팎 및 方法

음 살온에 셔 냉 각한 후 이 基被에 全 m、J被 (Wholeegg) 200mI, gIycer in 6mI, 2% malachite green수용액 6mI을 加해 충푼히 혼합한후 5-6mI썩 Screw cap 멸 균시 험 판에 분주， 사면으로 하여 85⁰-90⁰C에 서 60분 간 응고 멸균한다음 使用했다.

4) Lowenstein -J ensen培地

Mono potassium phosphate 2. 4gm., magnesium sulfate O. 24gm., magnesium citrate O. 6gm., Aspa- ragin 3. 6gm., Glycerin 12mI 에 증류수 600mI加하여 100⁰C에서 30분간 끓인다음 질온에셔 냉각한후全꽤滾 1 ， 000mI와 2% malachitegreen 수용액 20mI을 加하고 충분히 혼합한후 멸균된 Screw-captube 에 5-6mI씩 분주시켜 사면으로 하여 85⁰-90⁰C에서 60분간 응고

별균하여 使用했다.

B. 梁 色

園의 檢鏡을 찮하여 波色에는 ZiehI-NeeIsen 民 梁色 滅을 준비하고， 배양을 하커위한 천처치로 1NHCl， 4%

NaOH용액을 준비해셔 園集落 鍵別을 위해 Niacin

1. 材 料 test에 利用되 는 reagent을 만든다.

본 살험을 하커위하여 본 질험설에 보존되어 있는 c. 培훌方法 M. bovis (BCG). M. smegmatis의 균주와 환자의 객 담

’에서 채취한 M. tuberculosis를 사용하였다.

객 담을 받는 方法은 保健所와 病院에 등갖察받으려 온 뿔、者로 부터 그 자리에저 담을 採取하는 직석 채담뱀 파 맘통을 가지고 집에가셔 아침에 얼어나저 24時間동 안T놓아서 받아오게하는 在家채 맘뱀으로 커도나 기판 지 또는 후두속에셔 나오는 객담(불벼물)을 채취하여 사용하였다.

2. 方 法

A. 培地의 種類

1) 血波培地의 製調

ACD 용액 25mI (tri-sodium citrate 13. 2gm., citr- Îc acid 4.8gm.. dextrose 14. 7gm.^, 주사용 증류수

1,000ml 加하여 용해 함) 에 血滾 100mI가 되 도록 뽑은 Human blood 50mI와 별균증류수 50ml를 同量 加하 여 만들었다.

2) PNB培地의 製調(P-nitrobenzoic acid培地) PNB 500mg을 화학천평 으로 달아 증류수 10mI 에 용 해 할혜 10% NaOH 2mI을 加한후 pH 7.0 이 되 도록 中和시 키 커 위 해 10% HCI을 加하고 20mI가 되 도록 증류수를 加하얘 25mg/ml PNB용액 2mI를 100mI의 血陳培地에 混合했다.

3) 3% Ogawa培地

Monopotassium phosphate 3gm에 Sodium gIutam- inate 19m을 증류수 100mI 에 용해시켜 30分間 끓안다

1) 血滾培地에 依한 培養

本 實驗은 保健所와 病院에 릅?察받 o 러온 사랑 중에 서 結核園에 感梁이 되어있는 愚者로 부터 객담을 採 取하여 實驗에 供했다. 採取한 객 담의 농양部位를 Slide gIass 에 逢技하여 ZiehI-NeeIsen民 法으로 梁色 해 서 mycobacterium으로 判定된 객 담을 75 case를 取 하여 本實驗을 하였다.

SIide gIass를 걸 이 8cm, 福 0.8cm 되 게 짜른 Slide slip에 陽性객담을 쫓妹하여 室溫에서 1-2時間 방치하 여 건조시킨다. 이것을 1NHCI(8% HCI) 에 20분간처 리하여 다른 雜園을 죽안후 멸균 증류수로 두먼 세척 하여 HCI의 醒性 성 분을 제 거 해 버 란다음 6-7mI의 血滅培地가 分注되 어 있 는 Screw cap tube 에 넣 어 培 養을 하였다.

2) PNB血被培地에 依한 培養

한펀으로는 PNB 500μg/mI血滾培地에 Slide slip을 각각 넣어 37⁰C에서 7 日間 培養하였다. 7 日이 지난후 血波培地와 PNB 血被培地에 서 Slide slip을 꺼 내 셔 증 류수로 2차례 세척한후 70⁰-80⁰C로 조절된 hot plate 에 서 30분 -40분간 건조시 켰 다.

