Biological Control of Sclerotinia sclerotiorum in Lettuce Using Antagonistic Bacteria

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Res. Plant Dis. 19(1) : 12−20 (2013)

© The Korean Society of Plant Pathology

http://dx.doi.org/10.5423/RPD.2013.19.1.012

길항세균을 이용한 상추 균핵병의 생물학적 방제

전봉관·박수지·김진원*

서울시립대학교 환경원예학과

Biological Control of Sclerotinia sclerotiorum in Lettuce Using Antagonistic Bacteria

Bong-Goan Chon, Suji Park and Jin-Won Kim*

Department of Environmental Horticulture, The University of Seoul, Seoul 130-743, Korea (Received on January 17, 2013; Revised on February 6, 2013; Accepted on February 7, 2013)

To isolate antagonistic bacteria against sclerotinia rot of lettuce, caused by Sclerotinia sclerotiorum, soil samples were collected from the diseased greenhouse field in Namyangju city, Gyeong-gi province from 2007 to 2008. A total of 196 bacterial isolates were isolated using serial dilution method. In dual culture assay in vitro, 26 isolates showed more than 80% of inhibition rates of mycelial growth of S. sclerotiorum. Based on 16S rDNA sequence analysis, the 26 isolates were identified as Bacillus megaterium, B. cereus, B. subtilis, Arthrobacter nicotianae, A. ramosus, Pseudomonas filiscindens, Stenotrophomonas maltophilia, Brevibacterium frigoritolerans and Sphingobacterium faecium. The 26 isolates inhibited the mycelial growth of S. sclerotiorum up to 80% and the sclerotial germination 0−100%. In the greenhouse pot test of ten isolates conducted in summer, 2 isolates B. megaterium (DK6) and B. cereus (C210) showed control efficacy on sclerotia viability of S. sclerotiorum, 20% and 35%, respectively. In the greenhouse pot test in winter, the disease incidence of the control group was 80%, whereas those of 9 isolates among 26 were approximately 20%. From the result, the 9 isolates are expected as potentially antagonistic bacteria for biological control of sclerotinia rot of lettuce caused by S. sclerotiorum.

Keywords : Antagonistic bacteria, Biological control, Lettuce, Sclerotinia rot, Sclerotinia sclerotiorum

서 론

상추 균핵병(Sclerotinia rot)은 Sclerotinia sclerotiorum와 S. minor에 의해 발생하는데, S. sclerotiorum에 의한 상추 균핵병은 미국에서는 1890년에 보고되었고(Subbarao, 1998), 우리나라에서는 1976년에 처음 보고되었다(김, 1976). 미 국과 유럽에서는 S. sclerotiorum가 자낭포자를 통해 주로 감염된다(Abawi와 Grogan, 1975; Whipps 등, 2002), 미국, 유럽 등 상추를 생산하는 주요 국가에서는 상추 균핵병 이 수량손실을 야기하는 중요한 병으로 알려져 있으며, 미국에서는 매년 1−75%의 작물손실을 일으키는 병으로 알려져 있다(Purdy, 1979). 국내에서 연중 생산되는 상추

는 주로 시설내에서 재배되며, 연작과 늦가을부터 초봄에 이르는 겨울철의 저온다습한 시설내의 환경은 균핵병의 발생을 조장하여 농가에 경제적 피해를 주고 있다(Chang 과 Kim, 2003; Kim과 Cho, 2002). 국내외적으로 균핵병 의 방제를 위해 다양한 농약을 이용한 방제 연구가 많이 이루어져 왔으나, 잔류농약 문제와 친환경농산물에 대한 수요가 급증함에 따라 화학적 방제를 대신할 다양한 방 법들이 연구되고 있다. 이와 관련하여 생물학적 방제에 대한 관심과 연구가 증가하고 있는 추세이다(Bardin과 Huang, 2001). 국내에서도 상추 균핵병의 방제를 위한 길 항세균의 선발과 방제효과에 대한 보고가 있다(Kim 등, 2004; Hwang 등, 2006). 본 연구는 상추 시설재배지 토 양으로부터 상추 균핵병에 대한 길항미생물을 분리선발 하여 상추 균핵병에 대해 생물학적 방제제로서의 가능성 을 탐색하고자 수행되었다.

