Development of Biofungicide Using Bacillus sp. KBC1004 for the Control of Anthracnose of Red Pepper

식물병연구

Research Article Open Access

Res. Plant Dis. 21(3) : 208-214(2015)

http://dx.doi.org/10.5423/RPD.2015.21.3.208

Research in Plant Disease

©The Korean Society of Plant Pathology pISSN 1598-2262, eISSN 2233-9191

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길항세균 Bacillus sp. KBC1004를 이용한 고추탄저병의 생물학적 방제제 개발

Development of Biofungicide Using Bacillus sp. KBC1004 for the Control of Anthracnose of Red Pepper

강훈석¹ · 강재곤¹ · 박정찬¹ · 이영의¹ · 정윤우¹ · 김정준² · 박창석¹*

1(주)한국바이오케미칼 부설 연구소, ²농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과

Hoon-Serg Kang¹, Jae-Gon Kang¹, Jeong-Chan Park¹, Young-Ui Lee¹, Yoon-Woo Jeong¹, Jeong-Jun Kim² and Chang-Seuk Park¹*

1Korea Biochemical Co. Ltd., Attached Research Institute, Jinju 660-841, Korea

2Agricultural Microbiology Division, National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Jeonju 565-851, Korea

To develop an effective biopesticide to control pepper anthracnose disease, an isolate which showed strong inhibitory effect on the mycelial growth and conidial germination of Colletotrichum acutatum was selected among the antagonistic bacterial isolates collected from pepper grown soil. The bacterial isolate was identi- fied as Bacillus sp. KBC1004 using 16S rRNA sequence analysis. The liquid culture of KBC1004 was freeze-dried and formulated as a wettable powder(WP). The wettable powder form of KBC1004 required at least 24 hours to activate and to inhibit the conidial germination of C. acutatum. In vitro bioassay using the detached green pepper fruits, biocontrol activity of the WP was not recognizable in simultaneous inoculation, but significant disease suppression was observed pre-treatment (24 hr) of the WP before pathogen inoculation. In field ex- periment, 4 times foliar applications of the 1/500 diluted wettable powder from the end of June showed great control efficacy similar to that of the chemical fungicide application. These results suggest that the formulated WP product could be an alternative mean to control of pepper anthracnose disease in environmentally friend- ly farming practices.

Keywords : Bacillus sp. KBC1004, Biofungicide, Pepper anthracnose, Wettable powder

서 론

고추는 전통적으로 우리가 먹고 있는 다양한 식품에 필수적 으로 사용되는 양념일 뿐 아니라 새롭게 개발되는 식품에서도 요긴하게 사용되는 중요한 식재료로 부각되고 있다. 값싼 중국 산 고추가 대량으로 수입됨으로 인하여 노지 고추의 재배면적

이 다소 줄어들기는 하였지만 안전한 식품원료와 질 좋은 먹 거리를 찾는 소비자의 요구가 늘어나고 있기 때문에 고추를 재배하는 농가는 여전히 줄어들지 않고 일정한 수준을 유지 하고 있다.

고추 탄저병은 잎이나 어린 묘에도 발생하기도 하지만 가 장 문제가 되는 것은 과실에 병반을 형성하여 상품성을 훼손 하고 부패시켜 직접적인 피해를 가져오는 것이다. 고추는 정 식 후 약 일주일부터 시작하여 생육말기까지 계속해서 새로운 과실이 달리는데 새로 달리는 고추는 지속적으로 전염원에 노 출된다(Jee 등, 2010; Kim 등, 2015; Lee 등, 2011; 2014; Park과

*Corresponding author Tel : +82-10-6562-5442 Fax: +82-55-762-4521 E-mail: [email protected]