이 Slide slip을 Ziehl-NeeIsen民 方法으로 梁色했 다 本實驗에서는 주로 광학현마경으로 結核園의 증식된모 양과 園索形成 (cord-fomation) 與否와 PNB 血滾培地 에서의 園發育을 觀察하여 人型 및 牛型 結核園임 을同 定하였다.

3) 固形培地에 依한 培養(集園培養法)

- 2 0 -

血波培地에 培養을 실시하고 난다음 곧이어 객담명 수평으로 유지하고 37⁰C에 하루 두었다가세워셔 마차 에 4% NaOH용액을 同量을 加하여 마개를 꼭막고 진 를 꼭막어계 속해서 4주 "'8주간 배양하면서 처음 2주←

탕기로 충분히 균둥-화시켜 室溫에 20분간 방치해두면 부터 發育된 園을 觀察하고 어느정도 자란 園落으로 이해 雜園들은 Alkaline 해문에 모두 죽게 된다. Niacin test블 하여 人型結核園을 他 Mycobacteri um

균동화펀 객 담을 파이 햇 。1 나 루-프로 3% Ogawa培 과 鍵7JIJ 하였 다.

地에 接種하고， Centrifug~ tube 에 객 담을 넣 어 서 3,

000 r. p. m~루 15분간 원십분리하여 상둥액을 쏟아버 實 驗 結 果

리고 밑에 남은 침사를 中和시켜서 루-프 또는 파이

뱃 으로 한방울을 Lowenstein -J ensen 배 지 에 접 종하여 객 담에 서 채 취 한 균주를 3% Ogawa, L-J 배 지 에 서‘

1

‘

켜 훌

Fig. 봐· 血波배 치 에 일주일 간 배 양하여 Ziehl-Neelsen梁色한 것 (X100).

J5. 객담을 직접 도말하여 Ziehl-Neelsen梁色에셔 양성 。 문 보이는 A.F.B (X1000).

c. 血滾배지에 일주엘간 배양하여 Ziehl-Neelsen폈色놓찾( X400).

훌.，

출

@

’헬훌훌

D. 園索形成 Cord-formation 이 뚜렷 하것 (X1000).

E 뒀샌휠 血波배지에 일주일 배양후 Ziehl-Neelsen 梁色하여 1000培로 보았을혜 증식되지 못하고 그래로- F. 牛型 結核園이 PNB 血滾배지엑셔 증식되지 못한것 (X1000).

-_ 2 1 -

배 양하여 Niacin test를 거 쳐 M. tuerculosi. s루 확언띈 컷을 선택하여 血波培地에 7 日間 培養을 한후 Z~ehl­

Neelsen.EE; 方法으로 梁色하여 현미경으료 觀察한 結果 cord -forma ^{tion 이 찰되} 었고， 固形培地인 Ogawa, Low- enstein -J ensen 培地에 4주 이 상 培養하여 야 肉 짧으루 園集落을 盤別할 수 있었던것에 比하면 균의 발육이빨 리되는 것을 알수 있었다 (Table 1).

一般的으로 細園의 增植은 分짧에 依하여 이 루어 지 는데 人型結核園이 한번 分짧하는데는 다른 -般細園 보다 수십 또는 수백에 가까운 오벤 時間이 걸린다.

이 런점 이 人型結核園을 培養하거 나 또는 %究寶驗하는 데 있어서의 不便한 點으로 되어었다.

結核園을 培養한다는 것은 團을 增園시켜서 肉 R등的 오로 보아 園의 有無를 確끓하는 것 안데 培養한 結果 는 2--3 週日後 늦￡면 2--3個月후에야 알게되고 이와 같이 오랜 時日이 흉흉한다떤 結核의 진단이 늦어지게 된다. 그러므로 本實驗에 있어서 좀더 빠른 時티內에 結核園의 同定에 도움이 되 기 위 해 dide sEp에 객 담 을 뚫技하여 각각 血滾培地와 PNB血波培地에 넣어 7

日 間 培養을 한후 Ziehl-Neelsen民 方法으료 梁色하여 光學顯微鏡」즈로 (100 倍) 觀察하면 홉集落이 꼬블괴l 불 퍼지면서 자랐음을 쉽게 觀察할 수 있고 (Fig. A) 객 담을 直接쫓技하여 Ziehl-Neelsen.EE; 梁色法으료 염 색 해 본균은 전형적인 간균현이다 (Fig. B). 저배율로 檢鏡한다음 high power (400培)효 據大하여 보면 마 치 뱅 이 뭉친 모양꾀-도 같이 cord-formation (serpent- íne cord 園索形成)이 뚜렷하게 보였~며 繼續해서

Oil-immersÍon lense 에 서 는 (1， 000培) cord-fcrmation

이 이루어진 것이 園이 分짧한후 서료 접착하여 끈을 꼬는 형 태 (Rope-líke) 를 보여 주며 퍼 져 나감을 뚜렷 이 볼수 있었다 (Fig. C, D).