*Corresponding author

Phone) +82-2-2210-2664, Fax) +82-2-2210-2838 Email) [email protected]

Research Article Open Access

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재료 및 방법

길항세균의 분리 및 선발. 상추 균핵병에 대하여 길항 력을 나타내는 세균을 분리하기 위해 2007년부터 2008년 에 걸쳐 매년 초봄에 균핵병이 발생한 경기도 남양주시 관내 겨울철 상추 시설재배지에서 상추 근권부 토양을 채 취하였다. 채취한 토양을 그늘진 곳에서 1일간 풍건한 다 음, 토양 50 g을 멸균증류수 500 ml와 혼합하여 1시간 진 탕하였다. 진탕 후 30분간 정체 후 상청액 1 ml을 10⁻⁷까 지 희석한 후, 그 희석액을 nutrient agar(NA)배지에 0.1 ml 씩 도말하여 3일간 배양하였다. 평판배지에서 형성된 세 균 균총의 색과 형태적 특징에 따라 선발된 세균을 single colony 순수 분리하여 각 균주별로 균핵병균에 대한 길항 력을 조사하였다. 분리된 196개 균주를 tryptic soy agar (TSA)배지와 NA배지에서 균핵병균과의 대치배양(dual culture)하여 균사생육억제력을 나타내는 세균을 선발하였 다. 대치배양실험은 25^oC, 암조건에서 7일간 배양하였다.

순수 분리된 세균 균주는 0.2 ml의 살균된 75% glycerol 과 nutrient broth(NB) 액체배지에서 150 rpm으로 28ôC, 24시간 배양한 세균배양액 0.75 ml을 혼합하여 −80ôC에 서 보관하였다. 글리세롤 보관균주를 본 실험에 사용할 경우 상온에서 녹인 후 백금이를 이용하여 NA배지에 도 말하고 28ôC에서 2일간 배양하여 사용하였다.

선발된 길항세균의 동정. 순수분리 된 196개 균주 중 대치배양실험을 통하여 길항력효과가 인정되는 26개 균 주들에 대하여 16S rDNA 염기서열분석을 통하여 균을 동정하였다. 16S rDNA증폭을 위해 universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'- AGG GAG GTG ATC CAG CCG C-3') primer를 사용하 였다. PCR 반응조건은 predenaturation을 95ôC에서 5분, denaturation을 94ôC에서 45초, annealing을 55ôC에서 45초, elongation을 72ôC에서 90초간 진행하여 30회 반복한 후 final extension을 72ôC에서 10분간 실시하였다. PCR 증폭 산물은 전기영동하여 확인한 후 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 (주)Macrogen에 의뢰하여 16S rDNA 염기서열을 결정하였고, 결정된 염기서열은 NCBI의 미생물 database (BLAST)에 등록된 근연종과 비교를 통하여 계통학적인 위치를 확인하였다. 결정된 16S rDNA 유전자 염기서열 은 표준 미생물과 비교를 통해서 진화적 위치를 결정하 였다. 진화적 거리는 Jukes와 Cantor(1969) 방법을 이용하 여 계산하였고 neighbor-joining 방법(Saitou와 Nei, 1987) 을 이용하여 계통도를 분석하였다. 계통도내 분지의 신뢰 도는 bootstrap 분석을 통해 평가하였다(Felsenstein, 1985).

또한, 계통 발생적 분지도는 maximum-likelihood 방법(Fitch,

1971)과 maximum-parsimony 방법(Felsenstein, 1981)을 추 가로 분석하였다.

