Inhibition of Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes by Different Enzymatic Hydrolysates of Dried Red Sea Cucumber Stichopus japonicus

(1)

707 Copyright © 2020 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

서 론

현대사회는식생활의서구화

,

^{생활환경의}^변화^및^가공식품 증가에따른과다영양섭취와신체활동량의감소로인해비만 인구가급증하고있다

(Kim et al., 2017).

비만이란

,

에너지섭 취가소비를초과하는에너지불균형에의해지방세포수및세 포내지질의크기를증가시킴으로써인체내지방이과도하게 축적되어나타나는현상이다

(Hwang et al., 2019).

^또한

,

^비만 은비만자체로도심각한문제가되지만고혈압

,

제

2

형당뇨

,

고지혈증

,

관절염등과같은만성퇴행성질환을유발하는주 요원인으로알려지면서심각한질환으로인식되고있다

(Lee et al., 2017).

^따라서

,

^{대사질환을}^야기하는^비만을^예방^및^치 료를위한약물개발의연구가계속되고있으며비만치료제시 장은점차증가하고있다

.

유통되고있는비만치료제인제니칼

(xenical)

은지방의흡수를떨어뜨리는역할을하지만지방변

,

배변실금등을유발한다는보고가있어사용에제한이크며

,

시부트라민

(sibutramine)

^의^경우^심혈관계^부작용을^나타나는 사례가있어처방및판매가금지되었다

(Jun et al., 2004).

이처

건조 방법에 따른 홍해삼(Stipchopus japonicus) 효소 가수분해물의 지 방 축적 억제 효과

김서영 ^1,2 ·오재영 ^2,3 ·김은아 ⁴ ·허수진 ⁴ ·김길남 ¹ ·전유진 ² *

1한국기초과학지원연구원 춘천센터, ²제주대학교 해양생명과학과, ³국립수산과학원 식품위생가공과, ⁴한국해양과학기술원 제주연구소

Inhibition of Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes by Different En- zymatic Hydrolysates of Dried Red Sea Cucumber Stichopus japonicus

Seo-Young Kim

^1,2

, Jae-Young Oh

^2,3

, Eun-A Kim

⁴

, Soo-Jin Heo

⁴

, Kil-Nam Kim

¹

and You-Jin Jeon

²

*

1Chuncheon Center, Korea Basic Science Institute (KBSI), Chuncheon 24341, Korea

2Department of Marine Life Science, Jeju National University, Jeju 63243, Korea

3Food Safety and Processing Research Division, National Institute of Fisheries Science, Busan 46083, Korea

4Jeju International Marine Science Center for Research & Education, Korea Institute of Ocean Science & Technology (KIOST), Jeju 63349, Korea

Red sea cucumber Stichopus japonicus , was dried using three methods-far-infrared ray, vacuum, and freeze drying and then enzymatically hydrolyzed using nine proteases: Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Neutrase, Protamex, trypsin, α-chymotrypsin, and papain. In addition, the potential ability of hydrolysates to inhibit lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes was evaluated. The yield of hydrolysates from red sea cucumbers dried using each method was higher than that of the distilled water extract, and protein contents were either similar or higher. The hydrolysates that exhibited inhibitory effects on lipid accumulation, as demonstrated via Oil red O staining, were those obtained by far-infrared ray drying coupled with Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, or Neutrase treatment. In addition to the advantages of far-infrared drying and the characteristics of Flavourzyme, the Flavourzyme hydrolysate of far-infra- red-dried red sea cucumber showed the highest inhibitory effect on lipid accumulation. In addition, this hydrolysate significantly decreased the expression of the protein factor fatty acid–binding protein 4, which is related to the late differentiation of 3T3-L1 adipocytes. Taken together, these results suggest that Flavourzyme hydrolysates from far- infrared-dried red sea cucumber may be used as a functional food and/or a pharmaceutical ingredient for the inhibi- tion of lipid accumulation.

Keywords: Lipid accumulation, Adipocyte, Red sea cucumber, Far-infrared ray drying, Enzymatic hydrolysis

*Corresponding author: Tel: +82. 61. 380. 8668 Fax: +82. 64. 754. 3493 E-mail address: [email protected]

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Received 19 May 2020; Revised 10 June 2020; Accepted 9 September 2020 저자 직위: 김서영(박사후연구원), 오재영(연구사), 김은아(선임연구원), 허수진 (책임연구원), 김길남(책임연구원), 전유진(교수)

https://doi.org/10.5657/KFAS.2020.0707

Korean J Fish Aquat Sci 53(5), 707-716, October 2020

(2)

럼인공적으로합성된의약품의부작용을최소화하기위해최 근에는천연물로부터비만예방및치료제개발의필요성이요 구되고있다

.