Received May 8, 2015 Revised June 29, 2015 Accepted July 2, 2015

Research Article Open Access http://dx.doi.org/10.5423/RPD.2015.21.3.208

Kim, 1994). 더욱이 노지에서 고추가 자라는 여름철은 잦은 강 우로 포자분산이 활발하고 높은 온도와 습도가 유지되기 때문 에 탄저병을 방제하기 위해서는 수확기까지 10회 이상의 약 제방제를 하는 것이 어쩔 수 없는 현실이다(Lee 등, 2014; Park 등, 2012; Soh 등, 2014). 화학농약이 생태계에 미치는 부정적 인 영향이나 식재료에 남아 있을 수 있는 화학물질의 유해성 은 반드시 해결해야 할 문제로 남아 있다. 이러한 문제를 해소 하기 위하여 각종 친환경자재나 미생물을 이용한 탄저병의 방 제가 활발하게 시도되고 있다(Kim 등, 2014; Lee 등, 2011; Park 등, 2012; Soh 등, 2014; Yoo 등, 2012). 탄저병을 생물학적으로 방제하기 위하여 다양한 미생물들을 선발하여 왔으며 실내실 험이나 소규모 포장시험에서 상당한 방제효과를 나타내고 있 다(Chaisemsaeng 등, 2013; Kim 등, 2014; Lee 등, 2011; Yoo 등, 2012). 그러나 이러한 미생물제들이 생물농약으로 개발되어 농 가에 보급되려면 미생물의 대량배양을 거쳐서 농민이 간편하 게 사용할 수 있는 제형을 개발되어야 하고 그 제형이 실제 포 장에서 방제효과를 나타내기까지 몇 번의 검정을 거쳐야 하지 만 이러한 연구는 많지 않다.

본 연구에서는 고추탄저병균에 길항력을 나타내는 미생물 중에서 포자를 형성하여 안정성과 내구성이 뛰어난 세균을 선 발하였고 선발한 세균을 실제 농가에서 편리하게 이용할 수 있 는 생물농약으로 개발하는데 목표를 두고 실내 실험과 포장 실 험을 통하여 방제효과를 검토한 내용을 보고하고자 한다.

재료 및 방법

균주선발 및 동정. 고추를 재배하는 토양에서 분리한 세균 들 중에서 상온에서 증식이 활발하고 포자를 형성하는 그람양성 간균들을 선발하였다. 이들 세균들을 농업유전자원센터(KACC) 에서 2012년 분양받은 고추 탄저병균 Colletotrichum acutatum 40804와 대치 배양하여 균사 생장을 현저하게 억제하는 7종의 세균을 선발하였다. 최종적으로 선발한 세균의 형태적 특성과 그람반응, 탄소원 이용, catalase 반응, casein 분해, gelatin 분 해 등 생리적인 특성을 Schaard 등(2001)이 기술한 방법으로 실험하였다. 이 세균의 16S rRNA을 분석하기 위하여 프라이머 27mF(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492mR (GGYTACCTT- GTTACGACTT)를 사용하여 16S rRNA gene 부분을 PCR로 증폭 하였다. PCR 조건은 최종농도 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 200 nM dNTPs이고 10 pmol의 프라이머와 0.1 unit의 Taq DNA polymerase(Promega Korea Ltd. Seoul, Korea) 를 사용하였으며, 최종반응용량을 50 μl로 맞추었다. PCR 반응 조건은 predenaturation(98^oC, 2분), denaturation(98^oC, 1분), annealing(60^oC, 1분), extension(72^oC, 1분), total cycle(30 cycles), final extension(72^oC, 4분)이었으며, 증폭된 PCR 산물 은 전기영동 후 밴드를 확인하였다. 확인된 밴드를 분리 정제

하여 pGEM-T Easy(Promega) vector에 결합하였다. 결합된 산 물을 Escherichia coli DH5α에 형질전환 시켜서 클로닝이 확 인된 plasmid를 DNA 염기서열 분석 전문업체(Macrogen Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다. 유전적 유연 관계분석은 MEGA 4.0 프로그램(Tamura 등, 2007)을 이용하여 Neighbor-joining(NJ) 방법으로 작성하였다.

탄저병균 균사생장 억제. KACC 40804를 PDA 배지에서 28^oC로 7일간 배양하여 자라난 균총의 가장자리를 직경 0.5 cm 유리관으로 떼어낸 agar block을 PDA 페트리 접시(직경 8.5 cm) 중앙에 접종하고 3 cm 떨어진 좌우측에 LB agar에서 30^oC로 48시간 배양하여 얻은 각각의 공시 세균 코로니를 멸균수에 현 탁하여 UV/visible Spectrophotometer(Hanson Tech Co. Ltd., Seoul, Korea)을 이용하여 10⁸ cfu/ml로 조절한 세균현탁액 10 μl를 접종하여 28^oC에서 5일간 배양하였다. 탄저병 균사가 방사형으로 자라다가 세균에 의해서 생장이 억제되어 원의 일 부가 일직선이 되는데 이 지점까지의 거리를 측정하고 같은 기 간 동안 무처리구(세균을 접종하지 않은 처리)에서 자라난 균사 의 생장반경과 비교하였다. 각 처리마다 좌우 양쪽을 조사하였 고 3반복으로 실험하였다.