상추 균핵병균의 균핵 생존에 미치는 길항세균의 억제 효과. 대치배양을 통해 선발된 26개 균주 중에서 TSA배 지에서 균핵병균과의 대치배양 결과 균사생육억제력을 나 타낸 균주 중 각각 다른 종 10개 균주(Bacillus megaterium DK6, B. cereus C210과 08-1-2, B. muralis 08-2-7, B.

velezensis DK2, Arthrobacter nicotianae 08-3-4, A. oryzae 08-1-5, Pseudomonas fuscovaginae AK6, Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6, Sphingobacterium faecium 08-3-3)를 선발하여 균핵의 생존 및 발아에 미치는 영향을 조사하 였다. 실험에 사용한 균핵은 균핵병에 걸린 상추에서 분 리한 Sclerotinia sclerotiorum을 PDA배지에서 장기간 배 양하면서 형성된 2−7 mm의 다양한 크기의 균핵을 채취 하여 유리병에 모아 5ôC 냉장고에 보관하면서 사용하였 다. 먼저 보관 중인 균핵을 무작위로 골라 거즈주머니 당 20개를 담은 뒤, 직경 10 cm 포트 당 균핵이 들어있는 4개 의 거즈주머니를 4 cm 깊이로 묻은 후 고온고압살균처리 (auto-claved) 한 상토[에버그린, 서울바이오(주)]를 채워 준비한 후 길항 세균의 처리를 위해 tryptic soy broth(TSB) 액체배지에서 150 rpm으로 28ôC, 3일간 배양 한 길항세 균배양액 원액과 멸균증류수로 10배 희석한 세균배양액 으로 포트 당 100 ml씩 처리하였다. 상토에 있는 미생물 의 영향을 제거하기 위해 상토는 고압멸균용 비닐에 담 아 3일 동안 1일 간격으로 121ôC에서 30분간 고온고압살 균처리 하였다. 준비 된 포트에 세균배양액을 처리한 뒤 4주 동안 7일 간격으로 거즈주머니를 꺼내어 균핵을 95%

에탄올에서 90초, 1% 차아염소산나트륨에 7분간 표면살 균하고 streptomycin(스트렙토마이신) 100 μg이 첨가된 PDA 배지에 치상한 후 균핵의 회수율과 생존율을 조사하였다.

본 실험은 2011년 8월부터 9월에 걸쳐 자동 환기가 이루 어지는 온실 내에서 수행되었다.

상추 균핵병에 대한 길항세균의 방제효과 검정. 균핵 병에 감염된 상추에 대한 길항세균의 방제효과를 검정하 기 위해 2011년 4월부터 5월까지 실험을 수행하였다. 대 치배양을 통해 선발된 26개 균주를 사용하였으며, 상추는

‘선풍포찹적축면’(권농종묘)을 사용하였다. 상추종자를 200공 플러그트레이에 파종하여 30일 정도 육묘한 후 유 묘를 직경 10 cm 포트에 이식하여 실험에 사용하였다. 실 험에 사용한 균핵은 균핵병에 걸린 상추에서 분리한 Sclerotinia sclerotiorum을 PDA배지에서 장기간 배양하면 서 형성된 균핵을 채취하여 5^oC 냉장고에서 보관 중인 것 을 사용하였다. 냉장보관 된 균핵을 PDA배지에 발아시 킨 후 발아된 균핵과 PDA배지를 5 mm 크기로 잘라 접

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종원으로 사용하였다. 포트 당 4개의 발아된 균핵과 PDA 조각절편을 200공 플러그트레이에서 뽑아낸 유묘 주변에 대각선 방향으로 접종하고 살균된 상토를 조심스럽게 채 운 후 TSB에서 3일간 배양된 세균배양액을 멸균증류수 로 10배 희석하여 포트 당 100 ml을 처리한 뒤 30일간 재배하면서 상추 균핵병의 발병율을 조사하였다. 처리방 법은 3가지로 접종 직후 1회 처리한 것과 이후 일주일 간 격으로 2회 그리고 3회 처리한 실험구를 대상으로 처리 횟수에 따른 방제효과도 조사하였다. 각 균주별로 처리 당 5반복으로 수행하였고, 무처리는 15반복으로 수행하였 다. 실험에 사용한 균핵의 평균 발아율은 95%였으나 PDA 상에서 발아를 확인한 균핵만을 사용하였음으로 접종원 의 양은 동일하다고 판단하였다. 아울러 상토에 있는 미 생물의 영향을 제거하기 위해 상토는 고압멸균용 비닐에 담아 3일 동안 1일 간격으로 121^oC에서 30분간 고온고압 살균처리 것을 사용하였다. 본 실험은 2011년 4월부터 5월에 걸쳐 자동 환기가 이루어지는 온실 내에서 수행되었다.