지방전구세포는분화를거쳐지방세포로되는과 정에서세포의형태적변화와유전자발현등의생화학적변화 를통해체내에지방을축적하게된다

(Kim et al., 2017).

지방 전구세포는

insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-methylxantine

(IBMX)

등의분화유도인자를첨가하였을때지방세포로분화

하게되는데이러한분화과정은분화유도인자에의해분화초 기전사인자와분화후기전사인자의발현을유도하게되고지 방세포로의지방세포형성분화조절이이루어지게된다

(Kim et al., 2017).

^따라서

,

^지방세포^{분화과정에서의}^분화^초기^및 분화후기전사인자의발현을조절할수있는천연물질을찾는 것이핵심이다

.

최근해양생물자원에서유래된새로운생리활성물질에관한 연구는전세계적으로증가하고있다

.

또한

,

다양한구조와생리 활성의특이성을가지고있어연구및개발에많은관심이집중 되고있다

.

생체활성펩타이드는단백질의효소분해에의해생 성되며장의소화과정을거쳐잠재적인생리활성물질로작용 할수있다

(Ko et al., 2013).

때문에광어

,

미더덕

,

해마등해양 생물유래가수분해물과이로부터분리된펩타이드의다양한

생물학적기능에관한연구가활발히진행되고있다

(Ko et al.,

2012; Ko et al., 2013; Ko and Jeon, 2015; Kim et al., 2016;

Kim et al., 2019).

그예로

Park et al. (2011)

은홍어껍질로부터 피부세포의결합조직을구성하는주요성분인콜라겐분해에 관여하는

matrix metalloproteinase (MMP)

특히

,

주름형성에 관여하는

MMP-1

^즉

, collagenase-1

^의^활성을^저해하는 ^펩타 이드인

Leu-Asp-Val-Leu-Glu-Val-Phe

를분리하였다

.

그리고

, Ko et al. (2012)

은미더덕살

(tissue)

부위로부터효소가수분해 한뒤

Ala-His-Ile-Ile-Ile

펩타이드를얻었는데이펩타이드는 체내체액의양을조절함으로써혈압을조절하는

renin-angio- tensin

^시스템의^중심^성분인

Angiotensin-converting enzyme

(ACE)

을억제시키는효능을나타낸다

.

이외에도광어근육으

로부터얻은펩타이드

Val-Cys-Ser-Val (VCSV)

과

Cys-Ala- Ala-Pro (CAAP)

는

1,1-diphenyl-2-picrylhydrzayl (DPPH)

자 유라디칼을소거하며세포내에서산화적스트레스에의해발 생하는세포내활성산소와세포사멸을억제시키는것으로밝 혀졌다

(Ko et al., 2013).

해삼

(Stichopus japonicas)

^은^한국

,

일 본등아시아일대에서자생하고있는돌기해삼과의한종으로 무척추동물로서유연하고길쭉한모양의몸체를나타내며아시 아에서식용및약용으로이용되어왔다

(Jeon et al., 2018).

해삼 은녹색

,

^흑색^및^적색의^세^가지로^분류되며^적색을^띄는^홍해 삼

(red sea cucumber)

은일반적으로해안에서자갈과같은독 특한서식지에서발견되며다른색의해삼과다른유전체및색 소체가관찰된다

(Ding et al., 2018).

선행연구에따르면홍해삼 의특유한특징으로항산화

,

항염

,

항암

,

항균

,

멜라닌생성억제

,

주름개선등의다양한기능성을나타낸다고보고되었다

(Liu et

al., 2012; Park et al., 2012; Jeon et al., 2017; Ding et al., 2018;

Jeon et al., 2018).

또한

,

해삼의주성분이단백질로알려져있 으나단백질성분의기능성에관한보고는미비하고

,

주로에탄 올추출물의효능에관한연구가보고되었다

.

