Development of the Standard Analytical Methods for Ginkgo biloba Leaf Extract

39(3) : 218 222 (2008)

218

은행엽엑스 제제의 기준 및 시험법과 규격 설정

김승현¹·김대현¹·박진호¹·오미현²·조창희²·백주현²·조정희²·김태범³·이기용³·김영중³·성상현^3,

*

1㈜엘컴사이언스생명과학연구소

,

^{2식품의약품안전청생약평가부생약제제과}

,

^{3서울대학교약학대학}

Development of the Standard Analytical Methods for Ginkgo biloba Leaf Extract

Seung Hyun Kim

¹

, Dae Hyun Kim

¹

, Jin-Ho Park

¹

, Mi Hyune Oh

²

, Chang Hee Cho

²

, Ju Hyun Baek

²

, Jung Hee Cho

²

, Tae Bum Kim

³

, Ki Yong Lee

³

, Young Choong Kim

³

and Sang Hyun Sung

^3,

^*

1

Institute for Life Science, Elcom Science Co. Ltd., Seoul 151-742, Korea

2

Department of Herbal Medicines Evaluation, Division of Herbal Medicinal Products, Korea Food & Drug Administration, Seoul 122-704, Korea

3

College of Pharmacy, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea

Abstrac

t

⁻

This study was carried out to establish standard analytical methods for Ginkgo biloba leaf extract. Ginkgo fla- vonoids, terpene lactones, ginkgolic acids were employed as reference compounds for analytical method. Analytical method of US Pharmacopoeia was adopted for flavonoids and terpene lactones, and a new method was developed for ginkgolic acids.

Analytical methods established in this study could be applied to a reasonable and unified quality control of G. biloba leaf extract.

Keywords −

Ginkgo biloba leaf extract, standard analytical method

은행나무

(

Ginkgo biloba

)

^{의잎은행엽은혈관및혈류장}

애

,

^{노인성치매의치료}

,

^{뇌기능장애예방}

,

^{집중력강화}

,

^항염

증

,

^{항알러지등에가장널리사용되고있는생약중하나}

이다

.

^{1-2) 은행엽엑스의대표적인성분에는}

ginkgo flavone glycosides, terpene lactones, proanthocyanidine, ginkgolic acids

^{등이 있다}

.

^3-4)

Ginkgo flavone glycosides

^와

terpene lactones

^{가유효성분으로간주되며}

, ginkgolic acids

^는알러

지반응을일으키기때문에⁵⁾독일약전등에서는은행엽엑 스중의

ginkgolic acids

^의함량을

5.0 ppm

^{이하로제한하고}

있다

.

^{우리나라에서은행엽엑스제제는단일제및복합제를}

포함하여

376

^{품목이허가되어있을정도로널리사용된다}

.

최근생약에대한관심증가와생약을원료로한제제시장 규모의확대로유럽등지로부터생약제제및생약엑스의수 입이급증하고다양한제제가유통되고있는추세이다

.

^이

에따라혈행개선을목적으로현재국내에서널리사용되 는은행엽엑스또한해외로부터수입이증가하고있지만각

제제업체별로대한약전외의약품등기준

,

^{독일약전등각기}

다른규격을적용하고있다

.

^{기준이다양하고품질관리체}

계가상이하기때문에저품질원료의수입가능성을배제 할수없고규격이비합리적인경우도많아일정한약효또 한기대하기어려운실정이다

.

^{따라서빈용되고있는은행}

엽엑스의원료의약품에대한합리적이고효율적인통일된 규격이필요한상황이다

.

^{이에본연구에서는다양한은행}

엽엑스를확보한후규격비교를통하여이에대한가장합 리적이고타당한규격을설정하여통일된기준을마련함으 로써은행엽제제의약효를기대함과동시에안정적인품질 관리를돕는데목적을두었다

.

재료 및 방법

실험재료 −본연구에사용한은행엽엑스는국내에유통 되고최종의약품에서실제사용되는원료의약품을각제 조사로부터확보하여사용하였다

.