결과 및 고찰

길항세균의 분리 및 선발. 2007년부터 2008년에 걸쳐 매년 초봄에 균핵병이 발생한 경기도 남양주시 관내 겨 울철 상추 시설재배지에서 상추 근권부 토양을 채취하여 희석평판법으로 총 196개의 세균 균주를 분리하였다(Table 1). 분리된 196개의 세균 균주를 균핵병균과 대치배양하 여 효과적인 균사생장억제율을 나타내는 26개의 세균 균 주를 선발하였고 선발된 26개의 세균 균주의 균사생장 억 제율은 TSA배지에서는 77.41−97.21%(Table 2)로 나타났 고, 대치배양 결과 억제존(inhibition zone)이 생긴 부분의 균사를 광학현미경으로 관찰한 결과 무처리 대조구의 정 상적인 균사의 형태와 비교해 세포내 공포가 다수 형성 되고 부풀어 오르는 등의 기형적인 형태를 띠는 것을 확 인하였다(Fig. 1). NA배지에서는 74.90−97.21%의 균사생 장 억제율(Table 3)과 더불어 억제존 주변의 균사들에서 역시 TSA배지에서의 경우와 마찬가지로 세포내 공포가 다수 형성되고 부풀어 오르는 등의 기형적인 형태를 나 타냈다. 이와 같은 억제존 주변 균사의 기형적인 형태는 길항미생물의 다양한 길항물질에 의한 전형적인 증상이 다(Sang 등, 2011).

길항세균의 동정. 대치배양을 통해 선발된 26개 세균 의 16S rDNA 염기서열분석 결과를 NCBI의 미생물 database(BLAST)에 등록된 근연종과 비교를 통하여 계통 학적인 위치를 확인한 결과, Firmicutes/Bacillus 속에 속 하는 균주들은 19개였다. Bacillus megaterium이 14개 균주

Table 2. Antifungal activity of the antagonistic bacterial strains against Sclerotinia sclerotiorum on trytic soy agar

Species Bacterial

strain

Mycelial growth

(mm)^a

Mycelial growth inhibition

(%)^b Control 81.6±1.00 −

Bacillus megaterium

AK3-1 13.5±0.26 83.46 AK3-2 14.2±0.08 82.60 AK4-1 14.3±0.23 82.48 AK7-1 13.0±0.14 84.07 C38 13.0±0.13 84.07 C39 13.3±0.19 83.70 CK4 13.0±0.24 84.07 CK5 13.5±0.26 83.46 CK6 14.2±0.16 82.60 CK7 15.0±0.26 81.62 CK8 13.3±0.22 83.70 DK3 14.5±0.21 82.23 DK5 13.3±0.33 83.70 DK6 14.3±0.31 82.48

B. cereus

C210 10.2±0.17 87.50 DK7-1 13.7±0.19 83.21 08-1-2 14.5±0.21 82.23 B. muralis 08-2-7 16.2±1.47 77.41 B. velezensis DK2 13.2±0.15 83.82 Arthrobacter nicotianae 08-3-4 10.3±0.15 87.38 A. oryzae 08-1-5 11.5±0.14 85.91 08-2-1 13.2±0.25 83.82 Pseudomonas fuscovaginae AK6 2.0±1.41 97.21 P. flavescens C34 15.7±2.07 78.10 Sphingobacterium faecium 08-3-3 11.5±0.18 85.91 Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6 7.5±0.21 90.81

aValues are means and standard deviations of six replications.

bInhibition of mycelial growth was determined when mycelia in sterile water controls reached the center of tryptic soy agar plates.