또한

,

제주산홍 해삼의종묘생산기술은

2006

년부터가능하였지만제주도에서 양식하는홍해삼의기능성

,

^{유용성분의}^함량^등에^관한^연구가 미흡한실정이다

.

따라서

,

본연구에서는제주도특화홍해삼으 로부터단백질효소가수분해방법을이용하여얻은다량의단 백질이함유된가수분해물의지방세포분화과정에서지방축적 억제와분화초기및분화후기전사인자의단백질발현에미치 는영향을조사하였다

.

재료 및 방법

실험 재료

본 실험에 사용된

Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BS), penicillin/streptomycin (P/S), phosphate buffered sa- line (PBS), EDTA-trypsin

은

Gibco-BRL (Burlington, ON,

Canada)

에서구입하였으며

,

상업용식품단백질분해효소인

Alcalase 2.4 L FG, Flavourzyme 500 MG, Kojizyme 500 MG, Neutrase 0.8 L, Protamex

는

Novo Co. (Novozyme Nordisk, Bagasvaerd, Denmark)

에서 구입하였고

, pepsin, trypsin, a- chymotrypsin, papain

단백질분해효소와

insulin, dexametha- sone, IBMX, Oil red O, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoluim Bromide (MTT)

^는

Sigma-Aldrich Co.

(St. Louis, MO, USA)

에서구입하여사용하였다

.

단백질발현 에사용된

anti-SREBPc-1, anti-FABP4, anti-GAPDH

는

Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)

에서구입하여사 용하였다

.

이외에사용된다른화학물질과시약은분석등급 을사용하였다

.

홍해삼 재료 및 효소 가수분해물 제조

본실험에사용된홍해삼은한국해양과학기술원제주연구소 의제주특성연구센터로부터제공받았으며

,

흐르는물로수세 하여염분과협잡물을제거하고

,

원적외선

,

진공및동결건조 등세가지방법으로건조하여사용하였다

.

^세^가지^방법으로^건 조된홍해삼은가수분해전분쇄기로균질화시켜효소가수분 해를하였다

.

홍해삼의효소가수분해는

Ko et al. (2012)

의방 법에따랐다

.

홍해삼분말을증류수에넣고효소에대한기질 의비율을

100:1

로하여식품단백질가수분해효소인

Alcalase 2.4 L FG, Flavourzyme 500 MG, Kojizyme 500 MG, Neutrase 0.8 L, Protamex

와소화효소

pepsin, trypsin, α-chymotrypsin,

papain

을각각첨가하여각효소의반응최적조건에서

24

시간

동안반응시켰다

.

각효소의최적조건은다음과같다

: Alcalase,

pH 8.0, 50°C; Flavourzyme, pH 7.0, 50°C; Kojizyme, pH 6.0,

(3)

40°C; Neutrase, pH 6.0, 50°C; Protamex, pH 6.0, 40°C; pepsin, pH 2.0, 30°C; trypsin pH 8.0, 37°C; α-chymotrypsin, pH 8.0, 37°C; papain, pH 8.0, 37°C.

그후

,

가수분해물을

pH 7.0

으로 조정하고

,

효소반응을불활성화시키기위하여

100°C

에서

10

분간가열하였다

.

그리고

,

물추출물의제조를위하여홍해삼 분말을증류수에넣고

24

^시간^동안^상온에서^교반하여^추출하 였다

.

각효소가수분해물과물추출물의잔류물을제거하기위 하여

3,000 g, 4°C

^에서

20

분동안원심분리하여잔사를제거

한상층액을취한후감압여과하여동결건조후

-20°C

에보

관하였다

.

수율 측정 및 일반성분 분석

수율은홍해삼으로부터유효성분을제조방법에따라획득한 다음양을

%

로계산하였다

.

단백질함량은

Lowry method

로분 석하였고

,

당함량은

phenol sulfuric acid method

를이용하여 측정하였다

.

황산기함량은

Saito et al. (1968)

이제시한

BaCl

₂

/ gelation

^방법을^이용하여^{분석하였다}

.

세포 배양 및 지방세포 분화

마우스유래

3T3-L1

전지방세포주는

American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)

에서분양받아사용 하였으며

10% BS

과

1% P/S

을포함하는

DMEM

배지를이용 하여

1×10

⁵

cells/mL

^로^분주^후

confluent

^상태가^될^때까지

37°C

를유지하는

CO

₂

incubator

에서배양하였다

.