시약 및 기기 −

Ginkgo flavonoid

^표준품인

quercetin, kaempferol, isorhamnetin

^과

terpene lactone

^표준품인

*교신저자(E-mail):[email protected] (FAX):82-2-877-78594

bilobalide, ginkgolide A, B, C

^는

Sigma

^사

(

^미국

)

^를사용하

였으며

ginkgolic acid

^는

Schwabe

^사

(

^독일

)

^{로부터제공받았}

다

. HPLC

^{분석을 위한 용매는}

Samchun chemical

^사의

HPLC

^{급용매를사용하였고그외시료추출과분석을위}

한시약은분석용특급또는

1

^{급시약을사용하였다}

. HPLC system

^은

Rheodyne (

^미국

)

^의

injector-ASI-100 automated sampler injector, Dionex (

^독일

)

^의

photodiode array detector (UVD 340U)

^및

pump-P680 (Dionex,

^미국

)

^{으로구성되었}

다

. Evaporative Light Scattering Detector

^는

Polymer Laboratories (

^미국

)

^의

PL-ELS2100

^{을사용하였다}

.

Ginkgo flavonoid의 각 규격에 따른 비교 및 검액과 표 준액의 조제 −

KPC (Korean Pharmaceutical Codex), DAB (Deutsches Arzneibuch)

^및

USP (United States Pharmacopoeia)

의각약전에따른방법을이용하여규격을비교하였다

.

^6-8)

각약전에따른분석방법은

Table I

^{에나타내었다}

.

^은행엽

엑스와

ginkgo flavonoid

^{의검액및표준액의조제는각약}

전규격에따라시행하였다

. KPC

^{방법의검액은시료}

0.15 g

을메탄올

40 mL

^{에녹이고메탄올을추가하여}

50 mL

^로맞

춘뒤여과한후여액

10 mL

^{를뚜껑있는갈색용기에넣고}

1.5 mol/L

^염산

10 mL

^{를넣어제조하였다}

. 95

^o

C

^에서

1

^시간

reflux

^{후냉각하고메탄올로}

20 mL

^{되게하여검액으로하}

였다

.

^표준액은

quercetin, kaempferol

^및

isorhamnetin

^각각

5 mg

^을메탄올

50 mL

^{에녹여사용하였다}

. DAB

^방법의검

액은시료

200 mg

^을

50 mL

^{메스플라스크에넣고메탄올}

20 mL

^로녹인후

,

^묽은염산

15 mL

^와증류수

5 mL

^를넣고

메탄올로

50 mL

^{가되게한후이용액}

10 mL

^를

10 mL

^갈

색유리병에넣고부틸탄성고무막과알루미늄덮개로밀봉하 여

25

^{분동안중탕용기속에서가열하고}

20

^o

C

^{로냉각시켜}

사용하였다

.

^표준액은

quercetin

^표준품

10 mg

^{을 메탄올}

20 mL

^{에녹이고묽은염산}

15 mL

^와증류수

5 mL

^를넣고

메탄올로

50 mL

^{가되게하였다}

. USP

^{방법의검액은시료}

0.3 g

^{을환류장치가있는}

250 mL

^{플라스크에넣고추출용}

매

(

^알콜

:

^증류수

:

^염산

= 50:20:8) 78 mL

^{를넣어열탕수조에}

서

135

^분간

reflux

^{한후식혀서증류수로}

100 mL

^가되도

록 맞추어사용하였다

.

^표준액은

quercetin 0.125 mg/mL, kaempferol 0.125 mg/mL, isorhamnetin 0.03 mg/mL

^의농도

로제조하여사용하였다

.

Terpene lactone의 각 규격에 따른 비교 및 검액과 표 준액의 조제 −각약전및분석법에따른방법은

Table II

와같이나타내었다

.

^{은행엽엑스}

terpene lactone

^의검액및

표준액의조제는

DAB, USP

^{규격과이두가지분석방법}

을기본으로하여변형된방법을적용하였다

.

^9-13)

DAB

^방

법에서는

25 mL

^{비커에시료}

120 mg

^{을넣고인산염완충액}

(pH 5.8) 10 mL

^{을넣고녹였다}

.

^{이를인산염완충액}

(pH 5.8) 5 mL

^로

2

^회씻은

15g

^{규조토여과보조제로채워진}

0.15×30 mm

의크로마토그래프용관에충진하였다

. 15

^분방치후

ethyl acetate 100 mL

^{로 추출하여 이 추출액을 수욕상}

(4 kPa, 50

^o

C)

^{에서증발농축하고잔류물을이동상}

2.5 mL

^에녹여검

액으로사용하였다

.

^표준액은

benzyl alcohol 30 mg

^을이동

상에녹여

100 mL

^{가되게하였다}

. USP

^{방법에서는 시료}

120 mg

^{을뚜껑이있는유리병에넣고용매}

(

^메탄올

:

^증류수

= 9:1) 10 mL

^{를넣어녹이고이것을밀봉해서}

90

^o

C

^에서

30

^분

간가열한후혼합하였다

.