Table 1. Sampling locations and numbers of bacterial strains isolated from rhizosphere soils of lettuce plants grown at the greenhouse fields in Namyangju city, Gyeonggi province from 2008 to 2009

Location Year collected No. of bacterial strain Sinwol 1-ri,

Jingeon-eup

2007 95

2008 52

Ilpae-dong 2007 49

Total 196

(4)

(AK3-1, AK3-2, AK4-1, AK7-1, C38, C39, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, DK3, DK5, DK6), Bacillus cereus가 3개 균주 (C210, DK7-1, O8-1-2), Bacillus muralis 1개 균주(O8-2-7), Bacillus velezensis가 1개 균주(DK2)였다. Actinobacteria/

Arthrobacter 속에 속하는 균주들은 3개였으며, Arthrobacter oryzae가 2개 균주(O8-1-5, O8-2-1), Arthrobacter nicotianae 가 1개 균주(O8-3-4)였다. γ-Proteobacteria에 속하는 균주들 은 Pseudomonas fuscovaginae 1개 균주(AK6), Pseudomonas flavescens 1개 균주(C34), 그리고 Stenotrophomonas maltophilia 1개 균주(O8-2-6)로 총 3개 균주였다. Bacteroidetes 에 속하는 균주로는 Sphingobacterium faecium에 1개 균 주(O8-3-3)가 동정되었다(Fig. 2).

상추 균핵병균의 균핵 생존에 미치는 길항세균의 억제 효과. 대치배양에서 선발된 10개 세균 균주(Bacillus megaterium DK6, B. cereus C210과 08-1-2, B. muralis 08-2-7, B. velezensis DK2, Arthrobacter nicotianae 08-3- 4, A. oryzae 08-1-5, Pseudomonas fuscovaginae AK6, Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6, Sphingobacterium faecium 08-3-3)를 대상으로 여름철 토양내의 상추 균핵 병균의 균핵생존에 미치는 효과를 조사하기 위해 2011년 8월부터 9월에 걸쳐 자동 환기가 이루어지는 온실 내에 서 수행하였다.

실험 균주를 TSB에서 배양한 배양액 원액과 10배 희 석액을 균핵이 들어있는 포트에 처리한 후 4주 동안 7일 간격으로 균핵이 들어있는 주머니를 꺼내 회수율[(포트토 양에 묻은 균핵 개수 대비 분해되지 않은 균핵 개수의 백 분율(%)]과 생존율[(포트토양에 묻힌 균핵 개수 대비 발 아한 균핵 개수의 백분율(%)]을 관찰한 결과 균핵의 회 수율은 40−95%, 생존율은 20−85%를 나타냈다. 특히, Bacillus megaterium DK6와 B. cereus C210의 경우 배양 액의 원액에 대해서 4주 후의 균핵 회수율은 각각 55%, 40%를 나타냈으며, 생존율은 각각 35%, 20%를 나타냈고 Fig. 1. Photographs of mycelial morphology of Sclerotinia

sclerotiorum affected by antagonistic bacterial strains (AK6, C210, DK2, DK6, 08-2-1, 08-2-6, 08-2-7, 08-3-3 and 08-3-4) at 7 days after inoculation on tryptic soy agar on dual culture test.

Each bacterial strain was cultured on tryptic soy agar at the center of the plate, and S. sclerotiorum was cultured on the side of the plate at the same time. Each bacterial suspension was smeared at the center of the plates while 5-day-old mycelial plugs (5 mm in diameter) of S. sclerotiorum was inoculated on the side of the plates.

Table 3. Antifungal activity of the antagonistic bacterial strains against Sclerotinia sclerotiorum on nutrient agar

Species Bacterial

strain

Mycelial growth

(mm)^a

Mycelial growth inhibition

(%)^b Control 71.7±0.58 −

Bacillus megaterium

AK3-1 8.3±5.61 88.42 AK3-2 3.7±1.97 94.84 AK4-1 5.7±2.16 92.05 AK7-1 11.2±5.34 84.38 C38 13.3±1.21 81.45 C39 16.2±1.72 77.41 CK4 14.0±5.33 80.47 CK5 11.7±1.97 83.68 CK6 9.8±4.40 86.33 CK7 3.3±2.34 95.40 CK8 5.5±4.09 92.33 DK3 8.3±3.27 88.42 DK5 10.3±2.07 86.05 DK6 5.0±2.61 93.03