분화유도는 다음과같이

8

일동안

2

일간격으로배지를교체하면서시행하 였다

.

분화유도첫째날

(day 0)

에는

MDI (0.5 mM IBMX, 0.25 µM dexamethasone, 5 µg/mL insulin)

가함유된분화유도배 지

(10% FBS, 1% P/S

^의

DMEM

^배지

)

^로^{교체하였고}

, 2

^일^동안 배양하였다

.

그후

, 10% FBS

와

1% P/S, 5 µg/mL insulin

이함 유된

DMEM

배지로교체하였고

(day 2), 2

일동안배양하였다

.

다시

10% FBS

와

1% P/S

이함유된

DMEM

배지로

2

일간격으 로교체하여

4

일동안더배양하였다

.

세포 독성 평가

세포를

1×10

⁵

cells/mL

농도로하여

24 well plate

에분주하 고

16

시간경과후

,

건조방법별홍해삼효소가수분해물을처 리하고

48

시간동안배양하였다

.

세포독성은

MTT

방법을이 용하여실험하였다

. MTT

용액

100 µL (2 mg/mL in PBS)

를첨 가하여

4

^시간^동안^{반응시켰다}

.

^이후^상층액을^완전히^제거하 고

dimethyl sulfoxide (DMSO)

를가하여침전물을완전히용

해시킨후

540 nm

에서흡광도를측정하였다

.

Oil red O staining을 활용한 세포 내 지방 염색

분화유도첫날부터건조방법별홍해삼효소가수분해물을

8

^일^동안

2

^일^간격으로^분화^유도^배지^교체와^함께

4

^회^처리

한후지방세포내의지방축적정도를확인하기위하여세포 내지방방울

(lipid droplet)

을선택적으로염색하는

Oil red O

staining

^을^{실시하였다}

.

^분화된^{지방세포의}^상층액을^제거한^후

PBS

로세척하고

10% formalin

첨가하여

1

시간세포고정하였 다

.

고정한세포를증류수로

3

회세척후마지막으로

60% iso- propanol

로세척하고

well

을완전히건조시킨후

Oil red O

용 액

(0.5 g in 100 mL isopropanol)

으로

2

시간동안염색하였다

.

이후염색용액을완전히제거하고증류수로

4

^회^{세척하였다}

.

염색후지방세포분화정도를

CoolSNAP-Pro color digital camera

로확인하였으며

, 100% isopropanol

을가하여염색된

Oil red O

를완전히용해시킨후

520 nm

에서흡광도를측정 하였다

.

Western Blot 분석

세포를

ice cold-PBS

로

2

회세척한후

lysis buffer (20 mM Tris, 5 mM EDTA, 10 mM Na

₄

P

₂

O

₇

, 100 mM NaF, 2 mM Na-

3

VO

₄

, 1% NP-40, 10 mg/mL Aprotinin, 10 mg/mL Leupeptin, 1 mM PMSF)

로

1

시간동안

4°C

에서균질화하고

14,000 g, 4°C

^에서

20

^분^동안^원심분리^하여^상층액을^{분리하였다}

.

^상층 액의단백질농도를

Pierce

^TM

BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MD, USA)

로정량하여

30 µg

의 단백질을

10%

의

sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

로분리하고

, nitrocellulose (NC) membrane

^으로^{이동시켰다}

. NC membrane

^은

5% nonfat dry milk

함유

TBS-T (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2.65 mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)

로상온에서

2

시간동안반응하 여비특이적인단백질들에대한

blocking

을실시하였다

.

그후

, 1

차

antibody (SREBPc-1, FABP4)

를

blocking buffer

에희석 하여

4°C

^에서

overnight

^하였다

. TBS-T

^로

20

^분간

3

^회^세척한 후

2

차

antibody

를

blocking buffer

에희석하여실온에서반응 시켰다

. TBS-T

로

20

분간

3

회세척하고

ECL

용액

(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)

에반응시켜단백질의발현정도 를

eVo-6 camera

가장착된

FUSION Solo6S program (Vilber Lourmat, Marne-La-Vallée, France)

^으로^{분석하였다}

.

통계 분석

실험결과의통계처리는각각의시료에대한평균

±

표준편차 로나타내었다

. SPSS

프로그램

(Ver. 12.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)

을사용하여

One-way ANOVA-test

를실시하여조 사항목들간의유의성검증은

Turkey’s multiple range test

^로

*P<0.05

및

**P<0.01

수준에서실시하였다

.

