The Effects of Low-intensity Ultrasound on TGF-$\beta$1 Expression and Healing of Rat Femur Fracture

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남기원

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동신대학교 보건복지대학 물리치료학과

The Effects of Low-intensity Ultrasound on TGF-β1 Expression and Healing of Rat Femur Fracture

Ki‐Won Nam, PT, PhD

Department of Physical Therapy, College of Health and welfare, Dongshin University

Purpose: The purpose of this study was to investigate the effects of low intensity pulsed ultrasound on TGF-β1 expression and healing of rat femur penetrating fractures.

Methods: Rats were anesthetized with ketamine and xylazine. Using aseptic technique, we exposed the lateral right femoral diaphysis with removal of the periosteum. We made one hole along its long axis with an electrically-driven 1.8 mm diameter drill bit. Postoperatively, rats were divided into two groups (a control group, n=15; an experimental group, n=15). The experimental group was treated with low intensity pulsed ultrasound (pulse rate: 1:4, 0.5 W/cm², 10 minutes, 1 time per day) for 3 weeks. The control group was treated with sham ultrasound (with the US unit turned off).

Results: The experimental group achieved more callus formation and TGF-β1 expression than the control group at the 7^th, 14^th and 21^st days after low intensity pulsed ultrasound treatment.

Conclusion: This study suggests that low intensity pulsed ultrasound facilitates bone fracture repair, possibly via increased TGF-β1 expression.

Keywords: Fracture, Ultrasound, TGF-β, Immunohistochemistry, Callus 논문접수일: 2009년 10월 26일

수정접수일: 2009년 11월 21일 게재승인일: 2009년 12월 8일

교신저자: 남기원, [email protected]

TGF- β 1의 발현에 미치는 영향

The Journal Korean Society of Physical Therapy

I. 서론

산업의 발달과 경제 성장으로 인한 여가 및 스포츠 활동의 증 가,

수명 연장으로 인한 노령 및 고령 인구 증가,

차량 증가 로 인한 교통사고의 증가 ,

미용 목적으로 뼈의 길이를 늘이는 골연장술을 시행하는 횟수의 증가

등으로 인해 골절환자의 숫 자는 늘어가고 있으며 , 물리치료 분야에서도 골절 환자 치료에 대한 관심이 증가하고 있다 .

골절이란 뼈의 연속성이 완전 혹은 불완전하게 소실되거나 선상의 변형을 일으킨 상태로써 , 손상의 정도, 골절 형태, 혈관 손상 유무 , 감염 여부, 골의 결합구조, 연령, 호르몬과 영양상 태, 유전적 요인 등 다양한 요인들에 의해 영향을 받을 수 있으

며 ,

골절로 인해 사회적 활동을 제약받고 독립적인 삶을 위협 받을 수 있기 때문에

빠른 치료가 필요하다. 골절 치료에 있어 무엇보다 중요한 것은 빠른 골유합으로 조기 골절 치유는 골유 합 후 재활에 매우 중요하며 골절 후 합병증의 잠재성을 최소 화하기 위해 골절 치유속도를 촉진해야 한다 .

따라서 골절치유 속도를 증가시킬 수 있는 치료적 중재에 대한 연구가 활발히 이루어 져야 할 것이다 .

물리치료 임상에서 흔하게 사용되는 치료 도구들 중 치료적

초음파는 심부조직 온도상승과 연부조직의 신장력 증가 ,

진통

작용 ,

신경전도속도 증가,

상처치유 촉진

등의 효과로 다양

한 질환들에 광범위하게 사용되고 있는 치료 기구이다 . 치료적

초음파 중 특히 저강도 맥동초음파는 골유합의 시간을 단축시

키고 , 가골의 양을 증가시킨다.

또한 저강도 맥동초음파는 유 전자를 조절하고 ,

가골 형성과 성장을 촉진하며,

혈류량을 증진시키고 세포막의 투과성을 직접적으로 증가시켜

골절치유 를 촉진하며 , 많은 환자에게서 골절 후 지연유합이나 불유합을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있다.

Lee

는 정형외과에서 불유합으로 판정받은 환자들을 대상으로 저강도 레이저와 초음 파를 지속적으로 실시한 결과 새롭게 가골이 형성됨을 확인하 였다 . 하지만 이러한 연구들은 물리치료 분야에서 사용하는 치 료기구를 활용한 골절 치유과정 중 세포 수준에서 일어나는 기 전에 대한 해석은 미흡하였다 .