B. cereus

C210 17.7±0.28 75.31 DK7-1 9.7±2.16 86.47 08-1-2 16.3±1.63 77.27 B. muralis 08-2-7 16.2±1.47 77.41 B. velezensis DK2 13.2±8.18 81.59 Arthrobacter nicotianae 08-3-4 18.0±2.61 74.90 A. oryzae 08-1-5 17.8±1.83 75.17 08-2-1 15.5±3.73 78.38 Pseudomonas fuscovaginae AK6 2.0±1.41 97.21 P. flavescens C34 15.7±2.07 78.10 Sphingobacterium faecium 08-3-3 16.8±2.71 76.57 Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6 12.2±1.33 82.99

aValues are means and standard deviations of six replications.

bInhibition of mycelial growth was determined when mycelia in sterile water controls reached the center of nutrient agar plates.

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(Table 4), 10배 희석액에 대해서도 조사한 결과에서도 유 사한 결과를 나타내(Table 5) 다른 균주들에 비해 균핵의

생존과 발아억제에 효과가 있는 것으로 나타났다. 실험에 사용된 균핵의 평균 생존율(발아율)은 95%로 TSB 용액 Fig. 2. Neighbor-joining tree of the 26 antagonistic bacterial strains based on phylogenetic analysis of the 16S rDNA gene sequences.

The tree was constructed from evolutionary distance matrix by using neighbor-joining method (Saitou and Nei, 1987). Bold circles indicate that the corresponding nodes were also recovered in the trees generated with the maximum-likelihood (Fitch, 1971) and maximum-parsimony (Felsenstein, 1981) algorithms. Bootstrap values (expressed as percentages of 1000 replications) of >50% are shown at branch points.

(6)

과 물을 처리한 대조구에서 균핵의 회수율은 각각 90%

와 95%이고, 생존율은 80%와 85%로 미생물처리에 의한 균핵 회수율과 생존율의 효과는 인정된다고 판단된다.

Fernando 등(2005)은 1차 전염원인 균핵의 토양 내 밀 도가 감소할수록 균핵병을 효과적으로 방제할 수 있다고 하였고, 따라서 여름철 균핵상태로 월하하는 균핵을 대상

으로 길항미생물을 처리하여 균핵의 생존율을 낮출 수 있 다면 균핵병 방제에 효과적일 것으로 판단된다. 따라서 향후 상추 균핵병이 상습적으로 발생하고 있는 포장을 대 상으로 효과가 인정되는 길항미생물을 여름철에 처리한 후 늦가을부터 초봄의 발생상황을 조사할 필요가 있다.

상추 균핵병에 대한 길항세균의 방제효과 검정. 선발 Table 4. Recovery and viability of sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum in drenching application of the fermentation broths of bacterial strains into pot soil buried with sclerotia in the greenhouse for 30 days

Treatment

Days after application of bacterial culture broth (×1)

7 days 14 days 21 days 28 days

Recovery of sclerotia

(%)

Viability of sclerotia

(%)

Control (TSB) 100 90 90 80 95 85 90 80

Control (Water) 100 90 95 80 95 85 95 85

Arthrobacter nicotinae 08-3-4 95 80 90 75 80 75 85 70

A. oryzae 08-1-5 100 70 90 70 80 65 85 75

Bacillus cereus C210 100 50 70 40 60 35 40 20

B. cereus 08-1-2 100 90 85 75 90 80 90 80

B. megaterium DK6 100 40 65 45 60 40 55 35

B. velezensis DK2 100 80 100 80 90 70 85 75

B. muralis 08-2-7 95 80 100 85 100 90 90 85

Pseudomonas fuscovabinae AK6 85 45 75 40 65 60 70 60

Sphingobacterium faecium 08-3-3 100 70 90 85 90 75 80 65

Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6 95 75 90 80 85 70 80 70

Table 5. Recovery and viability of sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum in drenching application of the 10-fold dilutions of the fermentation broths of bacterial strains into pot soil buried with sclerotia in the greenhouse for 30 days