결과 및 고찰

건조 방법별 홍해삼 효소가수분해물의 수율 및 일반 성분

가수분해효소는다양한생물체로부터생물학적으로활성이 풍부한수많은천연물을추출하는데적용되어왔다

(Ding et al.,

(4)

2018).

^단백질^가수분해^효소는^아미노산^또는^펩타이드^혼합 물을만드는효소이며일반적으로단백질가수분해효소를이 용하여시료를가수분해하였을때효소양과가수분해시간에 비례하여증류수추출물에비해높은수율과단백질함량을나 타냄을확인할수있다

(Kim et al., 2016).

또한

,

다양한단백질 효소가수분해로부터잠재적인생리활성펩타이드가생성되며 이들은식품의장내소화과정동안생리조절인자로작용할수 있다

.

따라서

,

단백질효소가수분해물과이로부터생성되는펩 타이드의항산화및항고혈압등의생리활성에대한연구가보 고되고있다

(Ko et al., 2012).

또한

,

최근해조류또는해양생물 의효소가수분해물로부터새로운기능성단백질이나생리활성 펩타이드를분리하고있으며

,

이들로부터새로운기능성천연 물소재를찾으려노력하고있다

(Samarakoon and Jeon, 2012;

Kim et al., 2016; Je et al., 2019).

해삼은 단백질 함량이 높고 지방 함량이 적으며 트립토판

(tryptophan),

^아르기닌

(arginine),

^라이신

(lysine)

^과^같은^필수 아미노산이 풍부하다고 알려져 있고

,

해삼의 체벽 단백질의 약

70%

는불용성콜라겐섬유로구성되어있는데

,

이콜라겐 은피부와뼈의결합조직에서중요한구조단백질이다

(Park et al., 2012; Lee et al., 2014).

또한

,

콘드로이틴황산

(chondroitin sulfate)

^이^풍부하게^함유되어^있는^것으로^알려져^있다

(Park et al., 2017).

홍해삼은제주지역의해양특산물로주로제주해역 에서만서식하여생산량이매우적지만일반해삼보다크기가

크고사포닌

(saponin),

콘드로이틴황산과같은영양성분을많

이포함하고있다고알려져있다

(Choi, 2017).

따라서

,

홍해삼 의주요성분인단백질을효율적으로얻고자본연구에서는단 백질분해효소를이용하여제주산홍해삼을가수분해하고

,

이 로부터얻은가수분해물이지방세포분화과정에미치는영향 을분석하고자하였다

.

먼저

,

홍해삼의효소가수분해를위하여산업적으로사용하 고있는

9

^가지의^단백질^분해^효소

Alcalase, Flavourzyme, Ko- jizyme, Neutrase, pepsin, Protamex, trypsin, α-chymotrypsin,

papain

과증류수를이용하여추출하였으며

,

건조방법별홍해

삼효소가수분해물의수율은

Table 1

과같다

.

원적외선건조

,

진공건조

,

동결건조홍해삼효소가수분해물중원적외선건조 홍해삼

Protamex

^{가수분해물과}^동결^건조^홍해삼

Kojizyme

^가 수분해물을제외한모든가수분해물에서

70%

이상의높은수 율을나타내었다

.

특히

,

진공건조홍해삼

Alcalase

효소가수분

해물이

91.5%

의가장높은수율을나타내었고

,

이외에도원적

외선및동결건조홍해삼

Alcalase, Neutrase, pepsin, trypsin, α-chymotrypsin

^{가수분해물과}^진공^건조^홍해삼

pepsin

^가수분 해물이

80%

이상의높은수율을나타내었다

.

그리고

,

증류수추

출물의수율은

Table 1

에서나타낸것과같이원적외선건조홍

해삼은약

60.50%,

진공건조홍해삼은약

49.00%,

동결건조홍

해삼은약

56.75%

를보였고

,

각건조방법별가수분해물이물

추출물보다수율이높았다

.

홍해삼의 주요성분인 단백질 함량을 측정하기 위하여

Lowry method

를 이용하여 측정하였고

,

그 결과는

Table 1

에 나타내었다

.