한펀 PNB 500μg/ml 血滾培地에 서 는 low power나 high power로 觀察하드러-도 cord -formatÍon띈것 을 觀 察할 수 없으며 Oil immersoin lense Celds에 셔 도 역 시 결핵균이 增植되지 뭇하고 그대로 남아 있음을 確 認、하였 다 (Fig. E).

Tsukamura (1964) ^가 PNB Ogawa培地에 서 結核園 을 배양하여 보았으나 증식되지 않았오며 本寶驗에서 Stri tc h -Dickinson의 血被培地에 PNB을 넣 어 實驗한 결과와 일치되었다.

위 와 같이 M. tuberculosis와 M. bovis는 血滾培地 에 서 cord -formation 이 찰되 고 M. bovis (BCG). M.

smegmatis는 cord -formation 이 되 지 않았으며 PNB

血被배지에서는 cord -formation 이 안되었다 (Fig. F).

그러 나 PNB 血被培地에 서 M. ~megmatis 는 發育되

Table 1. Detection of mycobacterium tuberculosis by direct smear, blood culture, and routine culture on 3% Ogawa and Lowenstein-Jensen Medla

Specimen I Positive Total I ITime m

Number I deed (week)

Blood media

I

I

3% Ogawa medium ! 75 I 70 I 4 Media

Lowenstein-Jensen 75 70 4

medium

Table 2. Growth of mycobacteria on slide

‘

Cord-formation var;- Num berl ous media Species of Blood melBlood med(-

dium wit-Ium with 500 hout I μg/ml of

PNB I PNB case

M. tu berculosis

디u

nJ

nU

nU

껴- nu

nu nu

9“ 5

3 3

[I

M.bovis M. bovis (BCG)

M. smegmatis ²

어 M. tuberculosis와M. bovis와는 PNB을 첨 가한 헐 액배지로 배양하므로서 감별이 가능했￡며 (Table 1), 75件의 양성객담을 혈액배지에 1주일간 배양하고， 3%

Ogawa배 지 및 Lowenstein -J ensen배 지 에 서 4--8주간 發育펀 園集落을 최 종으로 Niacin test하여 結核園을 同定하였다.

考察 및 結論

225件의 객 담 檢흉物을 對象으로 直接뚫技法에 依하 여 Ziehl-Neelsen 民 梁色法에 따라 梁色하여 간균으료 判定펀 객 담 75件을 slide glass slip(유리 切片) 에 逢 技하여 血被培地， PNB 血被培地， Ogawa培地， Lowe- nstein -J ensen 培地에 각각培養을 하여 본 結果 血滾培 地에 培養한 75件중 71 件이 cord -formation 陽注오르 냐타났으며 4件은 cord-formation 이 얀되 었 고 이 들은 藥勳耐性園이거나 變形된 園 또는 객맘채취한지 오랜 된 탓 o 로도 思料된다. 이 4件의 cord-formation 이 얀

- ? ?, ^‘

된 것은 陽性 객담을 가지고 實驗하였으므로 他抗醒演 이 라고는 生覺할 수 없 고 Ogawa 培地와 Lowenstein- Jensen培地에셔도 發育되었으며 發育펀 園集落의 鍵別 을 위해 실시한 Niacin test 에서도 陽注무로 나타난 것 으료도 알 수 있다.

그러고 Ogawa培地에서 75件中 5件이 L-J배지에서 5 件이 發育되지 않은것은 4% NaOH르 균둥와 처리파 정에서 i됨梁에 依한 發育不振이리-고 생각된다.

PNB 500μg/ml培地에서는 人型 및 牛型결핵균은 증 균이 되 지 않았음은 Tsukamura의 보고와 一致되 켜 PNB 500μg/ml가 함유된 Ogawa培地에 서 도 M. tubo- erculosis, M. bovi 'l는 자리-지 않고 他抗醒園은 發育 띈 다고 보고하였 다 (Tsukamura) .

그러 나 本實驗에 서 PNB培地에 M. smegmatis 는 증 균 되였음을 觀察할 수 있었다.