Treatment

Days after application of bacterial culture broth (×10)

7 days 14 days 21 days 28 days

(%)

Control (TSB) 100 90 90 80 95 85 90 80

Control (Water) 100 90 95 80 95 85 95 85

Arthrobacter nicotinae 08-3-4 100 80 95 75 80 65 90 75

A. oryzae 08-1-5 100 80 85 75 95 80 85 80

Bacillus cereus C210 100 55 75 40 65 45 50 25

B. cereus 08-1-2 100 85 90 75 90 80 95 75

B. megaterium DK6 95 55 75 45 70 35 55 35

B. velezensis DK2 100 85 90 70 95 75 90 80

B. muralis 08-2-7 95 85 90 75 90 80 95 80

Pseudomonas fuscovabinae AK6 95 55 80 40 75 70 85 75

Sphingobacterium faecium 08-3-3 90 75 85 70 90 80 75 75

Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6 100 80 95 85 90 80 85 80

(7)

된 길항세균의 길항효과 검정을 위하여 균핵병균의 접 종원의 형태 및 접종량과 접종방법에 대한 예비실험을 2010년 1월부터 5월에 걸쳐 수행하였다. 상추종자를 200 공 플러그트레이에 파종하여 30일 정도 육묘한 후 유묘 를 직경 10 cm 포트에 이식할 때 PDA배지에 발아시킨 균핵과 PDA배지를 5 mm 크기로 잘라 플러그트레이에서 뽑아낸 상추묘의 뿌리주변에 대각선 방향으로 4개를 접 종한 후 살균된 상토를 조심스럽게 채운 후 온실에 보관 하면서 발병과정을 조사한 결과, 접종 후 6일부터 지상부 의 시들음 증상이 가시적으로 나타났으며, 접종 후 12−

15일부터 일부 식물체가 시들어 죽기 시작하여 30일 전 후로도 발병이 관찰되어 길항미생물에 의한 효과검정에

적절한 접종형태 및 방법이라고 판단되어 본 실험에 사 용하였다. 실험은 4회에 걸쳐 매번 30반복으로 수행하였 다(자료 미제출).

선발된 26개의 균주를 대상으로 실험한 결과 Bacillus megaterium CK6, DK3, DK5 그리고 DK6, B. cereus C210와 08-1-2, Arthrobacter oryzae 08-1-5와 08-2-1, A.

nicotianae 08-3-4 등의 9개 균주가 상추 균핵병에 대해 방제효과가 있음을 확인할 수 있었다. 대조구에서는 상추 에 균핵병균의 균핵을 접종한 지 7일째부터 병이 발생하 기 시작하여 12일째에 80%의 발병율로 병이 진전되었다.

그러나 이들 9개 균주는 3회 처리시 6, 7일째 병이 발생 하였으나 30일째까지 20%의 발병율을 나타냈다(Table 6

Table 6. Disease incidence of sclerotinia rot of lettuce with drenching treatment of 26 antagonistic bacteria strains against Sclerotinia sclerotiorum at 30 days after inoculation

Species Bacterial strain Disease incidence (%)^a on soil drench of bacterial culture broth (×10)^b One application Two application Three application

Control − 80 80 80

Bacillus megaterium

AK3-1 60 60 60

AK3-2 80 40 60

AK4-1 20 40 40

AK7-1 60 60 60

C38 80 100 60

C39 60 60 40

CK4 40 40 40

CK5 60 60 80

CK6 20 40 20

CK7 20 40 40

CK8 80 40 40

DK3 40 40 20

DK5 40 20 20

DK6 20 20 20

B. cereus

C210 40 20 20

DK7-1 60 40 60

08-1-2 40 40 20

B. muralis 08-2-7 60 60 80

B. velezensis DK2 40 40 60

Arthrobacter nicotianae 08-3-4 20 20 20

A. oryzae 08-1-5 60 40 20

08-2-1 20 20 40

Pseudomonas fuscovaginae AK6 40 60 60

P. flavescens C34 60 60 60

Sphingobacterium faecium 08-3-3 80 60 60

Stenotrophomonas maltophilia 08-2-6 80 60 40

aOn drench application, disease incidence was evaluated for 30 days after artificial inoculation.

bThe fermentation broths were drenched 1−3 times at 7-day interval after planting lettuce in the pot.