TGF-

는 세포주기와 세포간질의 생산을 조절하여 세포에 중요한 기능을 담당하는 성장인자로

태아의 생성, 골 및 연골 의 분화 , 피부 반흔조직의 생성 등에 관여하며, 골절 치유과정 에서 연골세포와 골아세포에 의해 합성된다고 알려져 있다 .

특히 TGF-

는 뼈에 가장 많이 존재하는 성장인자로써 신생골 형성을 유도하여 뼈 형성과 재생에 중요한 역할을 하며

골 및 연골의 분화 과정에서 골아 세포의 이동을 조절하고 , 증식을 조 절하며 , 세포 간질 단백질의 생산과 분해를 조절하여 골절치유 에 중요한 역할을 한다 .

TGF-

가 골 및 연골에 미치는 효과 는 1980년대 후반부터 알려지기 시작하였는데, 1990년 Joyce 등

의 연구에 의해 정제된 TGF-

를 실험 동물의 골막 하부에 직접 주입하여 관찰한 결과 , 연골내골화가 시작되어 연골이 생 성됨을 관찰하여 TGF-

가 골형성에 중요한 영향을 미치는 성 장인자이며 , TGF-

가 골절치유에 도움이 됨을 입증하였다 .

따라서 본 연구에서는 물리치료 임상에서 흔히 사용되고 있 는 저강도 맥동초음파를 이용하여 골절 치유 과정에서 초음파 가 가골 형성과 골 성장인자인 TGF-

1의 발현에 미치는 영향 을 살펴봄으로써 세포적 수준의 작용기전을 해석하고 , 물리치 료 임상에서 치료적 초음파의 골절 치유 효과를 조직학적으로 증명하고자 한다 .

II. 연구방법

1. 실험동물

실험에 사용된 동물은 생후 8

10주, 체중 250

300 g의 건강 한 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 사용하였다. 실험동물은 골 절 유발 후 무작위로 대조군(n=15)과 실험군(n=15)으로 나누 었으며 , 각 군은 7일, 14일, 21일 군으로 각각 분류하였다. 실 험군은 골절 유발 후 저강도 맥동초음파를 골절 부위에 적용하 였고 , 대조군은 골절 유발 후 전원을 끈 상태에서 초음파 도자 만을 적용하였다 .

2. 실험방법 1) 골절유발

관통골절은 Chiba 등

의 방법을 변형하여 유발하였다 . 염산케 타민 (Ketamine HCL, 유한양행, 한국)과 럼푼(Rompun, 바이 엘코리아 , 한국) 주사액을 1:1의 비율로 혼합하여 만든 전신마 취제를 복강주사 (0.4 mg/kg)하여 실험동물을 전신 마취시킨 후 , 골절 유발을 위해 좌측 대퇴부를 삭모한 다음, 피부와 근육 을 절개한 뒤 , 휴대용 전동 드릴(Strong 207, Saeshin Co, 한 국 )을 이용하여 대퇴골 간부에 직경 1.8 mm의 관통골절을 유 발하였다 . 피질골에서 골수강까지 관통시켰으며, 반대쪽 피질골 은 관통하지 않고 한쪽 피질골 만을 관통시켰다 . 골절 유발 후 근육 , 피부 순서로 봉합사를 이용하여 5 mm 간격으로 단순 결 찰 봉합하였고 , 24시간 동안 안정을 취한 후 치료적 중재를 실 시하였다 .

2) 초음파 치료

저강도 맥동초음파 적용은 Sonoplus 591 (Enraf, 독일)을 이용 하여 골절유발을 위해 절개한 대퇴부의 반대쪽 피부에 3MHz 도자를 이용하여 1.5 cm

의 조사 면적에 맥동비 1:4, 0.5 W/cm

의 강도로 1일 1회, 10분간, 3주 동안 실시하였다. 초음 파용 전도겔 (Soung Heong Co, 한국)을 이용하여 초음파가 심 부조직에 효과적으로 전달될 수 있도록 하였다 .

3) 조직절편 제작

실험적 중재 종료 후 실험동물을 희생시켰으며 , 골절을 유발한 대퇴골을 채취하여 10% Paraformaldhyde로 24시간 고정을 실시하였다 . 고정 후 탈회용액(5% nitric acid)에서 약 5일간 탈회를 실시하였다 . 탈회가 끝난 대퇴골은 파라핀 블록을 제작 하기 위해 Tissue process (Model No. 4640B, Sakura, 일본) 기기를 이용하여 탈수 , 청명 과정을 14시간 처리하였으며, 파라 핀 블록 제작은 Embedding Console System (TISSUE-TEK, Sakura, 일본)을 사용하였다. 제작된 파라핀 블록을 회전식 미 세박절기 (Finesse315, Thermo Shandon Co, 일본)를 사용하 여 5

m 두께로 박절하여 슬라이드를 제작하였으며, 40℃의 Slide Warmer (C-SLS, Chang Shin Scientific Co, 한국)에서 24시간 건조시킨 후 Hematoxylin & Eosin 염색과 TGF-

1에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다 .