탄저병균 분생포자 발아억제. 각각의 공시 세균 부유액 (10⁸ cfu/ml)을 100 μl씩 물한천 배지(증류수 1 l, Bacto agar 15 g) 전체에 골고루 도말하고 24시간이 지난 후 탄저병균 포 자현탁액 100 μl를 다시 배지 전체에 도말하고 나서 8시간이 경 과한 다음 포자 발아율을 조사하였다. 분생포자 현탁액은 PDA 배지에서 10일 간 자란 KACC 40804의 분생포자를 붓으로 모아 서 멸균 증류수에 넣고 혈구계로 포자수를 측정하여 10⁶/ml의 농도로 조절한 분생포자 현탁액을 만들었다. 발아관의 길이가 분생포자 길이의 절반 이상 나온 것을 발아로 간주하였고 plate 당 300개 이상의 포자를 관찰하였으며 3반복으로 실험하였다.

세균에 의한 탄저병균의 균사생장 억제율과 분생포자 발아억 제율은 다음과 같은 식으로 계산하였다.

대조구의 조사 값 - 처리구의 조사 값 대조구의 조사 값 ×100

수화제로 만든 KBC1004 제품을 500배로 희석하여 소형분무 기로 물한천 배지 표면에 골고루 분사하고 물기가 마른 후, 8시 간, 16시간, 24시간, 32시간, 40시간 경과 후 KACC 40804의 분 생포자 부유액(10⁶/ml) 100 μl를 배지에 도말하고 8시간이 지 난 후 분생포자의 발아율을 무처리와 비교하였다. 앞 에와 같은 방법으로 plate 당 300개 이상의 분생포자를 조사하여 발아율 을 결정하였고 모든 처리는 3반복으로 각 조사치의 표준편차를 조사하였다.

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선발 미생물의 제형화. 최종적으로 선발한 KBC1004 균 주를 30 l 발효조(KoBioTech Co. Ltd., Incheon, Korea)에서 액 체 배양(Glucose 2%, Yeast extract 0.5%, MgSO4·7H2O 0.02%, KH2PO4 0.1%)하여 얻은 배양액(10⁸ cfu/ml 이상)에 10%의 skim milk를 넣고 동결건조기(Samwon Freezing Engineering Co.

Ltd., Busan, Korea)를 이용하여 동결 건조하였다. 여기서 얻은 고형물 5%를 주성분으로 하고 포도당(삼양사) 5%, 제오실(한 불화학) 90%을 혼합하여 수화제형을 만들었다. 이 제형에서 KBC1004의 생존밀도를 농촌진흥청 고시 제 2014-36호 농약 및 원제의 등록기준의 별표 9, 9-2 미생물농약 및 생화학농약의 이 화학(또는 생물학적) 분석기준에 의해 조사하였다. 수화제형 은 알루미늄 포장지에 500 g씩 넣어 밀봉하고 3개씩 0^oC, 25^oC, 54^oC에서 4주간 보관하면서 생존력을 조사하였다. 각 온도에 보관중인 3개의 포장에서 시료를 각각 1 g씩 채취하여 3개의 plate에 단계별 희석평판 배양법으로 균수를 조사하였다. 모든 처리는 3반복으로 시험하였다.

실험실에서 고추탄저병 발생억제. 직경 14 cm 되는 유리 페트리 접시에 직경 15 cm Wattman 여과지 2장을 깔고 멸균증 류수 3 ml를 넣은 다음 비닐하우스에서 재배한 풋고추(품종: 녹 광)를 흐르는 물에 씻어서 3개씩 배치하였다. 공시한 모든 고추 를 길이로 세워 같은 간격으로 5곳을 표시해 놓고 알코올 램프 화염으로 멸균한 곤충 핀 5개를 함께 묶은 것으로 고추에 상처

를 내었다. KBC1004의 수화제 제형을 500배로 희석하여 분무 기로 페트리 접시에 배치한 고추에 골고루 분무한 후 물기가 마 른 다음 즉시 탄저병균 분생포자(10⁶/ml)를 분무한 것, 24시간 후 분무한 것, 세균을 처리하지 않은 것을 각각 7일간 28^oC로 배 양하면서 병 발생 정도를 비교하였다. 모든 시험은 3반복으로 시험하였다.