원적외선 건조홍해삼효소가수분해물중에 서는

α-chymotrypsin

가수분해물이 가장 높은단백질 함량

(

약

37.12%)

을나타내었고

,

이는물추출물의단백질함량

(

약

26.05%)

^와^{비교하였을}^때^약

1.42

^배^높다

.

^그리고

, Alcalase

^가 수분해물을제외한

8

종의효소가수분해물모두물추출물보 다단백질함량이높았다

.

진공건조및동결건조홍해삼효소 가수분해물의경우

9

종의효소가수분해물모두물추출물보다 단백질함량이높았다

.

진공건조의경우약

1.67

배

(Alcalase

가 수분해물

,

^약

26.19%)

^에서^많게는^약

2.32

^배

(trypsin

^가수분해 물

,

약

36.24%)

를나타내었고

,

동결건조의경우약

2.04

배

(Ko- jizyme

가수분해물

,

약

10.48%)

에서많게는약

3.25

배

(trypsin

가수분해물

,

약

34.10%)

를나타내었다

.

다음으로홍해삼의주요생리활성성분으로알려진콘드로이 틴의황산기함량을측정하기위하여당함량과콘드로이틴황 산기함량을측정하였다

.

그결과

,

당함량은

Table 1

에서나타 낸것과같이모든가수분해물에서

3.34%

이상의당함량을나 타내었는데진공건조홍해삼의가수분해물의경우모두물추 출물의당함량

(

약

7.40%)

보다높은당함량을나타내었으며

,

그중에서도

Neutrase

^{가수분해물이}^약

13.08%

^로^가장^높은^당 함량을나타내었다

.

반면

,

원적외선및동결건조홍해삼의가 수분해물에서는진공건조효소가수분해물보다비교적낮은 당함량을나타내었는데원적외선건조홍해삼의가수분해물 중

Flavourzyme (

약

8.37%), Kojizyme (

약

8.86%), Neutrase (

약

8.05%), Protamex (

^약

7.89%), trypsin (

^약

7.08%)

^가수분해 물은물추출물의당함량

(

약

5.94%)

보다높은당함량을나타 내었다

.

하지만

,

동결건조홍해삼의가수분해물은물추출물의 당함량

(

약

4.32%)

과유사하거나낮은당함량을나타내었다

.

콘드로이틴황산기함량의경우

,

모든효소가수분해물에서약

4.51%

^이상의^함량을^{나타내었고}

,

^각^건조^방법별^홍해삼^물^추

출물의함량

(

약

7.41%)

보다낮거나비슷하였다

(Table 1).

이를 통해

9

종의단백질분해효소를이용하여높은수율과단백질 함량을얻은수있는것을확인하였다

.

건조 방법별 홍해삼 효소가수분해물의 지방 축적 억 제 효능

지방세포는에너지항상성유지및지질대사에중요한역할 을하고

,

지방전구세포인

3T3-L1

은다양한호르몬과전사인자 들에의해지방세포로분화되면서세포내지방을생성및축적 한다

(Hwang et al., 2019). Oil red O staining

은지방세포내축 적된중성지방을붉은색으로염색하여세포의붉은색정도로 분화정도를시각화할수있다

(Kim and Jeung, 2019).

따라서

,

지방세포로분화유도된

3T3-L1

에서건조방법별홍해삼효소 가수분해물이지방축적에미치는효과를

Oil red O staining

을 통해관찰하였다

.

먼저

,

건조방법별홍해삼효소가수분해물은

(5)

Fig. 1A-1C

^에^나타낸^것처럼

50 µg/mL

^에서

3T3-L1 cell

^에^대 해유의한독성이확인되지않았다

.

세포생존율에영향을미치 지않는건조방법별홍해삼효소가수분해물을

3T3-L1

세포에 처리하여

Oil red O staining

을통해지방축적을관찰한결과

, MDI

에의해지방세포분화가유도된세포군에서는세포내지 방구형성및생합성에의한축적이관찰되었다

(Fig. 1D-1F).

반면

, MDI

에의해지방세포로분화가유도된세포내지방구

및지방생합성은건조방법별홍해삼효소가수분해물처리군 에서유의하게억제됨을확인하였는데

,

원적외선건조홍해삼 효소가수분해물중

Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Neu-

trase

^{가수분해물이}^유의하게^지방^축적을^억제하는^것을^확인

하였고

, pepsin, protamex, trypsin

가수분해물및물추출물처 리군은

Oil red O staining

후용해물의흡광도측정결과에서지 방축적억제효능을나타내는것으로보였지만

,

광학현미경사 진촬영을통해

8

일동안

4

회처리하면서세포에독성을나타낸

것을확인하였다

(Fig. 1D-1F).