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와 Fig. 3). Bacillus megaterium은 Rhizoctonia solani에 의 한 콩 뿌리썩음병(Zheng과 Sinclair, 2000), Meloidogyne graminicola에 의한 벼 선충병(Padgham 등, 2007), 벼 잎 집무늬마름병(Chumthong 등, 2008), Fusarium oxysporum 에 의한 토마토 뿌리썩음병(Omar 등, 2006)에 대한 생물 적 방제효과가 보고되었다. Bacillus cereus는 kanosamine, zwittermycin A 등과 같은 항생물질을 생산하는 것으로 알 려져 있으며(Stabb 등, 1994; Silo-Suh 등, 1994), Phytophthora medicaginis에 의한 알팔파 모잘록병(Handelsman 등, 1990), 완두에 대한 균핵병의 방제 등이 연구되었다(Onaran과 Yanar, 2011). B. cereus의 대사산물이 균핵병의 균사생장 과 자낭포자의 발아를 억제한다고 보고되었다(Bardin과 Huang, 2001). 그러나 B. cereus는 인축에 대하여 식중독 유발에 대한 문제가 알려져 있어 향후 상추 균핵병 방제 를 위해 사용하기에는 어려움이 있을 것으로 판단된다.

Arthrobacter sp.의 경우 바나나 fusarium 시들음병에 대한 방제 효과(Saravanan 등, 2003) 및 chitinase 생성에 의한 Fusarium roseum의 세포 분해에 의한 억제효과에 대한 보고가 있다(Morrissey 등, 1976). 따라서 본 연구결과 상추 균핵병균에 대하여 길항력이 인정되는 균주들을 활 용한 생물학적 방제의 가능성에 대한 추가적인 실험이 기대된다.

요 약

상추 균핵병균에 대하여 길항력을 나타내는 세균을 분 리하기 위해 2007년부터 2008년에 걸쳐 초봄에 경기도 남양주시 관내 상추 시설재배지에서 균핵병이 발병한 포 장의 토양을 수집하였다. 수집한 토양을 희석평판법을 이 용하여 총 196개의 세균을 분리하였고, 분리한 세균을 실 험실에서 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum)과의 대치배양 을 통해 균사생장억제율이 80% 내외로 우수한 길항력 을 나타내는 26개 균주를 선발하였다. 선발된 26개 균 주를 16S rDNA염기서열분석으로 동정한 결과 Bacillus megaterium, B. cereus, B. muralis, B. velezensis, Arthrobacter nicotianae, A. oryzae, Pseudomonas fuscovaginae, P.

flavescens, Stenotrophomonas maltophilia, Sphingobacterium faecium으로 동정되었다. 길항세균의 균사생장억제율이 높 게 나타낸 10개 균주를 대상으로 여름철 포트실험을 통 해 균핵 생존에 미치는 영향을 조사한 결과 B. cereus (C210)와 B. megaterium(DK6)이 각각 20%와 35%의 균 핵 생존율을 나타냈다. 겨울철에 온실 내에서 포트실험을 통해 상추 균핵병에 대해 방제효과를 조사한 결과 대조 구가 80%의 발병율을 나타냈으나, 26개 균주 중 9개 균 주가 20% 정도의 발병율을 나타내 향후 상추 균핵병의 Fig. 3. Control effects of the antagonistic bacterial strains at 30 days after inoculation with Sclerotinia sclerotiorum. Bacillus megaterium (CK6, DK5 and DK6), B. cereus (C210 and 08-1-2), Arthobacter oryzae (08-1-5 and 08-2-1) and A. nicotianae (08-3-4). T1: one drenching application; T2: two drenching application; T3: three drenching application at 7-day interval.

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생물적 방제를 위한 길항세균으로서의 활용가치가 기대된다.

Acknowledgement

This work was supported by the 2011 sabbatical year research grant of the University of Seoul.

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