포장에서의 탄저병 발생 억제. 경남 진주시 초전동 소재 고 추밭에 5월 3일 고추묘(품종: 부촌고추)를 정식하고 6월 27일부 터 10일 간격으로 4번 KBC 1004의 수화제 제형을 500배로 희석 하여 수동식 분무기로 살포하였다. 미생물제 처리와 함께 화학 농약(카벤다짐 수화제) 1000배액을 같은 방법으로 살포하여 무 처리와 비교하였다. 최종 약제 처리 후 10일 경과 후 처리구별 로 붉은 고추를 모두 수확하여 병든 과실율을 조사하였다. 처리 구당 면적은 16 m²이었으며 3반복으로 시험하였다.

결과 및 고찰

길항균주 선발. 일차적으로 선발한 모든 균주가 균사 생 장억제 능력과 분생포자 발아억제력을 보였다. 그 중 KBC1004 균주는 다른 균주에 비하여 병원균의 균사생장이나 분생포자 발아의 억제력이 현저히 높았다(Table 1). 탄저병을 생물학적 으로 방제하기 위하여 Bacillus sp.(Lee 등, 2010; Yoo 등, 2012),

Table 1. Inhibition of mycelial growth of Colletotrichum acutatum on potato dextrose agar and conidial germination on water agar by selected antagonistic bacteria

Test Isolates Inhibition of mycelial growth Inhibition of conidia germination

Mycelial growth (mm)^a Inhibition rate (%)^b Germination rate (%)^c Inhibition rate (%)^d

KBC 1004 16.6±0.6 45.6 a^e 18.7±1.9 81.1 a^e

KBC 70 20.3±1.1 33.7 b 27.4±2.8 72.3 b

KBC 5 21.8±0.9 28.3 c 29.6±2.4 70.0 b

KBC 5-5 22.7±1.8 26.5 c 31.5±1.7 68.1 bc

KBC 40 21.4±1.6 29.7 c 42.7±3.1 56.8 c

KBC62-1 24.2±1.1 20.3 d 37.6±3.0 62.0 c

KBC68-1 24.8±1.0 18.3 d 34.2±2.9 65.4 bc

Control 30.3±1.9 - 98.9±1.2 -

aDual culture of antagonistic bacteria and C. acutatum were made 3 cm apart on PDA and measure the radius of mycelial growth of C. acutatum toward antagonistic bacteria. Each value represents mean of 3 replication of mycelial growth measurements.

bInhibition rate of mycelial growth was calculated as follows;

Mycelial growth of control - Mycelial growth of treatment × 100 Mycelial growth of control

c100 ml of antagonistic bacterial suspensions (10⁸ cfu/ml) were spread on water agar, after 24 h, 100 ml of conidial suspensions (10⁶/ml) of C.

acutatum were spread on the same water agar. After 8 h, germinated conidia were counted. More than 300 conidia were observed in each plate and three replications in each treatment.

dInhibition rate of conidia germination was calculated as follows;

% germination of control - % germination of treatment × 100

% germination of control

eValues followed by the same letter are not significantly different at P=0.05 based on Duncan’s multiple range test.

Yeast(Punika 등, 2013), Streptomyces(Kim 등, 2014) 등 다양한 미생물을 사용하고 있으나 제품의 안정성이나 내구성으로 볼 때 포자를 형성하는 Bacillus 속 세균이 유리하며 대량생산이나 제형에도 유리하기 때문에 산업화를 위해서는 Bacillus spp. 들 이 자주 이용된다. 실내에서 길항력을 검정할 때 배양여액이나 추출물을 이용하기도 하지만(Chaisemsaeng 등, 2013; Kim 등, 2014; Yoo 등, 2012) 본 연구에서는 길항균과 병원균을 직접 대 치하여 병원균의 균사생장과 포자의 발아 억제력을 조사하였 다. 실제 생태계에 길항미생물이 병원균을 억제하는 상황을 놓 고 본다면 생장하는 길항균을 가지고 검정하는 것이 보다 실제 생물적 방제에 가깝다고 생각된다.