^그리고

,

^진공^건조^홍해삼^효소 가수분해물중

trypsin, papain

가수분해물을제외한모든가수 분해물이유의하게지방축적을억제하는것을확인하였고

,

물 추출물처리군은광학현미경사진촬영을통해

8

일동안

4

회처 리하면서세포에독성을나타낸것을확인하였다

(Fig. 1E).

마 지막으로

,

^동결^건조^홍해삼^효소^{가수분해물}^처리군은

Oil red

O staining

후용해물의흡광도측정결과지방축제억제효능

을나타내는것으로보였지만

,

광학현미경사진촬영을통해

8

일동안

4

회처리하면서모든효소가수분해물및물추출물이 세포에독성을나타낸것을확인하였다

(Fig. 1F).

결과를종합 하여볼때

, 8

^일의^분화^과정^동안^원적외선^건조^홍해삼^효소 가수분해물중

Flavourzyme

가수분해물이세포에독성을미치

지않으며약

70%

정도지방축적을억제하는것을확인하였다

.

원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물이 지 방세포 분화 및 지방생합성 관련 단백질에 미치는 영향

Table 1. Yield and chemical composition of enzymatic hydrolysates of red sea cucumber Stipchopus japonicas dried by three methods Enzymatic hydrolysates

A F K N P Pro T α-chy Pap DW

Drying method Yield (%)

Far-infrared ray drying 86.50±12.83 76.75±

10.35 72.25±

11.77 84.50±

10.83 76.50±

13.53 66.50±

11.41 77.50±

12.12 82.75±

10.35 77.50±

11.41 60.50±

12.83 Vacuum drying 91.50±

12.83 78.50±

10.71 76.50±

17.78 78.00±

11.41 81.00±

10.00 72.50±

12.83 78.75±

10.35 78.50±

10.71 78.25±

10.35 49.00±

10.71 Freeze drying 88.75±

11.06 78.78±

11.77 63.75±

11.77 81.75±

12.47 87.75±

10.35 78.00±

10.70 84.50±

11.41 82.00±

11.41 83.25±

10.35 56.75±

12.47

Drying method Protein contents (%)

10.97 27.02±

10.55 30.00±

10.07 29.95±

10.83 31.12±

10.69 34.59±

10.07 37.12±

10.35 29.61±

13.11 26.05±

11.04 36.15±

10.97 27.51±

11.56 31.41±

11.38 35.27±

12.97 28.58±

11.24 36.24±

12.55 34.05±

10.97 32.05±

11.45 15.60±

10.83 34.59±

11.04 21.46±

10.69 23.85±

11.04 29.80±

12.14 27.02±

10.14 34.10±

13.11 23.22±

11.52 31.66±

11.73 10.48±

12.28

Drying method Carbohydrate contents (%)

11.15 8.86±

11.38 8.05±

11.15 4.32±

10.00 7.89±

10.46 7.08±

10.69 4.97±

10.46 5.45±

10.23 5.94±

12.98 9.35±

10.69 9.19±

15.51 13.08±

10.46 8.21±

11.38 11.46±

10.92 10.65±

11.38 11.95±

12.07 11.46±

10.46 7.40±

10.69 4.80±

10.23 3.67±

10.92 4.32±

10.00 4.15±

10.69 4.48±

10.69 4.15±

10.23 5.29±

11.38 3.34±

10.92 4.32±

12.30

Drying method Chondroitin sulfate contents (%)

10.00 6.79±

10.13 6.41±

10.00 4.51±

10.08 6.79±

10.13 6.44±

10.13 6.35±

10.25 6.44±

10.29 7.15±

10.04 6.58±

10.00 5.99±

10.17 5.55±

10.13 4.69±

10.08 5.58±

10.17 6.14±

10.04 5.64±

10.08 5.64±

10.08 7.41±

10.08 7.35±

10.08 7.26±

10.21 6.79±

10.29 5.58±

10.33 6.53±

10.25 6.50±

10.29 7.47±

10.00 6.56±

10.13 7.46±

10.02 A, Alcalase hydrolysate; F, Flavourzyme hydrolysate; K, Kojizyme hydrolysate; N, Neutrase hydrolysate; P, pepsin hydrolysate; Pro, Prota- mex hydrolysate; T, trypsin hydrolysate; α-chymo, α-chymotrypsin hydrolysate; Pa, papain hydrolysate; DW, Distilled water extract.