^이를다시

30

^{분간가열한후실}

온에서냉각시켜검액으로사용하였다

.

^표준액은

bilobalide, ginkgolide A, B

^및

C

^{를 메탄올에녹여각각}

0.5, 1, 2, 4, 8 mg/mL

^{의농도로만들어사용하였다}

. USP

^와

DAB

^방법에

기초하여새로운

HPLC

^{분석법을개발하여앞의두방법과}

비교하였다

.

^{표준액과검액은일반적인}

HPLC

^{분석용시료}

조제방법에따라일정량을정량하여메탄올로녹인후희 석하고여과하여사용하였다

.

Ginkgolic acid의 각 규격에 따른 비교 및 검액과 표준 액의 조제−각약전에따른분석방법은

Table III

^에나타

내었다

.

^{은행엽엑스와}

ginkgolic acid

^{의검액및표준액의조}

제는

DAB, USP

^{규격과이두가지규격에기초하여본연}

구를통해개발된방법을적용하였다

.

^14-16)

DAB

^{방법에서는}

Table I.

HPLC conditions for ginkgo flavonoid HPLC

condition KPC DAB USP

Column 4

×

150~300 mm,

C18 4

×

125 mm,

C18 4.6

×

250 mm, Mobile C18

phase

^a)

MeOH:H

2

O:

acetic acid = 50:

50:1

2-propanol:AcCN:

citric acid (6g/

L) = 5:47:100

MeOH:H

2

O:

phosphoric acd =100:100:1 Flow rate 1.0 mL/min 1.0 mL/min 1.5 mL/min Detector UV 365 nm UV 370 nm UV 270 nm Injection

volume 20

^µ

L 10

^µ

L 20

^µ

L

a)MeOH: 메탄올; AcCN: 아세토니트릴

Table II.

HPLC conditions for terpene lactone HPLC

condition DAB USP Modified

method Column 4

×

250 mm,

C18 4.6

×

250 mm,

C18 4.6

×

250 mm, Moblie C18

phase

^a)

THF:MeOH:

H

2

O = 10:20:75

A:H

2

O, B:MeOH gradient

A:H

2

O, B:MeOH gradient Flow rate 1.0 mL/min 1.0 mL/min 1.0 mL/min

Detector RID ELSD ELSD

Injection

volume 100

µ

L 15

µ

L 8

µ

L

a)THF: tetrahydrofuran; MeOH: 메탄올

시료

1 g

^를

25 mL

^{비커에넣고}

,

^증류수

10 mL

^를넣고

5

^분

간흔들어섞었다

.

^{이것을분액깔대기에넣고비커를}

5 mL

로씻은물도같이분액깔대기에넣어그혼합액을

ethyl

acetate 10 mL

^로

4

^{회추출하였다}

.

^{이것을각각증류수}

5 mL

로

2

^{회씻고 물층은버리고여과한후수욕상에서증발농}

축하고이를메탄올

2 mL

^에녹였다

.

^표준액은

ginkgolic acid

표준품

6.25 mg

^을메탄올

50 mL

^{에녹이고이액}

1 mL

^를취

해메탄올로

50 mL

^{가되게하여사용하였다}

. USP

^방법에

서는시료

0.5 g

^을

10 mL

^{용량플라스크에넣고}

8 mL

^메탄

올로녹인후물로

10 mL

^{가되게하여검액으로사용하였}

다

.

^표준액은

ginkgolic acid

^{를메탄올로녹여}

0.25

^µ

g/mL

농도로제조하였다

.

^{새로운방법에서는시료}

1 g

^을

50%

^에

탄올수용액

50 mL

^에녹인후

chloroform 50 mL

^로

1

^회추

출하여수용액층과유기층을분리하고수용액층에에탄올

10 mL

^를가한후

chloroform 50 mL

^{로재차추출하였다}

.

^수

용액층은버리고유기층용액을혼합한후농축하고남은 농축잔사를메탄올

5 mL

^{에녹여검액으로사용하였다}

.

^표

준액은

ginkgolic acid

^표준품

6.25 mg

^{을달아각각메탄올}

50 mL

^{에녹이고이액}

1 mL

^{를취해메탄올로}

50 mL

^가되

게하여사용하였다

.

결과 및 고찰

각 기준 및 시험법에 따른 ginkgo flavonoid 분석 결과 −

KPC

^{방법의경우}

HPLC

^{크로마토그램상에서피크의분}

리가양호하고

, quercetin, kaempferol

^및

isorhamnetin

^세가

지표준품을사용하여시료에서도이세가지화합물을확 인할수있었다

.