4) Hematoxylin & Eosin 염색

제작된 조직절편을 이용하여 골절 부위의 일반적인 조직형태를

관찰하기 위해 통상적인 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하

였다 . Xylene과 알코올을 이용하여 탈파라핀과 함수 과정을 거

친 후 흐르는 물에 3분간 수세하였다. Hematoxylin 용액에 5

분간 핵 염색 후 다시 수세하여 Eosin 용액으로 3분간 세포질 염색을 실시하였으며 , 알코올 농도 순으로 탈수과정을 거친 후 Xylene을 이용한 청명과정을 거친 다음, 봉입을 실시하였다. 봉 입한 조직을 광학현미경 (Olympus BX50, Olympus Optical Co, 일본)을 이용해 현미경에 부착된 CCD카메라(Foculus F2, 독일 )를 컴퓨터에 연결하여 각 군의 조직들을 촬영하였으며, 대 퇴골 골절 후 치유과정을 살펴보기 위해 골절 부위에서 형성된 가골 (callus)을 관찰하였다.

5) TGF-

1 면역조직화학염색

제작된 조직절편을 이용하여 대퇴골 골절 부위에서 치유과정 중 발현되는 TGF-

1의 면역반응을 관찰하기 위해 면역조직화 학법을 실시하였다. Xylene과 알코올을 사용하여 탈파라핀과 함수 과정을 거쳤으며 , 내인성 과산화효소를 억제하기 위해 0.3% 과산화수소가 포함된 증류수에 30분간 침수시킨 후 증류 수로 10분간 2회 수세하였다. 1M PBS (Phosphate Buffered Saline)로 5분간 세척 후 1차 항체(polyclonal anti-TGF-

1, 1:200, Santa Cruz Biotechnology Inc, 미국)를 실온에서 12 시간 반응시킨 후 1M PBS로 5분씩 각 3회 수세하였다. 2차 항체 (goat anti-mouse IgG, 1:25, Sigma, 미국)를 실온에서 60 분간 반응시킨 후 1M PBS로 5분씩 각 3회 수세하였으며, ABC-kit (avidine-biotin peroxidase complex, Vector, 미국)을 실온에서 90분간 반응시켰다. 1M PBS로 5분씩 3회 수세 후 발색제로 0.025% 3,3-diaminobenzidine (DAB)을 사용하여 5 분간 반응시켰다. 각 과정이 끝난 후 탈수와 봉입 과정을 거쳤 고 각 군의 대퇴골 골절 후 골절치유 부위에서 갈색으로 반응 하는 TGF-

1의 발현 정도를 관찰하기 위해 광학현미경 (Olympus BX50, Olympus Optical Co, 일본)이 사용되었으 며, 현미경에 부착된 CCD카메라(Foculus F2, 독일)를 컴퓨터 에 연결하여 각 군의 조직들을 촬영하여 TGF-

1에 대한 면역 반응을 관찰하였다.

III. 결과

1. 골절 부위에 대한 Hematoxylin & Eosin 염색

골절 부위에 저강도 맥동초음파를 적용하여 일반적인 조직 치 유 상태를 관찰하기 위해 초음파 적용 7일, 14일 및 21일째에 각 군에서 채취된 대퇴골을 이용해 제작된 조직절편으로 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하여 골절 부위에서 새롭게 형성된 가골을 관찰한 결과 , 모든 군에서 21일째에 가골 형성 이 가장 많이 증가되었음을 관찰할 수 있었으며, 대조군의 경우 7일 째는 일부 골수에서 미약하게 가골이 형성된 것을 관찰할

수 있었고 시간이 경과함에 따라 가골의 양이 증가됨을 관찰할 수 있었다 . 대조군에 비해 실험군들에서는 7일째부터 현저히 증가된 가골을 관찰할 수 있었고 , 21일째에는 가골이 가장 많 이 형성되어 골절 치유가 가장 많이 일어나고 있음을 관찰할 수 있었다 (Figure 1).