(6)

Fig. 1. Effects of enzymatic hydrolysates of red sea cucumber Stipchopus japonicas on cell viability in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 cells were treated with enzymatic hydrolysates (50 µg/mL) of far-infrared ray dried (A), vacuum dried (B), and freeze dried (C) Red Sea cucumber for 48 h and then cell viability was measured by MTT assay. Effects of enzymatic hydrolysates of Red Sea cucumber on adipocytes differentiation in 3T3-L1 cells. Post-confluent 3T3-L1 cells were treated with enzymatic hydrolysates (50 µg/mL) of far-infrared ray dried (D), vacuum dried (E), and freeze dried (F) Red Sea cucumber during adipocyte differentiated for 8 days and then the stained lipid accumulation content was quantified by measuring absorbance. A, Alcalase hydrolysate; F, Flavourzyme hydrolysate; K, Kojizyme hydrolysate; N, Neutrase hydrolysate; P, pepsin hydrolysate; Pro, Protamex hydrolysate; T, trypsin hydrolysate; α-chymo, α-chymotrypsin hydrolysate; Pa, papain hydrolysate; DW, Distilled water extract. Experiments were performed in triplicate and the data were expressed as mean±SE; * P<0.05, and

** P<0.01 as compared to the untreated group.

Inhibition of Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes by Different Enzymatic Hydrolysates of Dried Red Sea Cucumber Stichopus japonicus

707

Copyright © 2020 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

,

(Kim et al., 2017).

,

(Hwang et al., 2019).

,

,

2

,

,

(Lee et al., 2017).

,

.

(xenical)

,

,

(sibutramine)

(Jun et al., 2004).

김서영 1,2 ·오재영 2,3 ·김은아 4 ·허수진 4 ·김길남 1 ·전유진 2 *

Inhibition of Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes by Different En- zymatic Hydrolysates of Dried Red Sea Cucumber Stichopus japonicus

1,2

2,3

4

4

1

2

Keywords: Lipid accumulation, Adipocyte, Red sea cucumber, Far-infrared ray drying, Enzymatic hydrolysis

*Corresponding author: Tel: +82. 61. 380. 8668 Fax: +82. 64. 754. 3493 E-mail address: [email protected]

Received 19 May 2020; Revised 10 June 2020; Accepted 9 September 2020 저자 직위: 김서영(박사후연구원), 오재영(연구사), 김은아(선임연구원), 허수진 (책임연구원), 김길남(책임연구원), 전유진(교수)

https://doi.org/10.5657/KFAS.2020.0707

Korean J Fish Aquat Sci 53(5), 707-716, October 2020

.

(Kim et al., 2017).

insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-methylxantine

(IBMX)

(Kim et al., 2017).

,

.

.

,

.

(Ko et al., 2013).

,

,

(Ko et al.,

2012; Ko et al., 2013; Ko and Jeon, 2015; Kim et al., 2016;

Kim et al., 2019).

Park et al. (2011)

matrix metalloproteinase (MMP)

,

MMP-1

, collagenase-1

Leu-Asp-Val-Leu-Glu-Val-Phe

.

, Ko et al. (2012)

(tissue)

Ala-His-Ile-Ile-Ile

renin-angio- tensin

Angiotensin-converting enzyme

(ACE)

.

Val-Cys-Ser-Val (VCSV)

Cys-Ala- Ala-Pro (CAAP)

1,1-diphenyl-2-picrylhydrzayl (DPPH)

(Ko et al., 2013).

(Stichopus japonicas)

,

(Jeon et al., 2018).

,

(red sea cucumber)

(Ding et al., 2018).

,

,

,

,

,

(Liu et

al., 2012; Park et al., 2012; Jeon et al., 2017; Ding et al., 2018;

김서영 ^1,2 ·오재영 ^2,3 ·김은아 ⁴ ·허수진 ⁴ ·김길남 ¹ ·전유진 ² *

^1,2

^2,3

⁴

⁴

¹

²