길항세균의 동정. 최종적으로 선발한 KBC1004 균주의 형 태적인 특성을 보면 포자를 형성하는 그람양성 간균으로 Bacillus 속의 특성을 갖고 있었고 당류 이용이나 catalase 반응, gelatin 분해능력(Table 2) 등을 볼 때 Bacillus에 해당한다고 판단하여 이 세균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였고 NCBI BLAST 분석 결과 Bacillus subtilis ATCC 19217 균주와 100% 상 동성을 보이는 등 Bacillus 속에 속하는 균주들과 높은 상동성을 보였고 유연관계 분석에서도 KBC1004 균주는 Bacillus속 균주 들과 동일한 clade에 포함되는 것으로 판단되어 KBC1004 균주 는 Bacillus속에 속하는 세균으로 판단되었다(Fig. 1). 이러한 결 과를 바탕으로 이 균주를 Bacillus sp. KBC1004로 명명하였다.

KBC1004 수화제의 안정성. KBC1004를 동결 건조하여 얻 은 건조물을 포함하는 수화제형을 0^oC, 25^oC 54^oC에서 보관하 면서 경과시간 별로 제형에 함유된 KBC1004의 밀도를 조사한 결과 Table 3에서 보는 바와 같이 0^oC와 25^oC에서는 4주 후 균 밀도가 초기 균수보다는 약간 떨어졌으나 10⁸ cfu/g을 유지하 고 있음을 확인하였으나 54^oC에서 0^oC와 25^oC보다는 균 밀도 가 상대적으로 낮게 조사되어 고온에서는 영향을 미치는 것으 로 조사되었다. 그러나 농촌진흥청 고시에 의하면 미생물의 약 효보증기간 설정시험에서 54^oC에서 4주간 유효성분의 변화가 없는 경우 2년의 약효보증기간을 설정할 수 있다. 이를 기초로 Table 2. Morphology and physiological characteristics of Bacillus sp.

KBC1004

Characteristics Bacillus sp. KBC 1004

Cell shape rod

Cell diameter <1.0 mm

Endospore round

Gram reaction positive

Motility motile

Catalase present

Facultative anaerobic positive

Acid from glucose strong

Gas from glucose negative

Acid from Arabinose +

Acid from Xylose +

Acid from Mannitol +

Casein hydrolysis +

Starch hydrolysis +

Gelatin hydrolysis +

Cell shapes and endospores were observed by Transmission electron microscope (JEOL Ltd, Tokyo, Japan), and the materials and methods for the physiological tests of the bacteria followed Schaad et al. (2001).

Fig. 1. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of Bacillus strains. Bar indicates 0.005 substitutions per nucleotide position. The strain studied in the present study marked in bold.

Table 3. Survival densities of Bacillus sp. KBC1004 contained in wettable powder at different storing temperature

Temperature stored (^oC)

aCell density of KBC1004 (×10⁸ cfu/g) as time passes Beginning 1 week 2 weeks 4 weeks 0^oC

4.37±0.45

3.34±0.67 2.98±0.65 1.9±0.43

25^oC 2.92±0.65 2.17±0.59 1.67±0.61

54^oC 2.08±0.58 1.51±0.49 1.16±0.55

aCell densities of KBC1004 were measured with dilution plate count method after the aluminium foil packed freeze-dried powder of the bacteria were kept in incubator for given periods at given tempera- ture.

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KBC1004를 유효성분으로 하는 수화제를 만든다면 농가에서 편리하게 사용할 수 있고 유통기간이 2년 이상 유지하는 제품 으로 안정성이 우수한 상품으로 개발될 수 있을 것으로 생각 된다.