Runyon-Konno은 Niacin을 生塵하는 園은 M.tube- roulosis라고 하고 egg培地에 서 人型核園이 Nicotinic- acid를 生塵性하여 Nisclntest 양선 언 균을 M. tuberc- ulosis라고 同定하는데 利用한다고 보고하였다.

Tsukamura and Tsukamura^1D는 PNB培地에 셔 자 리-지 않는 園들은 Niacin을 생 성 한다고 하였 다.

Gangadhiran and Drouble^D 는 Tsukamura and

Tuskamura의 方法을 안용하여 PNB培地 농도를 500 μg， 250μg， 125μg/ml되 게 7H 10培地와 L-J培地에 서 實驗한 結果 PNB 500μg/ml 培地에서는 전혀 M.tub- erculosis가 發育되지 못했으며 역시 이園은 Niacine장g 을 생성하는 園￡료 結核園으로 同定되었다.

肉眼的으로 egg배지에서 4週 "'8 以上 發育된 園集落 의 觀察6， 9) 이 어려울뿐더러 오랜時樣이 걸리는 종전꾀 방법보다 본살험결과로 단시일내에 빨리 結核이라는 진단을 확진하기 위해 slide에 逢1*하여 血被培地써l 배양하여 현미경으로 검사하여서 신속히 동정할 수 있 다.

물론 객담내에 結核團이 많이 배출되어 있다면 egg 배지에서도 많은 園集落을 確認、할 수 있겠지만 직접도 말검사에서 全視野블 골고루 찾아보아야 園이 1"'3保 體 정도로 보였다면 재검사를 실시해야 함은 물론이다

그러나 이 方法을 시도하면 egg배지에서 4주 "'8주까 지의 時間이 경과되어야 發育與否로 確認、해야 되든 껏 을 Slide培養법 ￡로 3"'7 日 間배 양하여 보면 low-bow안r 로 觀察하여도 園 1 個體가 증식되여 園索形成이 되고 있음을 쉽게 觀察할 수 있다.

결핵균 감벨은 egg배지에셔 지난 균략을 여러가지 생리학적 생화학적 검사를 거쳐서 감벨을 할 수 있 ;~1 만 균색 형 성 하는 결 핵 균 M. tuberculosis와 M. bovis,

M. bovis (BCG) 은 P.N.B培地에 셔 증식 하치 못하므로 PNB를 첨가한 배지에서 M. smegmatis와 區別되고 그 러고 PNB가 들어 있지 않은 배치에서 자러-는 M.tub- erculosis M. bovis, M. bovis(BCG) 의 3균중 M. tube- rculosis는 Niacin test양성 으로 나타나 구별 펀다.

(Table 2) 따타서 PNB가 들어 있지 않은 배지에서균 색형성하고 PNB가 들어 있는 배지에서는 균색형성을 하지않는 것이 인형및 우형 결핵균이리-고 할 수 있오 며 PNB가 함유된 배지에서도 균색이 형성되는 것은 M. smegmatis다고 할 수 있 다.

요 ^{。 t}ï

本 昭究는 M. tuberculosis와 M. bovis를 同定하기 寫 한 寶驗이 다. 그 方法은 Tsukamura, Strltch-Dickio- nson의 方法을 적용해서 양성오로 판명된 객담에서 75 건의 균을 혈액배치에 배양하여 그 중 71건은 균색형 이 형성되었다.

Slide slip에 도말한 객담을 설은에서 건조시킨후 INHC에 처리하고 별균증류수르 세척한후 각각 血滾 培地， PNB 500μg/ml 헐액배지에 7 日간배양시킨마음 각71 배지에서 sllde slip을 꺼내서 증류수에 세척하여 hot plate 에 서 30分間 加溫한후 Ziehl-Neelsen 法오로 梁色을 하였다.

梁色된 s!;de를 광학현미경 4로 검경한 결과결핵균 이 발육형선 되였음을 볼수 았었다. 이 균색형성된균 이 人型結核團언가 확실히 알기위하여 egg배치에서 배 양된 균집 락을 Nlacin test를 하여 감벨하였 고 Table2 에서와 같이 人型및 牛型 結核園은 PNB 혈액배지에사 증식 되 지 못하고 他 Mycobacterium은 증식 되 였 음으 로 PNB를 이용하면 人型및 牛型 결핵균 同定에 도움 이 된다.

(이 論文을 준비하는데 많은 지도와 협조를 해주신 가폴럭 의대 성모명원 임상병리과 이종무 교수께 깊은 감사를 도립니다)

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