Figure 1. Histological finding of bone healing (H

& E stain, A: control group 7 days, B: control group 14 days, C: control group 21 days, D: low intensity pulsed ultrasound group 7 days, E: low intensity pulsed ultrasound group 14 days, F: low intensity pulsed ultrasound group 21 days arrow:

callus, ×100)

2. TGF-

에 대한 면역조직화학염색

치료적 중재가 끝난 후 7일, 14일 및 21일째에 각 군에서 대퇴 골을 적출하여 조직절편을 제작한 다음 TGF-

1에 대한 면역 조직화학법을 실시하여 시간 경과에 따른 TGF-

1의 발현 양 상을 관찰하였다 .

그 결과 대조군의 경우 , 7일째에서는 일부 가골에서 TGF-

1에 대한 경미한 면역반응을 관찰할 수 있었으며, 21일째에는 좀더 많은 가골에서 TGF-

1에 대한 면역반응을 관찰할 수 있 었다 . 하지만 실험군들에 비해서는 아주 미미한 수준이었다.

각 실험군들에서는 7일째에서도 비교적 많은 양의 면역반

응을 관찰할 수 있었으며 , 시간이 경과함에 따라 TGF-

1에 대

한 면역반응이 증가함을 관찰할 수 있었다 . 특히 초음파를 적용

한 21일 군에서 가장 많은 면역반응을 관찰할 수 있었다 (Figure 2).

Figure 2. Immunoreactivity with the TGF-_β1 antibody (A: control group 7 days, B: control group 14 days, C: control group 21 days, D: low intensity pulsed ultrasound group 7 days, E: low intensity pulsed ultrasound group 14 days, F: low intensity pulsed ultrasound group 21 days, arrow:

immunostained TGF-_β1, ×200)

IV. 고찰

의학적 목적으로 사용되는 치료용 초음파는 강도에 따라서 0.125-3 W/cm

의 저강도와 5 W/cm

이상의 고강도로 분류 할 수 있는데 ,

그 중에서 저강도 초음파는 조직 내의 세포를 기계적으로 자극시킬 수 있는 수단으로 뼈의 생장 , 골절, 근육 조직의 치유 등 손상된 조직의 수복에 효과적이라 알려져 있다 . 또한 물리치료 분야에서 사용되는 저강도 초음파는 의무주기 (duty cycle)에 따라 맥동초음파와 연속초음파로 분류되며, 이 중 맥동초음파는 평균 강도를 감소시켜 시간에 비해 적은 에너 지를 전달하고 , 열 효과가 적으며 기계적 자극을 유발할 목적으 로 사용된다 .

기계적 자극을 통해 골절 치유를 촉진하는 치료기구로는 치 료적 초음파와 맥동전자기장이 있으며 ,

골절 치료에 대한 초

음파의 효과를 연구한 초기의 연구에서는 골절 부위에 초음파 를 적용하여 지연 유합이나 뼈 손상을 유발하기도 했지만 ,

최 근에는 메타분석을 통해 저강도 맥동초음파가 가골의 형성을 촉진한다는 연구들이 확인되고 있으며 ,

미국 FDA (The Food and Drug Administration)에서는 1994년 골절 치료에 저강도 맥동초음파의 사용을 승인했고 , 2000년에는 불유합 골 절에 대해서도 저강도 맥동초음파의 사용을 승인하였다 .

본 연구에서도 흰쥐의 우측 대퇴골에 관통 골절을 유발하여 저강도 맥동초음파를 적용한 결과 대조군에 비해 초음파 적용 군에서 가골이 월등히 많이 형성됨을 관찰할 수 있어 최근의 많은 연구들과 동일한 결과를 얻을 수 있었다 .

골절 부위에 대한 내적 고정과 외적 고정의 기술이 발달하 고 새로운 치료 방법들이 개발되고는 있지만 , 지연 유합과 불유 합은 일상생활로의 복귀를 저해하고 사회경제적 비용을 증가시 키고 있다 .

2009년 Romano 등

은 문헌고찰을 통해 실험동 물과 환자들을 대상으로 지연 유합과 불유합 사례의 70

93%

가 저강도 맥동초음파를 통해 치료 효과를 보았으며 , 경제성, 안정성 , 효율성의 추가적인 이점이 있으나, 뼈의 재생을 촉진하 는 저강도 맥동초음파의 생물리학적 치료과정은 아직 잘 알려 져 있지 않다고 하였다 .

세포의 성장을 도와주는 여러 인자들 중 골 형성에 관여하 는 대표적인 성장인자로는 IGFs (insulin-like growth factors), TGF-

(transforming growth factor-

), bFGF (basic fibroblast growth factor), BMPs (bone morphogenetic proteins), BMP (bone morphogenic protein) 등이 있으며, 이중 TGF-

는 사 람과 동물 골절 모델의 가골에서 발현됨이 확인되었으며 , 골절 치유 과정에서 그 발현이 증가되어 골절 치유의 지표로 사용된 다 .