KBC1004 수화제 제품의 분생포자 발아억제. 수화제로 제 형화한 KBC1004를 물한천 배지에 분무한 다음 8시간 간격으 로 탄저병균의 분생포자를 접종하고 각각 12시간 지난 후 발아 율을 조사하였다. KBC1004를 분무하고 나서 16시간까지는 아 직 포자상태로 있었던 세균이 대부분 활성화 되지 않았기 때문 에 발아율이 70% 이상이나 되었다. 그러나 24시간이 지나면 분 생포자의 발아율이 34.6%로 급격히 낮아졌고 36시간이 지나 면 극히 일부분인 1.5%만 발아하였고 40시간이 지나면 전혀 발 아하지 못하였다(Fig. 2). 탄저병의 포자발아는 병의 침입에 필 수적인 단계이고 발아율은 병반형성과 밀접한 관계가 있다(Jee 등, 2010; Kim 등, 2003; Marvel, 2003). 실제 포장조건에서 과일 표면에 부착한 포자가 발아하여 기주에 침입할 만큼 충분한 수 분조건이 유지되는 시간은 그리 길지 않다. 따라서 포자발아가 지연되거나 극히 일부분 발아한다면 병은 발생할 수 없는 것이 다(Jee, 2010; Marvel, 2003). 제형화된 KBC1004는 모두 내생포 자 상태로 존재하기 때문에 수분을 흡수하여 활성화되기 까지 는 최소 24시간 이상이 필요하고 32시간이 지나면 확실하게 포 자 발아를 억제할 수 있음을 확인하였다. 포자가 기주에 부착하 고 발아 하여 기주에 침입하는 과정에서 살균제나 길항미생물, 친환경자재가 효과적으로 침입을 차단하여 병 발생을 최소화 하기 위해서 포자부착과 발아 및 침입에 관한 연구들이(Jee 등, 2010; Kim 등, 2003; Lee 등, 2014; Marvel, 2003; Park 등, 2012) 좀 더 활발하게 진행되어야 할 것이다.

KBC1004 수화제의 풋고추 탄저병 발병억제. 하우스 재 배에서 채취한 풋고추에 상처를 내어 탄저병을 접종하고 KBC1004 제품 500배액을 분무하여 병 발생 억제 정도를 조사 하였다. KBC1004를 분무하고 난 직후 탄저병균을 접종한 처리 에서는 무처리에 비하여 다소 억제되기는 하였으나 상처부위 가 대부분 병반으로 발전하였다. 그러나 KBC 1004 제품을 분무 하고 24시간 지난 후에 탄저병균 분생포자를 접종한 처리에서 는 현저하게 병 발생이 억제되어 극히 일부만 병반으로 발전되 었으나 병반이 거의 확대되지 않았다(Fig. 3). 실내에서 고추열 매를 가지고 탄저병 실험을 할 때는 상처를 주지 않고 병균을 접종하여 병 발생을 유도하는 것이 대부분이지만(Kim 등, 2014;

Lee 등, 2014; Park 등, 2012; Soh 등, 2014; Yoo 등, 2012), 본 연 구에서는 병균을 접종한 부위로부터 병이 진전되는 것을 정확 하게 확인하고자 핀으로 상처를 주고 병균을 접종하였다. 그리 고 이 방법은 재현성이 높고 짧은 시간 안에 병의 진전을 확인 할 수 있었다. KBC1004를 수화제로 만든 제품은 최소한 24시간 정도 시간이 지나야 세균이 활성화되어 탄저병의 포자발아를 억제할 수 있기 때문에 KBC1004를 처리한 당일에 탄저병균을 접종한 고추에서는 대부분 병이 발생하였다. 그러나 병반의 확 대는 무처리에 비해서 현저히 억제되었음을 볼 수 있었다(Fig.

3). 이러한 현상은 KBC1004를 처리하고 나서 24시간 지난 후 병 균을 접종한 처리에서 더욱 분명하게 나타났는데 이는 상처부 위에서 활성화된 KBC1004가 발아한 탄저병균의 균사생장을 억제하였던 것으로 추정된다.

포장에서의 탄저병 발생억제. 포장시험기간은 고추 탄저 Fig. 2. Inhibition of conidial germination of Colletotrichum acutatum

by wettable powder of Bacillus sp. KBC1004. 500× KBC 1004 WP. were sprayed on water agar surface and let them dry and 8, 16, 24, 32 and 40 hours after 100 ml of conidial suspensions (10⁶/ml) of C. acutatum were inoculated. The germination rates of the conidia were recorded form the observation of more than 300 conidia in each plate and 3 replications.

Fig. 3. Suppression of disease development of pepper anthracnose on detached green pepper fruits by wettable powder of Bacillus KBC1004. Symptom development was observed at 7 days after pathogen inoculation. (A) 1/500 dilution of KBC1004 wettable pow- der was sprayed on the detached green pepper fruits then inoculated conidial suspension (10⁶/ml) of anthracnose conidia at same day, (B) KBC1004 treated 24 h earlier than conidia inoculation, (C) Untreated control.