^{시료전처리방법이비교적간단하지만실}

험결과제시된염산농도와가수분해시간으로는충분히 당이가수분해되지않아기준치

(22.0~27.0%)

^{보다모든분석}

시료의함량이낮은것으로나타났다

. DAB

^{방법은시료분석}

법이간단하고분석결과각시료의함량이기준에적합하였 다

.

^{하지만일반적으로사용되는컬럼이아닌}

4×125mm

^컬

럼을사용하며

,

^{표준품으로}

quercetin

^{만사용하고}

,

^시료중

kaempferol

^과

isorhamnetin

^이

HPLC

^{크로마토그램상에서하}

나의피크로중첩되어나타나므로각각의

flavonoid

^를정확

하게확인할수없었다

. USP

^{방법에서는전처리시간이오}

래걸리지만

HPLC

^{크로마토그램상에서시료중}

quercetin, kaempferol

^및

isorhamnetin

^{세가지물질의피크가뚜렷이분}

리되었고분석결과함량이기준에적합한것으로나타났다

.

^{각기준및시험법에따른함량평가결과와}

HPLC

^크로마

토그램은각각

Table IV

^와

Fig. 1

^{에나타내었다}

.

Table III.

HPLC conditions for ginkgolic acids HPLC

condition DAB USP Modified

method Column 4

×

125 mm, C18 4.6

×

50 mm,

C8 4.6

×

250 mm, Moblie C18

phase

^a)

A:85%

phosphoric acid solution:AcCN:

H

2

O = 0.3:30:70 B:85%

phosphoric acid solution:AcCN=

0.3:100

A:0.01%

solution of phosphoric acid

in H

2

O B:0.01%

solution of phosphoric acid

in AcCN gradient

MeOH:H

2

O:85

% phosphoric acid solution

= 910:80:5

Flow rate 1.2 mL/min 1.0 mL/min 1.5 mL/min Detector UV 310 nm UV 210 nm UV 210 nm Injection

volume 200

µ

L 100

µ

L 50

µ

L

a)MeOH: 메탄올; AcCN: 아세토니트릴

Table IV.

Ginkgo flavonoids contents estimated by each method

Sample DAB (%) KPC (%) USP (%) Ginkgo flavonoids A 26.68 12.94 26.76

B 24.56 13.72 25.23

C 24.35 10.81 24.13

Fig. 1.

Ginkgo flavonoids HPLC chromatogram of samples of

KPC method (A), DAB method (B) and USP method (C)

각 기준 및 시험법에 따른 terpene lactone 분석 결과 −

USP

^{방법에서는}

bilobalide, ginkgolide A, B

^및

C

^의네

가지표준품각각에대하여검량선을작성하였다

.

^분석결

과 각 시료의 총

terpene lactone

^{의 함량과}

bilobalide, ginkgolide A, B

^및

C

^{각각의 함량이 기준}

(

^총

terpene lactone 5.4~12.0%, bilobalide 2.6~5.8%, ginkgolide A, B

및

C 2.8~6.2%)

^{에적합하였고}

,

^{시료전처리도비교적간단}

하였다

.

^또한

ELSD

^{검출기를사용하기때문에}

DAB

^방법

에서사용하는

RID

^{에비해검출기의감도}

,

^{재현성및편의}

성이좋을뿐아니라피크분리도도양호하였다

. DAB

^방

법에서는시료를작은오픈컬럼을사용하여추출하기때문 에전처리가복잡하고시간이많이소요되었고

RID

^검출기

를사용하기때문에감도와재현성이좋지않았다

.

^또한함

량기준

(

^총

terpene lactone 5.0~7.0%, bilobalide 2.6~3.2%, ginkgolide A, B

^및

C 2.8~3.4%)

^{이매우좁아기준에적합}

한결과를얻기가어려웠다

.

^{뿐만아니라}

benzyl alcohol

^을

표준품으로사용하기때문에은행엽

terpene lactone

^의실제

표준품인

bilobalide, ginkgolide A, B

^및

C

^{을구입을통해}

쉽게확보할수있는현재의상황과맞지않으며분리도도 좋지않은결과를보였다

. Fig. 2

^는

USP

^와

DAB

^방법에따

른

HPLC

^{크로마토그램을나타낸것이다}

. USP

^{방법에서좋}

은분리및분석능을보인

HPLC-ELSD

^{분석법을활용하고}

시료전처리를보다간소화하기위해일반적인

HPLC

^분석

용시료조제법을적용하여새로운분석법을개발하고자하

였다

.