TGF-

는 TGF-

1, TGF-

2, TGF-

3가 밝혀져 있으며, TGF-

3보다는 TGF-

1, TGF-

2의 작용 기전이 좀 더 많이 밝혀져 있다 .

TGF-

family 중 TGF-

1은 골수간질세포 (bone marrow stromal cell)가 골형성 세포로 분화될 수 있도 록 유도해주는 물질로 골 재흡수와 형성에 관여하며 ,

TGF-

1 mRNA의 발현은 체액의 흐름으로 인해 발생한 전단 응력 (shear stress)에 의해 상향조절된다고 하여

이는 초음파의 기계적 효과를 통해 TGF-

1의 발현을 증가시킬 수 있음을 시 사한다 . Harle 등

이 초음파를 이용해 TGF-

의 발현을 연구 한 결과 , 초음파는 TGF-

1의 발현을 증가시키지만 TGF-

2의 발현에는 비교적 효과적이지 못하다고 하여 , 본 연구에서는 저 강도 맥동초음파 적용 후 새롭게 형성된 가골에서 TGF-

1에 대한 면역반응을 관찰하였다 .

본 연구의 대조군에서도 관통 골절 유발 후 시간이 경과함

에 따라 가골의 양도 증가하였으며 , 가골에서 형성되는 TGF-

β

1의 면역반응도 증가함을 관찰할 수 있었다. 하지만 저강도 맥동초음파를 적용한 실험군에서는 대조군에 비해 초음파 적용 7일 후에도 왕성한 면역반응을 관찰할 수 있었으며, 시간이 경 과함에 따라 면역반응이 증가하여 21일 후에 가장 강한 면역반 응을 관찰할 수 있어 저강도 맥동초음파가 TGF-

1의 발현에 효과적임을 알 수 있었다 . TGF-

가 골절 회복에 미치는 효과 에 대한 in vitro상의 연구에서 Ebisawa 등

은 초음파가 TGF-

의 발현을 증가시켜 미분화 줄기 세포가 연골세포로 분화되도 록 도와준다고 하였으며 , Min 등

은 당뇨병증 골절 흰쥐 모델 에 맥동초음파를 적용하여 초음파 적용 14일 후에 TGF-

1에 대한 가장 강한 면역반응을 보고하였고 , Lee 등

은 실험용 흰 쥐에 횡골절을 유발하여 치료적 중재없이 골절 3일경에 TGF-

의 발현이 골절 주위의 연골내 골화 부위에서 처음으로 보이기 시작하여 2주에 그 발현이 절정에 달하고 그 후에 감소하여 골 절 6주 경에는 소실된다고 하였다. 본 연구에서는 대조군, 실험 군 모두에서 골절 유발 후 3주까지 TGF-

1의 발현이 증가함 을 관찰할 수 있었는데 이는 골막과 피질골이 완전히 소실된 관통 골절의 특성상 좀더 늦게까지 TGF-

1의 발현이 지속된 것이라 생각된다 . 또한 관통 골절 모델에서 3주 이후의 TGF-

1에 대한 발현 양상을 살펴보는 추가적인 연구가 필요할 것으 로 사료된다 .

V. 결론

본 연구는 실험용 흰쥐를 대상으로 대퇴골에 관통 골절을 유발 하여 저강도 맥동초음파의 골절 치유 효과를 관찰하였다 . 그 결 과 저강도 맥동초음파는 골절 부위에서 가골 형성을 촉진하였 으며 , 또한 골절 치유에 중요한 역할을 하는 골 성장인자인 TGF-

1의 발현이 증가됨을 확인할 수 있어 저강도 맥동초음 파는 골절 부위의 가골 형성을 촉진하며, 골 형성 세포로의 분 화를 유도하는 성장인자인 TGF-

1의 발현을 증가시켜 골절 치유에 효과적임을 알 수 있었다 . 따라서 본 연구를 통해 물리 치료 임상에서 골절 환자 치료 시 치료적 초음파를 보다 효율 적으로 활용할 수 있는 계기가 되었으면 하는 바람이며, 추후 TGF-

1의 작용기전에 대한 연구가 더욱 활발히 이루어져야 할 것으로 사료된다.

Author Contributions

Research design: Nam KW Acquisition of data: Nam KW

Analysis and interpretation of data: Nam KW Drafting of the manuscript: Nam KW

Administrative, technical, and material support: Nam KW Research supervision: Nam KW

Acknowledgements

본 연구는 동신대학교 학술연구비에 의하여 연구되었음 .

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