병이 발생하기에 적합하여 농약이나 KBC1004를 처리하지 않 은 무처리 구에서는 탄저병에 걸린 과실이 약 50%에 가까웠 다. 이에 비하여 화학농약을 처리한 구에서는 7% 이내의 발병 율을 보였고 KBC1004를 처리한 구에서도 10%가 안되는 발병 율을 나타내었다(Table 4). 이것은 탄저병의 분생포자가 확산 하기 시작하는 시기를 잘 포착하여 적절한 시점에서 약제를 살 포하였기 때문이라고 판단된다. 탄저병의 발생과 확산은 강우 와 이에 따른 습도와 온도와 밀접한 관계가 있다(Jee 등, 2010;

Kim 등, 2003; Marvel, 2003; Park과 Kim, 1994). 그러나 야외 포 장에서 습도와 온도는 인위적으로 조절할 수 있는 것이 아니기 때문에 분생포자가 비산하기 시작하는 시기를 정확하게 포착 하여 탄저병의 초기 밀도를 억제하는 것이 가장 중요하다(Jee 등, 2010; Kang 등, 2005; Lee 등, 2014; Park과 Kim, 1994). 고추 탄저병을 생물학적으로 방제하려는 시도는 많았지만 포장에 적용한 결과는 많지 않고 방제효과도 50-60%인 것이 대부분이 다(Chaisemsaeng 등, 2013; Kim 등, 2014; Lee 등, 2011; Yoo 등, 2013). 본 연구에서 화학농약(카벤다짐)이 86.3%의 방제가를 나타냈을 때 KBC1004가 80.8%를 보인 것은 주목할 만 것이라 하겠다.

요 약

고추 재배토양에서 분리한 세균 중에서 고추탄저병균의 균 사생장을 강하게 억제하며 분생포자의 발아를 현저히 억제 하는 균주를 선발하였다. 이 균의 형태적 생리적 실험과 16S rRNA 분석결과를 토대로 Bacillus sp KBC1004로 명명하였다.

KBC1004를 동결 건조하여 얻은 건조물을 원제로 하여 탄수화 물과 증량제를 포함하는 수화제형(2 × 10⁸ cfu/g)으로 제조하였 을 때 상온에서 2년 이상 안정된 밀도를 유지하였다. 수화제 형

태의 KBC1004가 활성화 되어 탄저병균 분생포자의 발아를 억 제하려면 최소 24시간이 경과되어야 하였고 실내에서 고추 열 매를 이용하여 탄저병의 발병 억제력을 조사한 결과도 24시간 전에 KBC1004 수화제를 살포하고 병원균을 접종하였을 때 효 과적인 병 방제가 이루어졌다. 고추포장에서 KBC1004 수화제 를 500배로 희석하여 탄저병이 발생하는 6월 말부터 4회 처리 하고 10일 경과 후 이병과율을 조사한 결과 화학농약의 방제가 가 86.3%이였을 때 80.3%의 높은 방제가를 나타내었다.

Acknowledgements

This study was carried out with the support of “Cooperative Research Program for Agricultural Science & Technology Development (Project No. PJ00997901)” Rural Development Administration, Republic of Korea.

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KBC1004 to anthracnose of pepper in field condition

Treatment Infected fruit ratio (%) Controld efficacy 1st plot 2nd plot 3rd plot Average

Untreated control 53.5^c 48.9 46.1 49.5 - Chemical fungicide^a 6.6 6.2 7.8 6.8 86.3

KBC1004^b 9.5 10.3 8.7 9.5 80.8

a1000 times of carbendazim wettable powder were sprayed on the pepper fruits and leaves 4 times with 10 days interval from June 27.

b500 times of wettable powder form of Bacillus sp. KBC1004 were sprayed on the pepper fruits and leaves 4 times with 10 days interval from June 27.

cAll of the ripen red fruits were harvested at 10 days after last spray and examined the infected fruits. Pepper fruits shown any type of anthracnose symptoms were counted as infected fruit.

dPercent disease control efficacy was calculated as follows;

Disease rate of control - Disease rate of treatment × 100 Disease rate of control

Research in Plant Disease Vol. 21 No. 3

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