^{그러나이분석법의경우}

USP

^{방법에서보다분리능}

이떨어지고각각의시료에대해일관성있는함량결과를 얻기어려웠기때문에

terpene lactone

^{의분석에는}

USP

^방

법이더적합한것으로판단된다

.

각 기준 및 시험법에 따른 ginkgolic acid 분석 결과−

DAB

^{방법에서는분석용 시료조제 과정이복잡하고}

ginkgolic acid

^피크가

80

^{분이후에검출되어검출시간이지}

나치게길며

HPLC

^{크로마토그램상에서두피크만확인되}

었다

. USP

^{방법에서는 일반적으로 사용되지 않는}

4.6×50 mm, C8

^{컬럼을사용해야하고표준품은}

HPLC

^크

로마토그램상에서두개의피크로확인되지만시료에서는 이들이확인되지않았다

.

^{때문에이두가지방법을기초로}

일반적으로많이사용되는

4.6×250 mm, C18

^{컬럼을이용}

하여새로운분석법을개발하고자하였다

.

^{새로개발된분}

석법에서는분리능을높이기위해인산을포함한이동상을 사용하였고검액중

ginkgolic acid

^{의함량을높이기위해}

chloroform

^{으로추출하는전처리과정을거치도록하였다}

.

비교적복잡하지않은전처리방법및상용컬럼을사용하

기때문에분석이용이할뿐만아니라분석결과

HPLC

^크

로마토그램에서

ginkgolic acid

^{피크 분리능이 개선되어}

Fig. 2.

HPLC chromatograms of samples analyzed by USP method (A) and DAB method (B), respectively

Fig. 3.

Ginkgolic acids HPLC chromatogram of standards of

DAB method (A), USP method (B), new method (C) and a

sample of new method (D)

ginkgolic acid ,

^{및을모두확인할수있었다}

.

^{시료중에서}

도세가지표준품이모두확인되어은행엽엑스

ginkgolic acid

^{의분석법으로}

USP

^나

DAB

^{방법의문제점을개선할수}

있었다

. (Fig. 3)

결 론

은행엽엑스중

ginkgo flavonoid

^{분석을위해서는시료의}

HPLC

^{크로마토그램에서}

quercetin, kaempferol

^및

isorha-

mnetin

^{이뚜렷이분리되고적합한함량기준을제시한}

USP

방법이적절한것으로판단되었다

. Terpene lactone

^의경우

함량기준에적절하고검출기의감도

,

^{재현성및편의성이}

좋으며분리도도양호한

USP

^{방법이가장적합한것으로}

나타났다

. Ginkgolic acid

^{의분석을위해서는기존의}

USP

및

DAB

^{방법을개선하여새로운분석법을개발하였다}

.

^이

방법을통해복잡한전처리과정중생길수있는오차가능 성을줄이고상용컬럼을사용하여분석이용이하도록하 였고

ginkgolic acid

^{의분리능및분석능을개선할수있었}

다

.

^{이상의결과는}

KPC

^{에반영되어은행엽엑스시험법이}

수정되었다

.

^{수정된내용에따른규격은총}

ginkgo flavonoid

배당체

(quercetine

^배당체

, kaempferol

^{배당체 및}

isorha- mnetin

^{배당체의 총량으로서}

,

^{평균분자량}

756.7)

^로서

22.0~27.0%,

^총

terpene lactone [bilobalide (C

15

H

18

O

8

), ginkgolide A (C

20

H

24

O

9

), B (C

20

H

24

O

10

)

^및

C (C

20

H

24

O

11

)

^{의총량으로}

서

]

^은

5.4~12.0%

^{를함유하여야하며}

,

^총

terpene lactone

^의

양중에서

bilobalide (C

15

H

18

O

8

)

^는

2.6~5.8%, ginkgolide A (C

20

H

24

O

9

), B (C

20

H

24

O

10

)

^및

C (C

20

H

24

O

11

)

^{의 총량은}

2.8~6.2%

^{를각각함유한다}

.

^{본연구를통해확립된은행엽}

엑스의분석법및함량규격은국내에서사용되는은행엽엑 스원료및제제에대한기준및시험법및규격으로활용됨 으로써이들의효율적인품질관리에기여할것으로기대된다

.

사 사

본연구는

2007

^{년도식품의약품안전청용역연구개발과제}

의연구개발비지원

(07092

^생약안

304)

^{에의해수행되었으}

며이에감사드립니다

.

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(

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(2008년 7월 14일 접수)